Симптомы лекарственно-индуцированного повреждения печени (drug-induced liver injury) составляют около 10% побочных реакций, вызываемых лекарственными средствами, и являются основной причиной прекращения клинических испытаний или изъятия уже используемых в терапии лекарственных препаратов. Гепатотоксическими эффектами обладают препараты различных фармакологических групп: антибиотики (амоксициллин–клавуланат), анальгетики (ацетаминофен), противоэпилептические средства (вальпроат) и др. [1].

Снижение дозировки лекарственного препарата или его полная отмена позволяют предотвратить необратимые поражения печени. Однако в ряде случаев необходимо продолжить применение лекарства, обладающего гепатотоксическим действием на фоне применения гепатопротекторов. Эффективность применяемых в клинической практике гепатопротекторов обусловлена наличием в их составе компонентов с различными механизмами действия. Потребность в разработке новых фармацевтических препаратов для защиты печени от возможных токсических эффектов сохраняется, поскольку далеко не всегда гепатопротекторы могут минимизировать вредные эффекты ксенобиотика, а применение специфических антидотов ограничено использованием N-ацетилцистеина при передозировке парацетамола [2]. Разработка эффективных методов терапии лекарственных поражений печени требует исследования механизмов развития токсических поражений клеток печени и выбора потенциальных гепатопротекторов и специфичных антидотов.

Для антиаритмического средства амиодарона характерны частые побочные эффекты, проявляющиеся симптомами лекарственного поражения печени. Благодаря высокой эффективности и широкому спектру действия амиодарон является одним из наиболее часто назначаемых антиаритмических средств [3].

В 10–15% случаев прием амиодарона сопровождает появление побочных эффектов в виде повышения уровня сывороточных трансаминаз, фосфолипидоза и стеатогепатита. Длительное применение амиодарона может приводить к развитию острой печеночной недостаточности, иногда приводящей к летальным исходам [4].

Развитие поражения печени в результате приема амиодарона обусловлено его цитотоксическими эффектами. Известно, что амиодарон и его метаболиты (в основном моно- и ди-N-дезэтиламиодарон) подавляют работу электронтранспортной цепи и разобщают окислительное фосфорилирование, что должно сопровождаться накоплением активных форм кислорода и развитием окислительного стресса [5, 6]. Об окислительном стрессе свидетельствует увеличение количества маркеров пероксидного окисления липидов после воздействия амиодарона [7]. Кроме того, амиодарон обладает способностью ингибировать фосфолипазу А и β-окисление длинноцепочечных жирных кислот, что способствует накоплению липидов в клетках печени [8, 9]. Одновременно снижаются уровни АТФ внутри клетки и ионов кальция, развиваются повреждения эндоплазматического ретикулума [10].

Ранее на клеточной линии фибробластов мыши L929 было показано, что применение антиоксидантов аскорбиновой кислоты и N-ацетилцистеина, способствует снижению цитотоксичности амиодарона [11]. Нами исследована способность неспецифических гепатопротекторных соединений с антиоксидантными свойствами (витамина Е и серосодержащих N-ацетилцистеина и S-аденозилметионина) оказывать влияние на цитотоксические свойства амиодарона.

Витамин Е давно известен как цитопротекторный агент и рекомендован к применению в терапии воспалительных и дегенеративных заболеваний печени, в частности при неалкогольной жировой болезни печени и стеатогепатите [12]. N-ацетил-L-цистеин (NAC) является эффективным антидотом при передозировке парацетамола. Также его предлагают использовать в терапии поражения печени другими лекарствами [13]. S-аденозил-L-метионин (SAM) — главный донор метильных групп в организме, а также играет важную роль в метаболизме ксенобиотиков в печени. В связи с этим его тоже рассматривают в качестве гепатопротектора при различных заболеваниях печени. Однако в клинической практике гепатопротекторное действие SAM не подтверждено рандомизированными плацебо-контролируемыми исследованиями [14].

Для исследований цитотоксических эффектов в отношении гепатоцитов in vitro применяют клеточные тест-системы на основе первичных культур гепатоцитов человека или иммортализованных клеточных линий. В своем исследовании мы использовали клеточную линию гепатомы человека HepaRG. Клетки этой линии обеспечивают экспрессию ферментов биотрансформации (в частности, цитохромов P450) и транспортных белков на уровнях, близких к первичным гепатоцитам человека, что позволяет считать данную линию оптимальной для моделирования гепатотоксических эффектов in vitro [15, 16]. В исследованиях оценки потенциальной гепатотоксичности лекарственных средств с использованием многопараметрического анализа клеточная линия HepaRG показала наибольшую чувствительность [17, 18].

Таким образом, целью работы было исследование цитопротекторного действия антиоксидантов в модели амиодарон-индуцированной цитотоксичности клеток гепатомы человека линии HepaRG.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки гепатомы человека линии HepaRG (Gibco; США) культивировали в полной питательной среде, которая состояла из среды Williams’E с 10% фетальной бычьей сыворотки, 5 мкг/мл инсулина, 10 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 50 мкМ гидрокортизона гемисукцината и 2 мM L-глутамина в атмосфере CO₂инкубатора (5% СО₂) при температуре 37 °C и насыщающей влажности.

Для определения цитотоксичности амиодарона использовали оборудование xCELLigence RTCA (ACEA; США). С помощью программного обеспечения RTCA Software 2.0 (ACEA; США) на основании анализа изменений импеданса во времени рассчитывали клеточный индекс, характеризующий жизнеспособность клеток. До начала эксперимента измеряли значение импеданса для питательной среды в отсутствие клеток, затем в каждую лунку 96-луночного планшета вносили по 10 тыс. клеток линии HepaRG и культивировали в течение суток. После этого в среду добавляли амиодарон (в диапазоне концентраций от 0,1 до 100 мкМ) и исследуемые антиоксиданты (витамин Е, NAC и SAM в концентрации 100 мкМ). В качестве контроля использовали клетки в полной питательной среде.

Оценку молекулярных маркеров повреждения клеток проводили с использованием иммунофлуоресцентного анализатора Bio-Plex 200 (Bio-Rad; США). Маркеры апоптоза оценивали в клеточных лизатах, а маркеры повреждения гепатоцитов в кондиционных средах. Для получения кондиционных сред и лизатов клетки гепатомы человека линии HepaRG вносили в 24-луночный планшет в количестве 400 тыс. клеток на лунку и культивировали в полной питательной среде. На следующий день после пассажа осуществляли замену среды на среду, содержащую амиодарон в концентрации 10 мкМ, исследуемые антиоксиданты в концентрации 100 мкМ. Инкубировали образцы в течение 24 и 48 ч. Каждую экспериментальную концентрацию изучаемых соединений вносили не менее чем в трех повторах. Для мультиплексного анализа использовали следующие наборы: MILLIPLEX MAP Human Liver Injury Magnetic Bead Panel (Cat.HLINJMAG-75K; Merck, США), MILLIPLEX MAP Human Early Apoptosis Magnetic Bead 6-Plex Kit (Cat. 48-669MAG; Merck, США) и панель Bio-PlexPro™ Human Cytokine 27-plex (Cat.M500KCAF0Y; Bio-Rad, США).

Определение АТФ в лизатах клеток линии HepaRG выполняли с использованием набора ATP Bioluminescent Assay Kit (Cat. FLASC; Sigma-Aldrich, США). Интенсивность люминесценции измеряли на планшетном флуориметре FLx800 (BioTek; США). Первичную обработку результатов проводили с помощью программного обеспечения Gen5 1.10 (BioTek; США).

Для статистического анализа и построения графиков использовали программное обеспечение SigmaPlot 12.5 (SystatSoftware Inc; США). Нормальность выборки оценивали по критерию Шапиро–Уилка. Для сравнения значимости различий средних использовали однофакторный дисперсионный анализ в случае нормального распределения и тест Краскела–Уоллиса в случае распределения, отличающегося от нормального. Статистическую значимость различий принимали при р < 0,05. Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Рассчитанная в результате мониторинга цитотоксичности IC₅₀ амиодарона для клеток гепатомы человека линии HepaRG составила 3,5 мкМ (рис. 1). Использование гепатопротекторов с антиоксидантными свойствами привело к статистически значимому повышению клеточного индекса по сравнению с амиодароном. Так, значение IC₅₀, определенное для амиодарона в присутствии витамина Е, оказалось равным 19 мкМ, для N-ацетилцистеина — 24 мкМ, для S-аденозилметионина — 22 мкМ.

Для оценки механизмов цитотоксичности амиодарона проанализировали содержание некоторых киназ, регулирующих клеточный цикл в клеточных лизатах, а также содержание внутриклеточных ферментов в кондиционных средах. Воздействие амиодарона (10 мкМ) на клетки в течение 24 и 48 ч приводило к снижению уровней фосфорилированных AKT и JNK киназ, а также белка p53 (рис. 2). Иными словами, амиодарон вызывает снижение активности факторов, регулирующих клеточный цикл, и способствует запуску клеточной гибели, чем можно объяснить его высокую цитотоксичность. В лизатах клеток после обработки амиодароном (10 мкМ) в присутствии витамина Е или S-аденозилметионина cодержание активных форм AKT и JNK киназ не отличалось от контроля.

В результате исследования установлено, что амиодарон в концентрациях 10 и 50 мкМ приводит к существенному снижению уровня АТФ в лизатах клеток HepaRG, при этом снижение АТФ было дозозависимым (рис. 3). Витамин Е обеспечивал статистически значимое увеличение содержания внутриклеточного АТФ при обработке клеток амиодароном.

При оценке внеклеточных уровней ферментов было показано, что после обработки клеток амиодароном не происходит статистически значимого повышения уровня аргиназы 1 (рис. 4). Через 24 ч инкубации в присутствии амиодарона наблюдали повышение содержания малатдегидрогеназы 1, глутатион-S-трансферазы и сорбитолдегидрогеназы в кондиционной среде (рис. 4, рис. 5). Содержание 5'-нуклеотидазы статистически значимо повышалось через 48 ч. В присутствии витамина Е и S-аденозилметионина отмечено снижение содержания внутриклеточных ферментов MDH1, GSTα и SDH в кондиционной среде.

Анализ содержания цитокинов после инкубации клеток линии HepaRG в среде с амиодароном (10 мкМ) показал, что в результате действия амиодарона происходит статистически значимое и наиболее выраженное увеличение содержания провоспалительных факторов IL1β, IL6, IL8, IFNγ, TNFα (рис. 6). Одновременно отмечено и увеличение содержания противовоспалительного цитокина IL10. Эффект антиоксидантов проявился в снижении содержания анализируемых цитокинов в кондиционных средах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Сообщения о побочных эффектах применения амиодарона появились в конце XX в., после начала его широкого использования в качестве антиаритмического средства [19]. По своей структуре амиодарон относится к катионным амфифильным веществам, кроме того, он имеет длительный период полувыведения в завершающей фазе элиминации, который может достигать 150 дней [8]. Амиодарон и его метаболиты способны накапливаться в легких, скелетных мышцах, жировой ткани, печени и оказывать токсическое действие. При этом степень повреждения печени существенно варьирует от незначительного повышения уровня трансаминаз в сыворотке крови до острой печеночной недостаточности [4].

Длительный прием амиодарона per os приводит к накоплению жирных кислот и полярных липидов в гепатоцитах в результате угнетения фосфолипазы А и ферментов β-окисления жирных кислот. Накопление амиодарона отмечено в лизосомных липидных бислоях, что препятствует нормальной внутриклеточной деградации мембранных фосфолипидов и приводит к фосфолипидозу [8, 20]. На клеточной линии гепатомы человека HepaRG было показано накопление триглицеридов и липидных капель после 14-дневной инкубации с амиодароном в концентрации 20 мкМ [21].

При этом механизмы развития гепатотоксических эффектов амиодарона до сих пор малоизучены.

Мы определили дозозависимое цитотоксическое действие амиодарона на клетки линии HepaRG в течение трех суток и рассчитали IC₅₀, которая составила 3,5 мкМ. Ранее цитотоксичность амиодарона была показана на клетках линии HepG2, где IC₅₀ составила 105 мкМ [7]. При этом клетки линии HepaRG демонстрируют более высокий уровень экспрессии ферментов системы цитохромов P450 по сравнению с линией HepG2. А метаболиты амиодарона (моно- и ди-N-дезэтиламиодарон), образующиеся после трансформации цитохромами, могут проявлять более высокую гепатотоксичность по сравнению с амиодароном [18].

Увеличение внутриклеточного содержания активных (фосфорилированных) форм киназ, регулирующих амиодарона, является повреждение митохондрий. Уровень активной инициаторной каспазы-8 также снижается после обработки клеточной культуры амиодароном, что позволяет говорить о том, что гибель клетки идет по пути некроза, а не апоптоза.

Известно, что количество внутриклеточного АТФ является одним из показателей жизнеспособности клеток [23]. Истощение внутриклеточных запасов АТФ относят к одной из характерных черт некроза [24]. Выявленное снижение содержания АТФ в клетках и выход внутриклеточных ферментов в кондиционную среду также свидетельствуют о клеточной гибели по типу некроза.

Установлено также, что воздействие амиодарона приводит к увеличению содержания в кондиционной среде провоспалительных цитокинов IL1β, IL6, IL8, IFNγ, TNFα и противовоспалительного IL10.

Высвобождаемые при повреждении клеток внутриклеточные ферменты, цитокины и молекулярные паттерны DAMP, ассоциированные с повреждениями (danger associated molecular patterns), вызывают активацию иммунных клеток врожденного иммунитета [25]. Активированные клетки Купфера, нейтрофилы и другие резидентные клетки печени выделяют различные цитокины, что может приводить к запуску апоптоза через рецепторы смерти и развитию воспалительного ответа [22]. Таким образом, воздействие амиодарона может вызывать как некроз, так и апоптоз, что согласуется с ранее опубликованными данными о цитостатических эффектах амиодарона [26, 27].

Таким образом, на модели гепатомы человека линии HepaRG показано, что гибель клеток, вызванная воздействием амиодарона в течение 48 ч, происходит в результате некроза.

Предполагается, что одной из основных причин цитотоксичности амиодарона является окислительный стресс [7]. Ранее на различных клеточных моделях (первичные гепатоциты крыс, клетки линии HepG2, L929) было продемонстрировано, что антиоксиданты защищают клетки от цитотоксического действия амиодарона [7, 11, 28]. Мы исследовали влияние соединений с антиоксидантными свойствами на амиодарон-индуцированную цитотоксичность в клетках гепатомы человека линии HepaRG. Витамин Е, S-аденозилметионин и N-ацетилцистеин снижают цитотоксичность амиодарона и приводят к увеличению величины IC₅₀. Витамин Е и S-аденозилметионин обеспечивали снижение секреции ключевых провоспалительных цитокинов IL1β и IL6, индуцированное амиодароном.

Вышеперечисленные результаты подтверждают, что амиодарон может индуцировать в клетке развитие окислительного стресса. Исследованные нами витамин Е, S-аденозилметионин и N-ацетилцистеин являются зарегистрированными лекарственными средствами и могут быть рекомендованы в качестве гепатопротекторов при терапии амиодароном.

ВЫВОДЫ

Амиодарон оказывает на клетки гепатомы человека линии HepaRG цитотоксическое действие (IC₅₀ — 3,5 мкМ). Клеточная гибель развивается на фоне снижения активных форм факторов, регулирующих клеточный цикл, таких как киназы AKT, JNK и белок p53. Действие амиодарона приводит к цитолизу, сопровождающемуся повышением содержания внутриклеточных ферментов (MDH1, GSTα, SDH и 5'-NT) в кондиционной среде. Исследованные соединения с антиоксидантными свойствами витамин Е, N ацетилцистеин и S-аденозилметионин снижают цитотоксичность амиодарона в клетках гепатомы человека линии HepaRG и могут быть рассмотрены как потенциальные гепатопротекторы при лечении амиодароном.