Соединение 1,4-дихлоргексафторбутен (ДХГФ) предназначено для использования в качестве растворителя, теплоносителя, реагента при производстве перфторбутадиена. В ряду смешанных фторсодержащих углеводородов, к которым относится ДХГФ, токсичность возрастает с введением в молекулу атома хлора и наличием двойных связей [1, 2].

В настоящее время наиболее изучен структурный изомер ДХГФ 2,3-дихлор-1,1,1,4,4,4-гексафторбутен [3–7], который относят к высокотоксичным и опасным веществам [8–12]: он вызывает отек легких, поражение нервной системы, обладает нефротоксичным и гепатотоксичным эффектами, а также проникает через неповрежденную кожу, оказывая выраженное кожно-резорбтивное действие. Проявление токсичного воздействия ДХГФ авторы исследований связывают с процессами дегалогенирования, образованием метаболитов, нарушающих обменные процессы в организме.

До настоящего времени сведения о токсичности ДХГФ были крайне ограничены, гигиенические нормативы ДХГФ для воздуха рабочей зоны и объектов окружающей среды (атмосферный воздух, вода, почва) не разработаны [14, 15].

Цель исследования — экспериментальное обоснование предельно допустимой концентрации ДХГФ в воздухе рабочей зоны.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

По физико-химическим свойствам 1,4-дихлоргексафторбутен-2 (синонимы: ДХГФ, хладон RL316; химическая формула: C₄Cl₂F₆; № CAS 360-88-3) представляет собой прозрачную бесцветную жидкость со слабым специфическим запахом, относительной молекулярной массой — 232,94, температурой кипения — 63 ± 5 °С, температурой плавления  — ‒75 °С [1–2].

Исследования проводили в соответствии с методическими указаниями [3–5] на нелинейных животных (белых крысах и мышах с начальной массой тела 220–250 г и 20–25 г соответственно), полученных из ФГУП «ПЛЖ «Рапполово» (Ленинградская область). Партии прибывших животных имели ветеринарную справку с указанием возраста и среднего веса животных, отсутствия общих заболеваний и паразитических инвазий.

Животные поступали в карантинное отделение вивария, где за ними проводили наблюдение в течение двух недель. Содержали животных в стандартных условиях вивария на обычном пищевом рационе, со свободным доступом к воде. В течение карантина проводили ежедневный осмотр каждого животного (оценивали поведение и общее состояние, заболеваемость и смертность). Клетки с животными находились в отдельных комнатах. Световой режим: 12 ч — свет, 12 ч — темнота, температуру воздуха поддерживали в пределах 19–25 °С, относительную влажность — 50–70%, температуру и влажность воздуха регистрировали ежедневно. Для исследования животных распределяли по массе на однородные группы по 8–10 особей.

Токсические свойства ДХГФ изучали в условиях однократного и повторного воздействия. Опасность острых отравлений ДХГФ определяли при пероральном и ингаляционном путях поступления в организм, при контакте с кожными покровами. С целью исследования раздражающего и кожно-резорбтивного действия ДХГФ наносили на выстриженный участок кожи спины крысы и помещали хвост лабораторных мышей на 2/3 в пробирку с веществом (время экспозиции составляло для мышей 2 ч и для крыс — 4 ч).

Ингаляционные воздействия ДХГФ на лабораторных животных осуществляли как в статических условиях при свободном испарении вещества при комнатной температуре, так и динамическим способом в специальных стальных герметичных камерах объемом 600 дм³. Заданные концентрации вещества обеспечивали путем внесения расчетной дозы в генератор пара. Время экспозиции при однократном воздействии для мышей составляло 2 ч, для крыс — 4 ч.

Кумулятивные свойства вещества изучали в субхроническом эксперименте, подопытных крыс подвергали ингаляционному воздействию ДХГФ в течение 30 суток по 4 ч в день (кроме выходных дней).

Кроме этого, проводили хроническую интоксикации ДХГФ в течение 4 месяцев (ежедневно по 4 ч кроме выходных дней) с последующим наблюдением за подопытными крысами в течение 30 суток восстановительного периода.

Контроль за содержанием ДХГФ в воздушной среде затравочных камер проводили с помощью разработанного газохроматографического метода.

О состоянии подопытных животных судили с помощью комплекса методов, позволяющих выявить изменения на различных структурно-функциональных уровнях организма. Использовали интегральные, физиологические, гематологические, биохимические и патоморфологические показатели. ДХГФ и метаболиты определяли в плазме крови подопытных крыс с использованием газовой хроматомасс-спектрометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии с массселективным детектированием высокого разрешения.

Статистическую обработку данных проводили на основе сравнения средних значений подопытной группы с контролем. Для оценки различий дискретных параметров использовали критерий хи-квадрат (χ²) или точный метод Фишера. Различия считали достоверными при р < 0,05. Данные обрабатывали в статистической компьютерной программе Prizm 5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В результате исследования установлено, что ДХГФ по параметрам острой токсичности относится к высокоопасным веществам: СL₅₀ для мышей составляет 229,0 ± 10,4 мг/м³, для крыс — 670 ± 32,0 мг/м³; DL₅₀ — 79,0 ± 11,1 мг/кг и 86,0 ± 16,0 мг/кг соответственно. Клиническая картина острого отравления ДХГФ характеризовалась кратковременным двигательным возбуждением, снижением частоты дыхания, нарушением координации движений, адинамией, клонико-тоническими судорогами. Гибель подопытных животных наступала, в основном, на 1–3-и сутки после воздействия веществом. На вскрытии погибших животных обнаружены: в легких — ателектазы, очаги кровоизлияний, альвеолярный отек, очаговая эмфизема и бронхопневмония, геморрагический инфаркт; в почках и печени — жировая дистрофия паренхимы; в плазме крови и моче животных после острого ингаляционного отравления хладоном обнаружены ДХГФ и метаболиты — аддукт с ацетилцистеином и метилсульфид. 

Установлено, что ДХГФ обладает умеренным местным раздражающим действием на кожу животных и слизистые оболочки глаз, а также кожно-резорбтивным эффектом. Порог однократного ингаляционного действия (Limac) ДХГФ на уровне 18,2 мг/м³ рассчитан по изменению параметров поведенческих реакций и показателей кислотно-основного состояния крови. В подостром 30-суточном ингаляционном эксперименте обнаружены выраженные кумулятивные свойства ДХГФ.

С целью изучения проявлений хронической интоксикации и оценки опасности при длительном поступлении в организм подопытных животных подвергали ингаляционному воздействию ДХГФ в течение 4 месяцев, ежедневно по 4 ч (кроме выходных дней) в концентрациях: 16,8 ± 3,8; 2,2 ± 0,9 и 0,24 ± 0,09 мг/м³.

Обследование животных проводили в динамике на протяжении хронического эксперимента и через 30 суток после окончания ингаляционного воздействия ДХГФ (восстановительный период).

Длительное воздействие вещества в концентрации 16,8 мг/м³ вызывало у подопытных крыс нарушение функционального состояния ЦНС, проявляющееся, в основном, изменением ориентировочно-исследовательских реакций. 

Обнаружено достоверное повышение «вертикального» компонента двигательной активности у подопытных крыс после 14 суток эксперимента (4,2 ± 1,3 — в опытной группе, 1,5 ± 0,8 — в контрольной). Изменения достигали максимальных значений (6,2 ± 1,2 — в опытной группе, 1,8 ± 0,8 — в контрольной) через 30 суток воздействия ДХГФ. Значительное повышение данного показателя сохранялось на протяжении двухмесячного воздействия вещества в концентрации 16,8 мг/м³. Через 90 суток эксперимента «вертикальный» компонент двигательной активности подопытных животных приближался к уровню контрольных. Однако к концу четырехмесячного воздействия ДХГФ выявлено достоверное повышение данного показателя на 253%.

Аналогичный вектор изменений наблюдали и при изучении проявлений эмоциональной активности подопытных животных. Динамику груминга характеризовало максимальное увеличение показателя через 30 и 60 суток эксперимента — в 2,5 и 3 раза по сравнению с контролем соответственно и снижением до контрольного уровня к 90-м суткам воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³. К концу хронического эксперимента направленность изменений груминговых реакций у подопытных животных сохранялась, но была менее выражена (повышение на 80% от контрольного уровня).

Ингаляционное воздействие вещества в течение четырех месяцев вызывало нарушение сердечной деятельности у подопытных животных. По данным электрокардиографических исследований обнаружено достоверное снижение высоты зубца Р (р ˂ 0,05) через 30 суток эксперимента, свидетельствующее о нарушении функции предсердий. На угнетение биоэлектрической активности желудочков указывало снижение высоты зубца R на 43,2% от контрольного уровня через 30 суток и на 25,7% — к концу эксперимента. При этом через 90 суток эксперимента высота зубца R не отличалась от контрольных животных.

Высота зубца S на ЭКГ у подопытных крыс снижалась на 41,9% от контроля через 30 суток и на 24,5% — на 120-е сутки воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/ м³. Депрессия зубцов Р, R, S, T, а также увеличение длительности интервалов QT и ST у подопытных крыс свидетельствуют о нарушении проводимости миокарда, что может быть связано с возникновением гипоксии миокарда на фоне хронического ингаляционного воздействия вещества. При этом следует отметить положительную динамику показателей ЭКГ на 60–90-е сутки эксперимента, что свидетельствует о реализации компенсаторноприспособительных механизмов и адаптации животных в ответ на воздействие вещества. Однако к 120-м суткам воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ наблюдали угнетение сердечной деятельности, что указывало на возможный срыв компенсаторных процессов при длительном воздействии вещества в данной концентрации.

Частота сердечных сокращений и дыхания у подопытных крыс достоверно не отличалась от показателей у контрольных.

В периферической крови подопытных крыс через 30 и 60 суток воздействия вещества обнаружено достоверное (р ˂ 0,05) снижение содержания общего гемоглобина и среднего содержания гемоглобина в эритроците.

Изменения лейкоцитарной формулы крови подопытных крыс включали в себя увеличение числа лимфоцитов на 31,5% от контрольного уровня через 30 суток и на 91,8% через 60 суток эксперимента.

Анализ показателей кислотно-основного состояния крови подопытных животных показал, что ингаляционное воздействие ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ вызывало изменение бикарбонатной буферной системы, которое проявлялось снижением содержания оснований внеклеточной жидкости (BЕecf) на 46,6% по сравнению с контрольной группой крыс через 30 суток эксперимента. Содержание оснований крови (Beb) подопытных крыс данной группы достоверно снижалось на седьмые сутки опыта на 36,4%, через 30 суток — на 40% по сравнению с контролем.

Одновременно отмечено достоверное снижение концентрации стандартных буферных бикарбонатов. При увеличении времени экспозиции ДХГФ до 60 суток наблюдали тенденцию к увеличению содержания оснований внеклеточной жидкости (BЕecf) — на 23,5% и крови (Beb) — на 28% по сравнению с контролем.

К концу четырехмесячного ингаляционного воздействия ДХГФ показатели кислотно-основного состояния крови подопытных крыс не отличались от контроля. Так как достоверные изменения рН крови отсутствуют, полученные экспериментальные данные свидетельствуют об активации защитно-приспособительных механизмов при воздействии ДХГФ в течение первых 30 суток хронического эксперимента.

При исследовании состояния газообмена крови у подопытных животных на протяжении 60-суточного воздействия ДХГФ регистрировали снижение насыщения кислородом (SO₂) и парциального давления кислорода крови (pO₂). Через 60 суток эксперимента у подопытных крыс этой же группы отмечено снижение содержания альвеолярного кислорода при одновременном увеличении парциального давления углекислого газа. Более длительное ингаляционное воздействие ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ не вызывало существенных изменений состояния газообмена крови подопытных крыс.

Биохимические исследования показали, что длительное воздействие ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ вызывало снижение содержания молочной кислоты в сыворотке крови подопытных крыс на 38,9% от контрольной группы через 60 суток и на 36,4% — к концу эксперимента. Одновременно со снижением уровня молочной кислоты на протяжении хронического эксперимента регистрировали угнетение активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови подопытных животных. Кроме того, отмечено существенное (на 83%) повышение содержания триглицеридов в начальные сроки воздействия ДХГФ.

Полученные данные свидетельствуют о возможном нарушении углеводного и липидного обмена у подопытных крыс в результате длительного ингаляционного воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³.

В эти же сроки обследования у подопытных крыс обнаружено достоверное увеличение активности аланинаминотрансферазы до 119,3% через 60 суток эксперимента, что отражает нарушение функционального состояния печени, которое к концу эксперимента нормализовалось.

Отмечено также снижение содержания альбумина в сыворотке крови подопытных крыс через 60 суток воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ до 79,1%.

Токсическое действие хлорбутенов, согласно литературным данным [1, 2], связано с процессами дегалогенирования, образованием свободных радикалов и перекисных соединений. В связи с этим проведено исследование состояния оксидантно-антиоксидантной системы у подопытных крыс через 60 и 120 суток воздействия ДХГФ.

При оценке состояния общей оксидантной системы (ООС) установлено, что содержание перекиси водорода в сыворотке крови подопытных животных достоверно не отличалось от контрольной группы. Для изучения состояния антиоксидантной системы (АОС) и общей антиоксидантной активности определяли содержание восстановленного глутатиона в крови подопытных крыс как одного из компонентов антиоксидантной системы.

Интерес к исследованию содержания восстановленного глутатиона связан также с процессом превращения фторхлоралкенов в организме путем гидролиза и образования конъюгатов с глутатионом. Показано, что содержание восстановленного глутатиона в крови подопытных крыс при длительном воздействии ДХГФ существенно не менялось во все сроки исследования. Значимых изменений относительно контрольных крыс в состоянии АОС у подопытных животных не выявлено.

В результате патоморфологических исследований установлено, что к концу хронического эксперимента массовые коэффициенты легких подопытных животных увеличивались до 134,2%, печени — до 113,6% от контрольных.

Результаты гистологических исследований показали, что ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ при четырехмесячном ингаляционном воздействии вызывал поражение паренхимы легких подопытных крыс. Обнаружено утолщение межальвеолярных перегородок, их плазматическое пропитывание, гиперемия стенок альвеол, в просветах альвеол отмечали скопление эритроцитов.

Патоморфологический анализ сердца, печени, почек, селезенки и головного мозга подопытных животных всех изучаемых групп не выявил различий с контролем.

При оценке генотоксического действия ДХГФ у подопытных крыс выявлено статистически достоверное увеличение степени повреждения ДНК в клетках костного мозга.   

Количественный показатель «% ДНК в хвосте» в опыте превышал контроль в 4 раза (12,5 ± 3,03 в группе, подвергавшейся воздействию вещества в концентрации 16,8 мг/м³, против 3,1 ± 0,6 в контрольной группе).

Полученные данные свидетельствуют о генотоксическом эффекте ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Таким образом, проведенные комплексные исследования показали, что длительное ингаляционное воздействие ДХГФ в максимальной из испытуемых концентраций (16,8 мг/м³) оказывало влияние на функциональное состояние нервной системы подопытных крыс (активация исследовательских реакций и увеличение тревожности), сердечной  деятельности (снижение биоэлектрической активности миокарда, депрессию зубцов Р, R, S, T и увеличение длительности интервалов QT и ST), изменение гематологических, биохимических показателей, кислотно-основного состояния и газообмена крови, морфологические нарушения в легких. Анализ динамики обнаруженных изменений в организме подопытных животных при воздействии ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ показал, что большинство изучаемых показателей достоверно изменялись в период 30–60 суток хронического эксперимента. Подобный вектор нарушений может быть связан с временной активизацией приспособительных реакций организма, в том числе системы детоксикации ДХГФ. Данное предположение подтверждают результаты изучения метаболитов в крови подопытных животных. При изучении метаболитов вещества в плазме крови подопытных животных после четырехмесячного воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ обнаружены цистеиновый аддукт, ацетилцистеиновый аддукт, метилсульфид, тиокетон и летучий метаболит 1-хлор-1,1,2,3,3,4,4,4-октафторбутана, а также неметаболизированная форма ДХГФ. Полученные данные согласуются с литературными сведениями [8, 9], согласно которым смешанные фторпроизводные углеводородов в организме подвергаются превращению с образованием ряда метаболитов. Основным путем превращений ДХГФ в организме являются образование аддуктов с глутатионом и их дальнейшая деградация до цистеиновых и ацетилцистеиновых аддуктов. По некоторым данным [12], активность глутатион-S-трансфераз в результате действия ксенобиотиков может увеличиваться в 2–6 раз.

Предполагаетcя, что ДХГФ может выступать в роли химического активатора биосинтеза глутатион-Sтрансферазы. В результате в хроническом эксперименте к 90 суткам воздействия хладона происходит активация защитно-приспособительных реакций организма.

При этом нельзя исключить срыв защитных реакций с проявлением более выраженной клинической картины интоксикации. Следует отметить, что после 120 суток ингаляционного воздействия вещества в концентрации 16,8 мг/м³, помимо нарушений функционального состояния центральной нервной и сердечно-сосудистой систем, были зарегистрированы достоверные изменения ряда гематологических, биохимических показателей, морфологические изменения в легких, признаки генотоксического действия вещества.

Через 30 суток восстановительного периода после окончания четырехмесячного воздействия ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ у подопытных крыс сохранялись отмеченные изменения (снижение «вертикального» компонента двигательной активности, депрессия зубцов R, S, T при увеличении интервала PQ на кардиограмме, изменения отдельных биохимических показателей: снижение содержания лактата в сыворотке крови и активности ЛДГ).

Воздействие ДХГФ в концентрации 2,2 мг/м в течение четырех месяцев вызывало аналогичные по направленности, но менее выраженные изменения ряда тестов. Так, при изучении поведенческих реакций наблюдали увеличение «вертикального» компонента двигательной активности на 153% и груминга на 33,3% от контрольного уровня через 30 суток эксперимента. В периферической крови подопытных животных группы регистрировали снижение содержания гемоглобина через 60 суток воздействия ДХГФ до 95,3%. При дальнейшем воздействии ДХГФ до конца четырехмесячного эксперимента содержание общего гемоглобина у подопытных животных не отличалось от контрольных.

Вещество в концентрации 0,24 мг/м³ не вызывало достоверных изменений изучаемых показателей.

ВЫВОДЫ

Полученные в ходе четырехмесячного ингаляционного эксперимента данные свидетельствуют о негативном влиянии ДХГФ в концентрации 16,8 мг/м³ на состояние животных. По объему и характеру обнаруженных изменений концентрацию ДХГФ 16,8 мг/м³ следует считать действующей. Концентрация ДХГФ 2,2 мг/м³, при которой регистрировали минимальные изменения в организме подопытных животных, является пороговой для крыс. Концентрация ДХГФ 0,24 мг/м³, при которой не зарегистрировано достоверных изменений изучаемых показателей, является недействующей. Коэффициент запаса, рассчитанный в соответствии с методическими указаниями, составил 12. На основании комплекса проведенных исследований в качестве предельно допустимой концентрации ДХГФ в воздухе рабочей зоны обоснована и утверждена величина, равная 0,2 мг/м³, 2-й класс опасности, п + а (пары + аэрозоль), + (требуется специальная защита кожи и глаз).