Процесс производства гриппозных инактивированных вакцин включает стадию инактивации вируса гриппа для обеспечения безопасности готового препарата. Согласно рекомендациям Всемирной организации здравоохранения и Европейского медицинского агентства [1, 2], стадия инактивации должна обеспечивать полную инактивацию вируса гриппа, однако, кроме вируса гриппа полупродукты могут содержать и контаминанты, наиболее значимые из которых — вирус лейкоза птиц, аденовирус птиц, микоплазма. Согласно регламентирующей документации, процесс инактивации должен быть эффективен и в отношении перечисленных контаминантов.

Инактивация в технологическом процессе производства может быть проведена как физическими методами, так и химическими. В качестве физического метода чаще всего используют облучение УФ-излучением, а химического — воздействием алкилирующих реагентов, таких как β-пропиолактон [3].

Аденовирусная инфекция птиц протекает хронически у птиц и летальна у куриных эмбрионов (КЭ). Аденовирусы птиц объединены в род Aviadenovirus. В настоящее время насчитывают 12 различных серотипов аденовирусов птиц, относящихся к группам CELO (Chicken Embrio Lethal Orphan), GAL (Gallus Adeno-Like virus), и один тип — возбудитель синдрома снижения яйценоскости EDS-76 [4].

Аденовирусная инфекция у кур проявляется как гепатит с тельцами включения, синдром гепатита-гидроперикарда и эрозия желудка, а также респираторными заболеваниями, отставанием в росте, воспалением суставов [5].

Аденовирусная инфекция птиц часто выступает в роли вторичного фактора при иных инфекционных болезнях, особенно при инфекционном бронхите кур, микоплазмозе и других заболеваниях дыхательных путей птицы.

Важно также отметить, что в птицехозяйствах Российской Федерации периодически возникают вспышки болезней, причиной которых являются и аденовирусы птиц [6, 7].

В литературе описаны методы инактивации аденовируса при помощи формальдегида [8], однако данные исследования затрагивают культивирование вируса гриппа и аденовируса с использованием культур клеток MDCK, что не может быть экстраполировано на эмбриональную технологию получения гриппозных вакцин. Известно также, что использование формальдегида в большей степени, чем β-пропиолактон, снижает иммуногенность вакцины из-за инактивации, β-пропиолактон обладает большей эффективностью в отношении инактивации вируса гриппа [9].

Приоритетное использование β-пропиолактона в отличие от формальдегида в качестве инактивирующего агента обусловлено тем, что β-пропиолактон гидролизуется до 3-гидроксипропионовой кислоты, которая является промежуточным метаболитом липидного обмена человека [10], что непосредственно влияет на безопасность вакцины.

Целью настоящего исследования было выбрать оптимальный агент для инактивирования контаминанта гриппозных вакцин — аденовируса птиц, в частности наиболее распространенных групп CELO и GAL (штамм Fontes), а также выбрать минимальную длительность стадии инактивации для гарантированного снижения вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg (БОЕ)/мл [11].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

Аденовирус птиц Adenoviridae, Aviadenovirus, Fowl adenovirus A, Fowl adenovirus 1, штамм Phelps (CELO), ATCC VR-432 (коллекция ATCC; США).

Аденовирус птиц Adenoviridae, Aviadenovirus, Fowl adenovirus D, Fowl adenovirus 2, штамм Fontes, ATCC VR280 (коллекция ATCC; США).

Клетки HEp-2 (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Клетки MA-104 (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Клетки Vero (коллекция клеточных линий НИИЭМ им. Пастера; Россия).

Культивирование аденовирусов птиц штаммов CELO и Fontes и определение их инфекционной активности

Эксперименты по определению оптимальной культуры клеток для накопления вирусов проводили на линиях клеток Vero B, MA-104 и HEp-2. Клетки культивировали в ростовой среде альфа-МЕМ с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки крупного рогатого скота (Gibco), 2 мМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина. Для эксперимента использовали поддерживающую питательную среду (ППС), которая отличалась от ростовой тем, что в ее состав входило не 10, а 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота. Для исследования клетки выращивали во флаконах (площадь дна 25 см²) для культуральных работ при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO₂; посевная доза составила 500 тыс. клеток/мл. Клетки культивировали в течение ночи до формирования монослоя.

Клетки инфицировали изучаемыми вирусными агентами и культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO₂ до деструкции 80–90% монослоя. Флаконы замораживали при –20 °C и после оттаивания определяли инфекционный титр вирусов, как описано ниже.

Клетки изучаемых линий рассевали на 24-луночные планшеты (посевная доза — 500 тыс. клеток/мл) и культивировали при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO₂ в течение ночи до формирования монослоя. Из вирусосодержащего материала готовили серию 10-кратных разведений от 10^–1 до 10^–7. Полученными разведениями инфицировали клетки в лунках планшета и инкубирoвaли 30 мин при кoмнaтнoй темперaтуре. Пo истечении указанного времени клетки прoмывaли cредoй и вносили cреду MEM с жидким aвицеллoм (SigmaAldrich; CШA) в cooтнoшении 1 : 1. Пocле этoгo планшеты инкубировали 96 ч при 37 °С в атмосфере, содержащей 5% СO₂. По истечении этого времени в лунки внocили пo 1 мл 0,1%-го cпиртoвoгo рacтвoрa криcтaлвиoлетa и oкрaшивaли в течение 15 мин, после чего лунки промывали дистиллированной водой, подсушивали при кoмнaтнoй темперaтуре и пoдcчитывaли чиcлo вируcных бляшек в кaждoй лунке. На основании полученных данных рассчитывали титр вируса по методу Рида и Менча [12], который выражали в БОЕ/мл.

Получение вирусосодержащей аллантоисной жидкости

Для культивирования вируса гриппа использовали 9–11-дневные куриные эмбрионы. Заражение куриных эмбрионов проводили дозой 0,2 мл c инфекционной активностью 102,0–104,5 и эффективной инфекционной дозой, равной 50 (ЭИД₅₀). Инкубацию куриных эмбрионов осуществляли при 35 °С в течение 48 ч для вируса гриппа типа А и в течение 72 ч — для вируса гриппа типа В. После инкубации эмбрионы охлаждали и собирали вирусосодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ).

Получение вирусных концентратов (ВК)

ВАЖ подвергали фильтрации через каскад фильтров с диаметром пор 10, 6 и 1 мкм с последующим концентрированием с использованием ультрафильтрационной установки с пределом отсечения 300 кДа. Сконцентрированную вирусосодержащую аллантоисную жидкость подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы (60–20%). Собирали фракции сахарозного градиента в диапазоне 40–25% сахарозы.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программного пакета Microsoft Excel 365 (Microsoft corp.; США), а также Minitab 19 (Minitab Inc.; США). Доверительные интервалы рассчитаны для доверительной вероятности 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выбор оптимальной клеточной линии для культивирования аденовирусов птиц

Для оптимизации процесса культивирования аденовирусов птиц были использованы три клеточные линии: Vero, MA-104 и HEp-2 как наиболее часто применяемые для культивирования аденовирусов. Результаты изучения инфекционной активности вирусов в этих линиях представлены в табл. 1.

Оба аденовируса птиц репродуцировались в клетках Vero более чем на два порядка более эффективно, чем в линиях MA-104 и HEp-2. Полученные данные свидетельствуют, что линия Vero является наиболее пермиссивной для обоих аденовирусов птиц.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусосодержащей аллантоисной жидкости β-пропиолактоном

Для моделирования инфицирования вирусосодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВАЖ добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так, чтобы конечное его содержание составляло не менее 10⁵ БОЕ/мл. Полученную смесь подвергали инактивации β-пропиолактоном (0,09% в конечной смеси) и определяли значение титра аденовируса птиц в образцах. Динамика инактивации представлена на рис. 1.

Снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg БОЕ/ мл происходило не менее чем через 10 ч после добавления β-пропиолактона, что обусловливает необходимость проведения инактивации вирусосодержащей аллантоисной жидкости в технологическом процессе получения гриппозных препаратов не менее 10 ч.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусных концентратах с помощью ультрафиолетового облучения

Для моделирования инфицирования ВК аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВК добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так чтобы конечное его содержание составляло не менее 10⁵ БОЕ/мл. Контаминированный ВК помещали в чашки Петри с диаметром 90 мм. Чашки с образцами устанавливали под установкой из четырех ультрафиолетовых ламп (общей мощностью 60 Вт) на расстоянии 20 см. Проводили облучение по схеме: 1-я чашка — 0 с;

2-я чашка — 30 с;

3-я чашка — 1 мин;

4-я чашка — 2 мин;

5-я чашка — 5 мин.

Через указанные промежутки времени из чашек отбирали пробы ВК объемом 1 мл, в которых определяли инфекционный титр вируса при помощи бляшкообразования. Динамика инактивации представлена на рис. 2.

Снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg БОЕ/мл происходит не менее чем через 5 мин действия УФ-излучения, что обусловливает необходимость проведения инактивации вирусосодержащей аллантоисной жидкости в технологическом процессе получения гриппозных препаратов не менее 5 мин действия УФ-излучения.

Изучение динамики инактивации аденовируса птиц в вирусных концентратах с использованием детергентов

Для моделирования инфицирования ВК аденовирусами птиц и их инактивации к образцам ВК добавляли 10% по объему предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий аденовирус птиц, так, чтобы конечное его содержание составляло не менее 10⁵ БОЕ/мл. К контаминированным ВК добавляли предварительно растворенные в фосфатно-солевом буфере детергенты н-октил-β-D-глюкопиранозид (соотношение общего белка к детергенту — 1/8) и тетрадецилтриметиламмоний бромид (ТДТАБ) (соотношение общего белка к детергенту — 1/0,5) и определяли значение титра аденовируса птиц в образцах. Динамика инактивации представлена на рис. 3 и рис. 4.

Снижение титра аденовируса при действии детергентов на 1 lg БОЕ/мл происходило спустя 1 ч расщепления вируса гриппа детергентами, а именно на 0,93 ± 0,15 lg и 1,04 ± 0,12 lg для штаммов CELO и Fontes соответственно при использовании н-октил-β-D-глюкопиранозида и 1,18 ± 0,17 lg и 1,12 ± 0,38 lg при использовании тетрадецилтриметиламмония бромида.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

По результатам исследования, инактивация как β-пропиолактоном, так и УФ-излучением эффективна в отношении контаминанта — аденовируса штаммов Fontes и CELO, однако вариабельность результатов при действии УФ-излучения выше (табл. 2).

Полученные данные могут свидетельствовать о меньшей стабильности процесса инактивации и как следствие — повышении риска выпуска некачественной гриппозной вакцины. Большинство фармацевтических производителей, как отечественных, так и зарубежных, инактивируют вирус гриппа химическим способом.

В частности, компании Novartis, ID Biomedical Corp of Quebec и ФГУП СПбНИИВС ФМБА России для производства гриппозной вакцины используют инактивацию β-пропиолактоном [13–15]. Таким образом, используемый способ инактивации может гарантированно инактивировать не только вирус гриппа, но и возможный контаминант — аденовирус птиц.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования была выбрана оптимальная клеточная линия для культивирования аденовирусов птиц Fontes и CELO. Показано, что линия Vero обеспечивает репродукцию вирусов примерно на два порядка выше по сравнению с линиями клеток Hep-2 и МА104. Выявлено, что минимальное время инактивирования аденовивирус содержащей аллантоисной жидкости с использованием β-пропиолактона при получении гриппозных вакцин, составляет 10 ч, что гарантированно снижает нагрузку аденовируса птиц на 4 lg БОЕ/мл. В случае использования УФ-излучения для инактивации вирусных концентратов время инактивации должно составлять не менее 5 мин экспозиции, что гарантированно снижает нагрузку аденовируса птиц на 4 lg БОЕ/мл. Дополнительное снижение нагрузки аденовируса птиц на 1 lg БОЕ/мл происходит после добавления детергентов при получении гриппозных расщепленных вакцин. Таким образом, технология получения гриппозных вакцин, включающая стадии инактивирования аллантоисной жидкости β-пропиолактоном в течение 10 ч с последующим добавлением детергента через 1 ч, гарантированно обеспечивает полное инактивирование аденовирусов птиц. Однако аденовирус является не единственным возможным контаминантом и на следующем этапе представляется необходимым изучение кинетики инактивации β-пропиолактоном вируса лейкоза птиц и микоплазмы.