ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ

Оценка методов инактивирования аденовируса птиц при производстве гриппозных вакцин

Н. Н. Савина1, А. А. Екимов1, В. П. Трухин1, А. Э. Евтушенко1, Е. Н. Жиренкина1, Е. О. Синегубова2, А. В. Слита2
Информация об авторах

1 Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток и предприятие по производству бактерийных препаратов Федерального медико-биологического агентства, Санкт-Петербург, Россия

2 Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург, Россия

Для корреспонденции: Наталья Николаевна Савина
ул. Свободы, д. 52, г. Красное Село, г. Санкт-Петербург, 198320; ur.sviinbps@anivas.n.n

Информация о статье

Вклад авторов: все авторы внесли равнозначный вклад в разработку методики исследования, получение, анализ и интерпретацию данных, в написание и редактирование статьи.

Соблюдение этических стандартов: исследование проведено с соблюдением этических принципов Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации 1964 г. и последующих ее пересмотров.

Статья получена: 18.08.2021 Статья принята к печати: 12.09.2021 Опубликовано online: 26.09.2021
|

Процесс производства гриппозных инактивированных вакцин включает стадию инактивации вируса гриппа для обеспечения безопасности готового препарата. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения и Европейского медицинского агентства [1, 2], стадия инактивации должна обеспечивать полную инактивацию вируса гриппа, однако, кроме вируса гриппа полупродукты могут содержать и контаминанты, наиболее значимые из которых вирус лейкоза птиц, аденовирус птиц, микоплазма. Согласно регламентирующей документации, процесс инактивации должен быть эффективен и в отношении перечисленных контаминантов.

Инактивация в технологическом процессе производства может быть проведена как физическими методами, так и химическими. В качестве физического метода чаще всего используют облучение УФ-излучением, а химического воздействием алкилирующих реагентов, таких как β-пропиолактон [3].

Аденовирусная инфекция птиц протекает хронически у птиц и летальна у куриных эмбрионов (КЭ). Аденовирусы птиц объединены в род Aviadenovirus. В настоящее время насчитывают 12 различных серотипов аденовирусов птиц, относящихся к группам CELO (Chicken Embrio Lethal Orphan), GAL (Gallus Adeno-Like virus), и один тип — возбудитель синдрома снижения яйценоскости EDS-76 [4].

Аденовирусная инфекция у кур проявляется как гепатит с тельцами включения, синдром гепатита-гидроперикарда и эрозия желудка, а также респираторными заболеваниями, отставанием в росте, воспалением суставов [5].

Аденовирусная инфекция птиц часто выступает в роли вторичного фактора при иных инфекционных болезнях, особенно при инфекционном бронхите кур, микоплазмозе и других заболеваниях дыхательных путей птицы.

Важно также отметить, что в птицехозяйствах Российской Федерации периодически возникают вспышки болезней, причиной которых являются и аденовирусы птиц [6, 7].

В литературе описаны методы инактивации аденовируса при помощи формальдегида [8], однако данные исследования затрагивают культивирование вируса гриппа и аденовируса с использованием культур клеток MDCK, что не может быть экстраполировано на эмбриональную технологию получения гриппозных вакцин. Известно также, что использование формальдегида в большей степени, чем β-пропиолактон, снижает иммуногенность вакцины из-за инактивации, β-пропиолактон обладает большей эффективностью в отношении инактивации вируса гриппа [9].

Приоритетное использование β-пропиолактона в отличие от формальдегида в качестве инактивирующего агента обусловлено тем, что β-пропиолактон гидролизуется до 3-гидроксипропионовой кислоты, которая является промежуточным метаболитом липидного обмена человека [10], что непосредственно влияет на безопасность вакцины.

Целью настоящего исследования было выбрать оптимальный агент для инактивирования контаминанта гриппозных вакцин аденовируса птиц, в частности наиболее распространенных групп CELO и GAL (штамм Fontes), а также выбрать минимальную длительность стадии инактивации для гарантированного снижения вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg (БОЕ)/мл [11].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Аденовирус птиц Adenoviridae, Aviadenovirus, Fowl adenovirus A, Fowl adenovirus 1, штамм Phelps (CELO), ATCC VR-432 (коллекция ATCC; США).

Аденовирус птиц Adenoviridae, Aviadenovirus, Fowl adenovirus D, Fowl adenovirus 2, штамм Fontes, ATCC VR280 (коллекция ATCC; США).

Клетки HEp-2 (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Клетки MA-104 (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Клетки Vero (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Культивирование аденовирусов птиц штаммов CELO и Fontes и определение их инфекционной активности

Эксперименты по определению оптимальной культуры клеток для накопления вирусов проводили на линиях клеток Vero B, MA-104 и HEp-2. Клетки культивировали в ростовой среде альфа-МЕМ с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Для эксперимента использовали поддерживающую питательную среду (ППС), которая отличалась от ростовой тем, что в ее состав входило не 10, а 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для исследования клетки выращивали во флаконах (площадь дна 25 см2) для культуральных работ при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO2; посевная доза составила 500 тыс. клеток/мл. Клетки культивировали в течение ночи до формирования монослоя.

Клетки инфицировали изучаемыми вирусными агентами и культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO2 до деструкции 80–90% монослоя. Флаконы замораживали при –20 °C и после оттаивания определяли инфекционный титр вирусов, как описано ниже.

Клетки изучаемых линий рассевали на 24-луночные планшеты (посевная доза 500 тыс. клеток/мл) и культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO2 в течение ночи до формирования монослоя. Из вирусосодержащего материала готовили серию 10-кратных разведений от 10–1 до 10–7. Полученными разведениями инфицировали клетки в лунках планшета и инкубирoвaли 30 мин при кoмнaтнoй темперaтуре. Пo истечении указанного времени клетки прoмывaли cредoй и вносили cреду MEM с жидким aвицеллoм (SigmaAldrich; CШA) в cooтнoшении 1 : 1. Пocле этoгo планшеты инкубировали 96 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO2. По истечении этого времени в лунки внocили пo 1 мл 0,1%-го cпиртoвoгo рacтвoрa криcтaлвиoлетa и oкрaшивaли в течение 15 мин, после чего лунки промывали дистиллированной водой, подсушивали при кoмнaтнoй темперaтуре и пoдcчитывaли чиcлo вируcных бляшек в кaждoй лунке. На основании полученных данных рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча [12], который выражали в БОЕ/мл.

Получение вирусосодержащей аллантоисной жидкости

Для культивирования вируса гриппа использовали 9–11-дневные куриные эмбрионы. Заражение куриных эмбрионов проводили дозой 0,2 мл c инфекционной активностью 102,0–104,5 и эффективной инфекционной дозой, равной 50 (ЭИД50). Инкубацию куриных эмбрионов осуществляли при 35 °С в течение 48 ч для вируса гриппа типа А и в течение 72 ч для вируса гриппа типа В. После инкубации эмбрионы охлаждали и собирали вирусосодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ).

Получение вирусных концентратов (ВК)

ВАЖ подвергали фильтрации через каскад фильтров с диаметром пор 10, 6 и 1 мкм с последующим концентрированием с использованием ультрафильтрационной установки с пределом отсечения 300 кДа. Сконцентрированную вирусосодержащую аллантоисную жидкость подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы (60–20%). Собирали фракции сахарозного градиента в диапазоне 40–25% сахарозы.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программного пакета Microsoft Excel 365 (Microsoft corp.; США), а также Minitab 19 (Minitab Inc.; США). Доверительные интервалы рассчитаны для доверительной вероятности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор оптимальной клеточной линии для культивирования аденовирусов птиц

Для оптимизации процесса культивирования аденовирусов птиц были использованы три клеточные линии: Vero, MA-104 и HEp-2 как наиболее часто применяемые для культивирования аденовирусов. Результаты изучения инфекционной активности вирусов в этих линиях представлены в табл. 1.

Оба аденовируса птиц репродуцировались в клетках Vero более чем на два порядка более эффективно, чем в линиях MA-104 и HEp-2. Полученные данные свидетельствуют, что линия Vero является наиболее пермиссивной для обоих аденовирусов птиц.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусосодержащей аллантоисной жидкости β-пропиолактоном

Для моделирования инфицирования вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВАЖ добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так, чтобы конечное его содержание составляло не менее 105 БОЕ/мл. Полученную смесь подвергали инактивации β-пропиолактоном (0,09% в конечной смеси) и определяли значение титра аденовируса птиц в образцах. Динамика инактивации представлена на рис. 1.

Снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg БОЕ/ мл происходило не менее чем через 10 ч после добавления β-пропиолактона, что обусловливает необходимость проведения инактивации вирусосодержащей аллантоисной жидкости в технологическом процессе получения гриппозных препаратов не менее 10 ч.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусных концентратах с помощью ультрафиолетового облучения

Для моделирования инфицирования ВК аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВК добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так чтобы конечное его содержание составляло не менее 105 БОЕ/мл. Контаминированный ВК помещали в чашки Петри с диаметром 90 мм. Чашки с образцами устанавливали под установкой из четырех ультрафиолетовых ламп (общей мощностью 60 Вт) на расстоянии 20 см. Проводили облучение по схеме: 1-я чашка 0 с;

2-я чашка 30 с;

3-я чашка 1 мин;

4-я чашка 2 мин;

5-я чашка 5 мин.

Через указанные промежутки времени из чашек отбирали пробы ВК объемом 1 мл, в которых определяли инфекционный титр вируса при помощи бляшкообразования. Динамика инактивации представлена на рис. 2.

Снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg БОЕ/мл происходит не менее чем через 5 мин действия УФ-излучения, что обусловливает необходимость проведения инактивации вирусосодержащей аллантоисной жидкости в технологическом процессе получения гриппозных препаратов не менее 5 мин действия УФ-излучения.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусных концентратах с использованием детергентов

Для моделирования инфицирования ВК аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВК добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так, чтобы конечное его содержание составляло не менее 105 БОЕ/мл. К контаминированным ВК добавляли предварительно растворенные в фосфатно-солевом буфере детергенты н-октил-β-D-глюкопиранозид (соотношение общего белка к детергенту 1/8) и тетрадецилтриметиламмоний бромид (ТДТАБ) (соотношение общего белка к детергенту 1/0,5) и определяли значение титра аденовируса птиц в образцах. Динамика инактивации представлена на рис. 3 и рис. 4.

Снижение титра аденовируса при действии детергентов на 1 lg БОЕ/мл происходило спустя 1 ч расщепления вируса гриппа детергентами, а именно на 0,93 ± 0,15 lg и 1,04 ± 0,12 lg для штаммов CELO и Fontes соответственно при использовании н-октил-β-D-глюкопиранозида и 1,18 ± 0,17 lg и 1,12 ± 0,38 lg при использовании тетрадецилтриметиламмония бромида.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По результатам исследования, инактивация как β-пропиолактоном, так и УФ-излучением эффективна в отношении контаминанта аденовируса штаммов Fontes и CELO, однако вариабельность результатов при действии УФ-излучения выше (табл. 2).

Полученные данные могут свидетельствовать о меньшей стабильности процесса инактивации и как следствие повышении риска выпуска некачественной гриппозной вакцины. Большинство фармацевтических производителей, как отечественных, так и зарубежных, инактивируют вирус гриппа химическим способом.

В частности, компании Novartis, ID Biomedical Corp of Quebec и ФГУП СПбНИИВС ФМБА России для производства гриппозной вакцины используют инактивацию β-пропиолактоном [1315]. Таким образом, используемый способ инактивации может гарантированно инактивировать не только вирус гриппа, но и возможный контаминант аденовирус птиц.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования была выбрана оптимальная клеточная линия для культивирования аденовирусов птиц Fontes и CELO. Показано, что линия Vero обеспечивает репродукцию вирусов примерно на два порядка выше по сравнению с линиями клеток Hep-2 и МА104. Выявлено, что минимальное время инактивирования аденовивирус содержащей аллантоисной жидкости с использованием β-пропиолактона при получении гриппозных вакцин, составляет 10 ч, что гарантированно снижает нагрузку аденовируса птиц на 4 lg БОЕ/мл. В случае использования УФ-излучения для инактивации вирусных концентратов время инактивации должно составлять не менее 5 мин экспозиции, что гарантированно снижает нагрузку аденовируса птиц на 4 lg БОЕ/мл. Дополнительное снижение нагрузки аденовируса птиц на 1 lg БОЕ/мл происходит после добавления детергентов при получении гриппозных расщепленных вакцин. Таким образом, технология получения гриппозных вакцин, включающая стадии инактивирования аллантоисной жидкости β-пропиолактоном в течение 10 ч с последующим добавлением детергента через 1 ч, гарантированно обеспечивает полное инактивирование аденовирусов птиц. Однако аденовирус является не единственным возможным контаминантом и на следующем этапе представляется необходимым изучение кинетики инактивации β-пропиолактоном вируса лейкоза птиц и микоплазмы.

КОММЕНТАРИИ (0)