Klebsiella pneumoniae представляет собой грамотрицательную неподвижную факультативно-анаэробную бактерию, которая встречается повсеместно в природе и может быть обнаружена в составе нормальной флоры человека и животных [1, 2]. В то же время K. pneumoniae — второй по распространенности внутрибольничный патоген в мире, способный вызывать широкий спектр инфекций, таких как абсцессы, гнойные раны, септицемия, пневмония, инфекции мочевыводящих путей и желудочно-кишечного тракта [3]. В рамках российского исследования «Марафон 2015–2016» было показано, что штаммы K. pneumoniae преобладают (47,2%) среди всех нозокомиальных штаммов Enterobacterales [4]. По данным того же исследования и карты антибиотикорезистентности России [5], доля изолятов, устойчивых к карбапенемам, составляет 6,9–41,6%, к цефалоспоринам III–IV поколения резистентны 80,1–90,2%, а к колистину — до 6,11%. Ассоциированные с устойчивостью к антибиотикам штаммы K. pneumoniae занимают третье место по уровню смертности среди бактерий, устойчивых к антибиотикам [6].

Одним из альтернативных видов терапии инфекций, вызванных K. pneumoniae, может стать терапия бактериофагами и/или их производными [7]. Бактериофаги — это наиболее распространенная и многочисленная группа вирусов, которые являются естественными паразитами бактерий в природных популяциях [8]. Благодаря способности бактериофагов заражать и лизировать клетки бактерий, их использовали в качестве антимикробного средства с момента открытия в начале XX в. [9]. Фаготерапия имеет ряд преимуществ, таких как способность лизировать бактерии вне зависимости от их устойчивости к антибиотикам и отсутствие побочных эффектов на организм пациента, что позволяет использовать бактериофаги даже для лечения детей и иммунокомпрометированных пациентов [10]. На сегодняшний день применение бактериофагов в терапевтических целях переживает второй подъем, и все чаще в литературе появляются описания успешных случаев лечения [11–13].

Помимо использования бактериофагов, на данный момент пристальное внимание уделяется отдельным фаговым белкам, эффективным против поверхностных структур бактерий. Одним из примеров могут служить полисахариддеполимеразы [14]. Белки обладают способностью разрушать бактериальные капсульные полисахариды, тем самым сенсибилизируя бактерии к действию антимикробных препаратов и иммунной системы [15]. Как правило, деполимеразы обладают узкой специфичностью, ограниченной конкретным типом полисахарида бактериальной капсулы [14]. В связи с этим поиск и описание бактериофагов, кодирующих деполимеразы против широкого круга капсульных типов клинически значимых бактерий, являются актуальной задачей новейших подходов к терапии инфекций, вызванных бактериями с множественной лекарственной устойчивостью.

Целью данной работы было выделить из внешней среды и охарактеризовать капсуло-специфичные бактериофаги бактерии K. pneumoniae, пригодные для терапевтического применения и несущие гены полисахарид-деполимераз.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и их характеристика

В работе было использовано 180 клинических изолятов K. pneumoniae, собранных в течение 2019–2022 гг. в НИИ детской онкологии, гематологии и трансплантологии им. Р. М. Горбачевой (Санкт-Петербург, Россия), Клинической больнице № 123 (Одинцово, Россия) и в том числе 12 штаммов, полученных из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур (Оболенск, Россия).

Бактериальные штаммы культивировали в лизогенном бульоне (LB) (Himedia; Индия) при 37 °С. Видовую идентификацию проводили с помощью метода прямого массспектрометрического профилирования бактериального лизата по методике, описанной ранее [16]. Масс-спектры получали на времяпролетном масс-спектрометре Microflex (Bruker Daltonics; Германия). Для записи, обработки и анализа масс-спектров применяли программное обеспечение flexControl 3.0 и flexAnalysis 3.0 (Bruker Daltonics; Германия). Видовую идентификацию проводили с помощью программного обеспечения MALDI Biotyper 3.0 (Bruker Daltonics; Германия). Тип капсулы K. pneumoniae определяли методом секвенирования гена wzi [17].

Выделение и очистка бактериофагов

В качестве источника фагов использовали образец речной воды. Для удаления бактериальной фракции образец центрифугировали (4000 g, 10 мин), супернатант фильтровали через фильтры 0,22 мкм (Merk Millipore; США). Равные аликвоты (15 мл) фильтрованной воды и бульона LB двойной концентрации смешивали и инокулировали 20 мкл ночной культурой потенциального штамма хозяина. Смесь инкубировали в течение ночи на шейкере-качалке при 37 °С. Полученную суспензию стерилизовали с помощью фильтра 0,22 мкм, а наличие бактериофагов в фильтрате проверяли методом спот-тестирования [18]. Фаговые изоляты очищали тройным проведением через единичную колонию.

Определение спектра литической активности

Спектр литической активности для бактериофагов был установлен методом спот-тестирования [18]. Для этого 100 мкл культуры каждого штамма на логарифмической фазе роста добавляли к 5 мл незастывшего полужидкого LB-агара (0,7% агара) и наносили на чашки Петри, содержащие тонкий слой LB агара (1,5% агара). Тестирование проводили путем нанесения по 5 мкл серийных разведений бактериофагов на поверхность свежезасеянных газонов штаммов. Чашки инкубировали в течение ночи при 37 °С, наличие литической активности у бактериофага определяли по наличию зоны сплошного лизиса бактериальных клеток, совпадающей с формой капли. Наличие полупрозрачного ареола вокруг зоны лизиса или единичной колонии бактериофага интерпретировали как полисахарид-деполимеразную активность бактериофага.

Полногеномное секвенирование бактериофагов и биоинформатический анализ данных

Экстракцию геномной ДНК фага проводили с использованием стандартного протокола фенол-хлороформной экстракции [19]. Процедуру секвенирования осуществляли с помощью инструмента MiSeq (Illumina; США) с использованием набора реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Nano Kit v2 (500cycle) (Illumina; США) согласно рекомендациям производителя. Сборку геномов проводили с помощью программы SPAdes (v.3.14.0). Для идентификации открытых рамок считывания (ОРС) в геноме использовали веб-сервис GeneMarkS (версия 4.32). Поиск генов тРНК проводили с помощью ARAGORN.

Аннотацию предсказанных генов проводили вручную с использованием BLASTp, HHPred и InterPro. Отсутствие генов токсинов и детерминант устойчивости к антибиотикам подтверждали сравнением с базами данных факторов вирулентности патогенных бактерий [20] и генов устойчивости к антибиотикам [21]. Аннотированные последовательности геномов бактериофагов vB_KpnM_ NDO71, vB_KpnS_MAG26fr, vB_KpnS_MDA2066 и vB_ KpnS_PMM-G3 были депонированы в базу GenBank под номерами OP558001, OP558002, OP558003 и OP558005 соответственно.

Филогенетический анализ выполняли с использованием 62 референсных геномов бактериофагов, рекомендованных Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV, от англ. International Committee on Taxonomy of Viruses). Филогенетические деревья на основе попарных расстояний между геномами фагов были построены с использованием автономной версии ViPTree v.1.1.2. [22]. Ближайшие гомологи бактериофагов определяли с помощью алгоритма BLASTn. Для сравнительного анализа последовательностей отдельных белков использовали сервисы BLASTp.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение, морфология и спектр литической активности бактериофагов K. pneumoniae

Из образца воды реки Лихоборка (Москва) методом накопительных культур были выделены четыре бактериофага K. pneumoniae: vB_KpnM_NDO71, vB_KpnS_MAG26fr, vB_KpnS_MDA2066 и vB_KpnS_PMM-G3. В качестве штаммов хозяев были использованы выделенные в 2020 г. клинические штаммы с определенными капсульными типами: K. pneumoniae Kp71 (капсульный тип KL45), Kp26f (KL19), Kp2066 (KL107) и KpG3 (KL28).

Бактериофаг vB_KpnM_NDO71 формировал мелкие (0,5 мм) негативные колонии, окруженные широким (2–4 мм) ореолом. Негативные колонии бактериофага vB_KpnS_PMM-G3 были значительно крупнее (1–2 мм) и окружены широким (4–5 мм) ореолом. Бактериофаги vB_KpnS_MAG26fr и vB_KpnS_MDA2066 формировали мелкие (0,5 мм) негативные колонии, окруженные небольшим (1–2 мм) ореолом (рис. 1).

Спектр литической активности бактериофагов был оценен на коллекции из 180 штаммов K. pneumoniae с известным капсульным типом на основании типирования по последовательности гена wzi. Штаммы относились к 31 уникальному капсульному типу, среди которых самыми распространенными были KL2 (19,4%), KL23 (9,4%), KL39 (8,9%), KL64 (8,9%) и KL20 (6,1%).

Бактериофаги vB_KpnM_NDO71, vB_KpnS_MAG26fr и vB_KpnS_PMM-G3 обладали узким спектром литической активности и лизировали все штаммы с капсульным типом штамма хозяина: KL45 (n = 4; 2,2%), KL19 (n = 6; 3,3%) и KL28 (n = 4; 2,2%) соответственно. Бактериофаг vB_KpnS_ MDA2066 проявлял литическую активность в отношении штаммов двух различных капсульных типов: KL19 и KL107 (n = 7; 3,9%).

Полногеномное секвенирование и филогенетический анализ бактериофагов

Геномы исследуемых бактериофагов были представлены двухцепочечными молекулами ДНК длинной от 49 477 до 158 414 п.н. и содержанием Г+Ц пар 44,4–56,1% (табл. 1). Число предсказанных открытых рамок считывания (ОРС) варьировало от 76 до 236, для бактериофагов vB_KpnM_ NDO71 и vB_KpnS_MDA2066 были выявлены гены тРНК (21 и 7 соответственно).                       

Для установления таксономического положения бактериофагов было построено филогенетическое древо с использованием полногеномных последовательностей фагов, рекомендованных ICTV (рис. 2). Бактериофаги vB_KpnM_NDO71, vB_KpnS_MAG26fr, vB_KpnS_MDA2066 и vB_KpnS_PMM-G3 принадлежали к разным таксономическим группам и на филогенетическом древе относились к кластерам, образованным представителями родов Mydovirus, Yonseivirus, Taipeivirus и Webervirus соответственно. 

На основании анализа BLASTn ближайшим гомологом фага vB_KpnM_NDO71 оказался Klebsiella phage vB_KpnM_ KB57 (GenBank KT934943.1; 84% покрытия и 96,49% идентичности), фага vB_KpnS_MAG26fr — Klebsiella phage S9a (GenBank ON623732.1; 71% покрытия и 93,88% идентичности), фага vB_KpnS_MDA2066 — Klebsiella virus UPM 2146 (GenBank NC_049472.1; 95% покрытия и 98,98% идентичности), а фага vB_KpnS_PMM-G3 — Klebsiella virus UPM 2146 (GenBank NC_049472.1; 95% покрытия и 98,98% идентичности). 

Функциональный анализ фагов K. pneumoniae

В ходе функциональной аннотации генома vB_KpnM_ NDO71 удалось предсказать функцию для 61 белка. Бактериофаг имел стандартное строение для rV5-подобных фагов: не кодировал РНК-полимеразу, а в качестве белка лизиса имел о-спанин. В отличие от фагов-гомологов Seu621 и VIK251 [23, 24] в геноме фага vB_KpnM_NDO71 ген ДНК-полимеразы был разбит на две рамки считывания геном хомингэндонуклеазы.

Для фага vB_KpnS_MAG26fr предполагаемая функция (структурные белки; ферменты, участвующие в репликации, регуляции, транскрипции и трансляции ДНК; лизис хозяина) была присвоена продуктам 42 ОРС. Из них 19 относились к структурным белкам фага, а за лизис хозяина отвечала кассета из пяти белков (о-спанин, компонент спанина внутренней мембраны, эндолизин и два белка системы холин–антихолин).

Бактериофаг vB_KpnS_MDA2066 кодировал 80 белков с предполагаемой функцией. Среди них 27 относились к структурным белкам; 52 — к генам, участвующим в репликации, регуляции, транскрипции и трансляции ДНК; кроме того, фаг кодировал один белок эндолизина, отвечающий за лизис бактерии хозяина.

Из 76 ОРС фага vB_KpnS_PMM-G3 43 кодировали белки с предсказанной функцией, большинство из которых относились к структурным белкам. Бактериофаг имел структуру генома, характерную для Т1-подобных бактериофагов, и не кодировал гены ДНК- и РНК-полимеразы.

Рецептор-связывающие белки бактериофагов

Согласно функциональному анализу пять ОРС бактериофага vB_KpnM_NDO71 были аннотированы как белки фаговых фибрилл. В дальнейшем было обнаружено, что NDO71_ orf047 несет деполимеразный домен, представленный пектатлиазой 4 (табл. 2). Анализ, проведенный с помощью BLASTp, показал, что данный белок обладал высокой гомологией с гипотетическими белками профагов K. pneumoniae (GenBank WP_180812430.1; 89% покрытия и 68,97% идентичности).

В геноме vB_KpnS_MDA2066 также было закодировано пять белков, аннотированных как белки фаговых фибрилл. Однако в отличие от vB_KpnM_NDO71, четыре из пяти предсказанных белков фибрилл фага несли домены полисахарид-деполимераз: MDA2066_orf130 — пектатлиазу 3, а MDA2066_orf131, MDA2066_orf133 и MDA2066_orf135 — гликозилгидролазы семейства 28.

Два белка фибрилл бактериофага vB_KpnS_MDA2066 (orf131 и orf135) имели уровень гомологии выше 50% с ранее описанными фибриллами бактериофага Klebsiella phage K64-1, специфичными в отношении капсульных типов K30/K69 и KN4 соответственно. Белок фибриллы MDA2066_orf130 имел гомологию (53% покрытия, 34,87% идентичности согласно BLASTp) с белком фибриллы ранее описанного фага P929, проявляющего литическую активность в отношении штаммов с капсульным типом KL19 (табл. 2). Четвертый белок фибрилл MDA2066_orf133 был идентичен белку фибриллы фага Klebsiella virus UPM 2146 и обладал высокой гомологией с аналогичными белками фагов рода Taipeivirus (покрытие 100% и идентичность 99%).

Геном фага vB_KpnS_MAG26fr кодировал два белка, аннотированных как белки фибрилл. Один из них (MAG26fr_orf055) кодировал деполимеразный домен, представленный гликозилгидролазой семейства 48 (табл. 2). Ближайшим гомологом данного белка фибрилл являлся дистальный хвостовой белок бактериофага Soft (GenBank YP_009851405.1; 100% покрытия и 46,36% идентичности).

Аналогично фагу vB_KpnS_MAG26fr в геноме vB_ KpnS_PMM-G3 было закодировано два белка фибрилл. При более детальном анализе для одного из этих белков (PMMG3_orf046) был предсказан домен полисахариддеполимеразы, представленный пектатлиазой 3. Данный белок обладал высокой гомологией с белком фибрилл не описанного фага Klebsiella phage VLCpiD7c (GenBank UVX29830.1; 100% покрытия и 95,15% идентичности).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе исследования из природных источников было выделено четыре бактериофага, способных лизировать штаммы K. pneumoniae с капсульными типами KL19, KL28, KL45 и KL107. Следует отметить, что бактериофаги против трех типов описаны впервые, тогда как фаги vB_KpnS_ MDA2066 и vB_KpnS_MAG26fr обладали активностью против штаммов с капсульным типом KL19, так же как и ранее описанный Klebsiella phage P929 [25].

Для описания генетических особенностей фагов был использован метод полногеномного секвенирования, в последние годы широко применяемый для определения таксономического положения фагов и исследования их организации [26]. Филогенетический анализ данных позволил обнаружить, что исследуемые бактериофаги относятся к разным родам и семействам. Более того, выравнивание геномов с использованием алгоритма BLASTn выявило значимые различия (> 5%) с геномами ближайших фагов, позволяя сделать вывод, что исследованные бактериофаги являются представителями новых видов [26].

Функциональный анализ кодируемых генов продемонстрировал, что фаги имели типичную для представителей своих родов организацию генома. Бактериофаги обладали строго вирулентной природой и не несли в своем составе гены интеграз, а также потенциально опасные гены токсинов и детерминант устойчивости к антибиотикам, что позволяет применять их в терапевтической практике.

В геномах всех четырех бактериофагов были предсказаны рецептор-связывающие белки, представленные полисахарид-деполимеразами. Для деполимераз бактериофагов vB_KpnM_NDO71, vB_KpnS_MAG26fr и vB_KpnS_PMM-G3 не было выявлено гомологии с ранее описанными в литературе бактериофагами, что расширяет теоретическое знание и возможности для создания в будущем терапевтических препаратов полисахариддеполимераз широкого спектра действия. Три фибриллы бактериофага vB_KpnS_MDA2066 (orf130, orf131 и orf135) показали гомологию с белками фибрилл известной специфичности: KL19, K30/K69 и KN4 соответственно. При этом основные различия находились на N-конце, который кодирует сайты прикрепления фибриллы к другим фаговым белкам, и напротив, высокая степень гомологии наблюдалась в области предсказанного ферментативного домена и C-конца, который отвечает за распознавание субстрата [27] (табл. 2). Стоит отметить также, что в тестируемой коллекции клинических изолятов K. pneumoniae не было образцов с капсульным типом K30/ K69, а для определения типа KN4 необходимо использовать другую схему типирования.

Спектр литической активности исследуемых фагов был ограничен четырьмя капсульными типами. Несмотря на то что представленность штаммов с KL19, KL28, KL45 и KL107 в тестируемой коллекции невелика (11,7%), изоляты с данными капсульными типами ассоциированы с нозокомиальными инфекциями, устойчивыми к широкому спектру антибиотиков, в том числе колистину [28]. Кроме того, два фага продемонстрировавшие активность против штаммов с KL19 (vB_KpnS_MAG26fr и vB_KpnS_ MDA2066) несли различные по типу домены полисахариддеполимераз, что потенциально способно уменьшить частоту образования мутантов при их совместном использовании.

Для увеличения эффективности терапии при создании терапевтических препаратов, как правило, несколько бактериофагов, имеющих различный литический профиль, объединяют в фаговый коктейль. На сегодняшний день к подобным коктейлям предъявляют следующие требования: титр входящих в них бактериофагов не должен быть ниже 10⁸ БОЕ/мл, бактериофаги должны иметь строго вирулентную природу и не содержать потенциально опасных генов, бактериофаги должны эффективно лизировать возбудителей инфекционного процесса [29, 30]. Таким образом, объединение описанных фагов с другими капсулоспецифичными бактериофагами потенциально способно увеличить эффективность терапевтических коктейлей до 100%.

ВЫВОДЫ

Исследованные бактериофаги vB_KpnM_NDO71, vB_ KpnS_MAG26fr, vB_KpnS_MDA2066 и vB_KpnS_PMM-G3 относятся к новым видам внутри охарактеризованных семейств и подсемейств и являются перспективными кандидатами для получения эффективных фаговых коктейлей. В свою очередь предсказанные деполимеразы, активные в отношении редких капсульных типов KL19, KL28, KL45 и KL107, могут быть предметом дальнейшего изучения в качестве потенциальных терапевтических агентов.

БЛАГОДАРНОСТИ

Коллектив авторов благодарит заведующего лабораторией молекулярной диагностики и генно-инженерных препаратов ФБУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии к.б.н. Н. В. Воложанцева за предоставленные штаммы.