На рубеже 2019–2020 гг. коронавирус SARS-CoV-2, приводящий к развитию COVID-19, несмотря на все принимаемые карантинные меры, быстро распространился сначала в китайских провинциях, а затем и по всему миру. Уже к марту 2020 г., по данным Всемирной организации здравоохранения, коронавирусная инфекция достигла пандемических масштабов.

Согласно литературным данным, «входными воротами» инфекции, вызываемой SARS-CoV-2, являются клетки, экспрессирующие рецепторы ангиотензинпревращающего фермента 2 (АПФ2): эпителий респираторных путей, альвеолоциты, сосудистый эндотелий, эпителий желудочнокишечного тракта, миокард и некоторые отделы ЦНС [1]. Вирус размножается в альвеолоцитах II типа, высвобождая большое количество вирусных частиц. Клетки подвергаются апоптозу, что в свою очередь нарушает процессы легочной вентиляции и перфузии, способствует накоплению жидкости в альвеолах и определяет развитие диффузного альвеолярного повреждения [2].

Результатом совместных исследований ученых многих стран стала успешная разработка вакцин от SARSCoV-2 [3], что при проведении масштабной кампании по вакцинации населения позволит значительно снизить количество случаев тяжелого течения заболевания и летальных исходов. Однако на сегодняшний день остается острым вопрос разработки эффективных и безопасных фармакологических средств предотвращения развития угрожающих жизни человека клинических проявлений COVID-19 [4]. Идет активная разработка инновационных и экономически эффективных терапевтических средств, снижающих риск развития осложнений COVID-19 на основе моноклональных антител [5, 6], а также новых подходов к подавлению «цитокинового шторма» с применением опиоидных пептидов, ингибирующих экспрессию провоспалительных цитокинов иммунными клетками, через подавление транслокации активного димера ядерного фактора каппа В (NF-κB) [7].

Наиболее подходящей и доступной экспериментальной моделью доклинической оценки эффективности фармакологических препаратов в отношении респираторной дисфункции, развивающейся при COVID-19, являются сирийские хомяки [8]. Клинические особенности, вирусная кинетика, гистопатологические изменения и иммунные реакции у этих животных, инфицированных SARS-CoV-2, очень близки к описанным у пациентов с коронавирусной инфекцией [9]. Так, выраженные клинические признаки COVID–19 у животных наблюдали в течение первой недели после заражения вирусом. Учащенное дыхание и потерю массы тела сопровождали гистопатологические изменения от начальной экссудативной фазы диффузного повреждения альвеол с обширным апоптозом до более поздней пролиферативной фазы репарации тканей. Отмечена также атрофия селезенки, вероятно, связанная с выраженной активацией цитокинов [10].

Поскольку основными причинами летальных исходов при COVID-19 являются отек легких, пневмония и дыхательная недостаточность вследствие поражения вирусом альвеолярных клеток в респираторных отделах легкого, представляется целесообразным доклиническое изучение препарата на основе аминокислотно-пептидного комплекса (АПК), для которого в пилотном исследовании на модели изолированных легких крысы (ex vivo) показано противоотечное действие. Протекторный эффект выражался в меньшей (в 1,5 раза) скорости нарастания массы изолированного органокомплекса легкие-сердце в опытной группе по сравнению с контролем (р < 0,05) в течение перфузии (90 мин), что отражает скорость и степень развития отека легких [11].

Таким образом, целью данной работы является проведение оценки эффективности лечебного и лечебнопрофилактического применения экспериментального АПК в модели COVID–19, реализованной на самцах сирийских хомяков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выделение вируса SARS-CoV-2 проводили из клинического образца, полученного от больного пациента. Орофарингеальный мазок отбирали в 15-миллиметровую пробирку со средой DMEM (Lonza; Швейцария) без сыворотки и транспортировали в лабораторию. В тот же день образец фильтровали через шприцевой фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Выделение и накопление вируса производили на культуре клеток Vero (B) (БиолоТ; Россия) в среде EMEM с L-глутасином (БиолоТ; Россия) с 2%-м содержанием фетальной бычьей сыворотки (БиолоТ; Россия) и 1%-м содержанием антибиотикаантимикотика (Gibco; США). После каждого пассажа с помощью метода обратной транскрипции, совмещенной с полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ОТ-ПЦР-РВ), определяли наличие искомого вируса и увеличение его титра по отношению к исходной пробе с использованием коммерческого набора «Detection Kit for 2019 Novel Coronavirus (2019-nCoV) RNA (PCR-Fluorescence Probing)» (Университет Сун Йат-сен; Китай). В результате оценки нуклеотидной последовательности используемого вируса установлена его принадлежность к подклайду GR. Инфекционную активность SARS-CoV-2 определяли на культуре клеток Vero (B) в 96-луночных планшетах, тканевую цитопатическую дозу (ТЦД) вычисляли по методу Рида и Менча [12]. Для заражения животных использовали пятый пассаж вирусной культуры с титром 4 × 10⁴ ТЦД₅₀/мл. Введение вируса осуществляли интраназально механическим дозатором типа эппендорф по 13 мкл в каждую ноздрю с контролем вдоха.

Исследования проводили на аутбредных самцах золотистых сирийских хомяков Mesocricetus auratus в возрасте 4–6 недель (масса тела 80–100 г), полученных из питомника ЗАО «НПО «Дом фармации» (Санкт-Петербург). Животных содержали в условиях, согласно требованиям Директивы 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза от 22 сентября 2010 г. об охране животных, используемых в научных целях [13]. В помещениях контролировали параметры микроклимата (температуру, влажность, кратность воздухообмена), а также качество кормов и подстилочного материала. Животные получали стандартную диету, представленную в виде гранулированного корма. Режим освещения — 12 ч день /12 ч ночь.

После рандомизации по массе тела животных распределили на четыре подопытные группы по 10 самцов в каждой.

Группа № 1: ежедневное внутрижелудочное (в/ж) введение АПК в дозе 75 мг/кг в течение 7 дней — отрицательный контроль.

Группа № 2: однократное заражение животных SARSCoV-2 — положительный контроль.

Группа № 3: введение в/ж АПК в дозе 75 мг/кг в течение 14 дней. На восьмой день эксперимента — заражение животных культурой SARS-CoV-2 — лечебнопрофилактическая схема.

Группа № 4: однократное заражение хомяков SARSCoV-2 с последующим введением АПК курсом в течение 7 дней — лечебная схема.

После введения SARS-CoV-2 животных наблюдали два раза в день на наличие признаков заболевания COVID-19 (взъерошенный мех, сгорбленная поза, затрудненное дыхание, анорексия, вялость) [14]. Массу тела регистрировали один раз в день в течение периода исследования.

На восьмой день после заражения SARS-CoV-2 всех животных подвергали эвтаназии путем передозировки общего анестетика (раствор «Ксила» 20,0 мг/мл и раствор «Золетил 100» 50,0 мг/мл, в соотношении 1 : 1, в объеме 1,0 мл на 1,0 кг массы тела, внутримышечно), после чего был осуществлен забор внутренних органов (легкие, сердце, селезенка) для оценки их массовых коэффициентов (отношение массы органа (мг) к общей массе (г)) и последующего патоморфологического анализа.

Внутренние органы фиксировали в формалине (10%), проводку органов осуществляли в гистологическом процессоре замкнутого цикла Tissue-Tek VIP (Sakura; Япония), заливку внутренних органов в парафин проводили на станции парафиновой заливки Tissue-Tek TEC (Sakura; Япония). Фиксированные срезы толщиной

5 мкм были изготовлены на ротационном микротоме AccuCut SRM 200 (Sakura; Япония). Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином на соединительную ткань по Ван Гизону, на фибрин по Вейгерту, а также использовали гистохимический метод выявления нуклеиновых кислот (метиловым зеленым — пиронином) по методу Браше. Приготовленные гистологические срезы анализировали с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss; Германия) с цветной цифровой фотокамерой ProgRes CFscan (Carl Zeiss; Германия), оснащенной программным обеспечением для видеодокументирования полученных результатов.

Статистическую обработку проводили в программе «GraphPad Prism 5.04» (GraphPad Software; США). Для сравнения результатов при нормальном распределении данных использовали t-критерий Стьюдента для связанных выборок. При распределении данных, отличных от нормального, применяли критерий Уилкоксона для связанных выборок. Для оценки межгрупповых различий применяли U-критерий Манна–Уитни. Статистически значимыми считали различия при р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате проведенного исследования установлено, что животные, подвергнутые заражению SARSCoV-2, статистически значимо теряют массу тела в экспериментальных группах № 2 и № 4 по сравнению с контрольной (табл. 1). При этом в группе животных № 3, получавших АПК по лечебно-профилактической схеме, статистически значимой потери массы тела не выявлено.

Во всех экспериментальных группах животных показано статистически значимое увеличение массового коэффициента легких по сравнению с отрицательным контролем (АПК), однако в группе № 3 (лечебнопрофилактическая схема) это увеличение было наименее выраженным (табл. 2). Кроме того, в группе животных № 3 отмечено статистически значимое снижение массового коэффициента селезенки.

При патоморфологическом анализе легких у животных группы № 1 (у трех из пяти животных) выявлены немногочисленные участки альвеолярных кровоизлияний и ателектазов. Помимо этого, были отмечены периваскулярные инфильтраты преимущественно лимфоцитарного состава. Выявленные изменения расценивали как спонтанную патологию, вызванную проведением эвтаназии.

При микроскопическом исследовании паренхимы легких у всех подопытных животных группы № 2 наблюдали диффузное альвеолярное поражение, проявляющееся интраальвеолярным отеком с примесью эритроцитов, макрофагов, слущенных поврежденных альвеоцитов, лимфоцитов (рис. 1А) и альвеолярными кровоизлияниями. Сосудистые повреждения характеризовались тромбозами, периваскулярными отеками и полиморфноклеточными инфильтратами, плазматизацией межальвеолярных перегородок и стенок мелких сосудов (рис. 1Б). Выявлены также гиперплазия и гипертрофия альвеолоцитов II типа, пневмоциты имели атипичную неправильную форму с увеличенными ядрами и ядрышками (рис. 2А). Для более четкой визуализации атипичных форм альвеолоцитов проведено гистохимическое окрашивание нуклеиновых кислот по методу Браше (рис. 2Б).

У двух подопытных животных второй группы в легких были отмечены очаги пролиферации фибробластов с разрастанием грануляционной ткани. Отложение фибрина в паренхиме легких, выявленного с использованием окраски на фибрин по Вейгерту, носило диффузный характер (рис. 3А–В).

Для патоморфологической картины легких в группе № 3 (лечебно-профилактическая схема) было характерно отсутствие у четырех из пяти животных альвеолярного отека легких. При микроскопии легких выявлены перибронхиальные и периваскулярные инфильтраты, участки микрокровоизлияний в паренхиму легких (у трех из пяти животных), кроме того, отмечены гиперплазия альвеолоцитов II типа и усиление макрофагальной реакции (рис. 4А, Б). Гипертрофию и атипию альвеолоцитов наблюдали лишь у одного из пяти животных. Анализ окрашенных гистологических препаратов легких на фибрин по методу Вейгерта у данной группы не выявил фибринизации паренхимы (рис. 3Г).

Патоморфологические изменения в легких у животных подопытной группы № 4 имели схожий характер с деструктивными изменениями паренхимы легких животных группы № 2.

При анализе гистологических препаратов сердца не было обнаружено каких-либо морфологических различий между подопытными группами, за исключением двух животных — одного из группы № 1 (контрольной), у которого был выявлен перикардит, и животного из группы № 4, у которого были выявлены перикардит, миокардит, зона некроза и кровоизлияния.

При микроскопическом исследовании селезенки установлено, что фолликулярные структуры белой пульпы и реактивные центры не изменены, уровень митозов в пределах контроля. В красной пульпе селезенки было отмечено скопление клеток плазмоцитарного ряда, различной степени зрелости в той или иной степени выраженности в каждой из обследованных групп (у двух из пяти животных в группах № 1, 2 и 3, у трех из пяти животных в группе № 4). Плазматические клетки выявляли с помощью гистохимического окрашивания метиловым зеленым — пиронином по методу Браше. Помимо этого, наблюдали гиперемию с участками кровоизлияний у животных всех изучаемых групп, наиболее выраженные изменения отмечены в группах № 2 и 4.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Лечебно-профилактическое применение препарата на основе АПК в экспериментальной модели СOVID-19, реализованной на сирийских хомяках, позволяет уменьшить тяжесть течения заболевания, что выражается в меньшем снижении массы тела животных, как интегрального показателя, характеризующего общее состояние организма, подвергнутого заражению SARSCoV-2. Тенденция к снижению массы тела хомяков в контрольной группе, получавших АПК, вероятно, связана с его стимулирующим влиянием на энергетический метаболизм и активацией катаболических процессов [15].

Снижение массового коэффициента легких свидетельствует об уменьшении выраженности отека и подтверждает ранее сделанное предположение о наличии у исследуемого препарата противоотечного действия, выявленного на модели изолированных легких [11]. Данный эффект АПК может быть опосредован ограничением проницаемости аэрогематического барьера в результате поддержания активными компонентами препарата энергетического метаболизма клеток, регуляции усвоения глюкозы путем непосредственной транслокации транспортеров семейства GLUT на плазматическую мембрану, что обусловливает перспективность его применения при митохондриальной дисфункции [15].

Патоморфологическое исследование легких показало, что однократное интраназальное введение подопытным животным раствора с SARS-CoV-2 в объеме 26 мкл (титр вируса 4 × 10⁴ ТЦД₅₀/мл) приводило к заболеванию сирийских хомяков COVID-19 и проявлялось диффузным альвеолярным повреждением легких с поражением сосудов, соответствующим ранней экссудативной стадии заболевания [16].

В результате патоморфологического анализа определены основные критерии оценки гистологических препаратов легких: наличие альвеолярного отека, внутриальвеолярных кровоизлияний, гиперплазии, гипертрофии и атипии альвеолоцитов II типа, пролиферации фибробластов, сосудистых повреждений паренхимы легких (периваскулярные отеки, инфильтраты, тромбы и т. п.).

Проведенная сравнительная патоморфологическая оценка легких у животных, подвергнутых заражению SARSCoV-2 и получавших АПК по лечебно-профилактической схеме (группа № 3), и подопытных животных группы № 2 (положительный контроль) выявила определенные различия в гистопатологических изменениях. Так, у животных группы № 3, получавших АПК в качестве лечебно-профилактического средства, не обнаружены альвеолярный отек, атипичные и гипертрофированные формы альвеолоцитов II типа, а также показано отсутствие фибринизации паренхимы легких. У всех животных данной группы было отмечено усиление макрофагальной реакции, что, скорее всего, можно расценить как активацию регенераторных процессов в легких.

При патоморфологическом анализе гистологических препаратов легких, сердца и селезенки подопытных животных, получавших АПК по лечебной схеме (группа животных № 4), отмечены отек легких, кровоизлияния, гипертрофия и атипия альвеолоцитов, сосудистые повреждения. Характер выявленных деструктивных изменений в целом соответствовал таковому у животных группы № 2.

Использование АПК по лечебной схеме не оказало значимого влияния на течение инфекционного процесса.

Установленный факт соответствует данным литературы о большей эффективности при COVID-19 профилактического применения некоторых фармакологических средств в сравнении с лечебным, что может быть связано с вирулентностью SARS-CoV-2, высокой скоростью репликации и быстрым развитием клинических проявлений заболевания [17, 18].

ВЫВОДЫ

Применение препарата на основе АПК в качестве лечебно-профилактического средства вызывает снижение выраженности отека легких и уменьшение морфологических признаков повреждений легочной ткани у самцов сирийских хомяков, подвергнутых заражению SARS-CoV-2.