К противомалярийным препаратам, показавшим свою эффективность при инфекциях, вызванных коронавирусами, относятся производные хинолина — гидроксихлорохин и хлорохин [1]. Препараты имеют схожую химическую структуру и фармакологическое действие, но гидроксихлорохин обладает меньшей токсичностью [2]. Было показано, что ЕС₅₀ гидроксихлорохина в отношении SARS-CoV-2 in vitro при внесении препарата за 1 ч до заражения составляет 4,51–12,96 мкМ, а цитотоксическая доза была в 100 раз выше [2]. При внесении гидроксихлорохина в среду переживания через 2 ч после заражения SARS-CoV-2 EC₅₀ составляет 0,72–6,14 мкМ [3]. Указанные концентрации могут быть достигнуты in vivo после приема препарата в терапевтической дозе 400 мг, учитывая, что его концентрация в легких в 6 раз первышает концентрацию в плазме крови.

К числу других противомалярийных препаратов с доказанной активностью в отношении SARS-CoV-2 в условиях in vitro относится мефлохин [4, 5]. В эксперименте была установлена активность мефлохина в отношении возбудителей ряда опасных вирусных заболеваний [6, 7], в том числе коронавирусов [8–10]. Показано, что мефлохин блокирует цитопатический эффект коронавируса в культуре клеток и препятствует его репликации в концентрациях не более 10 мкМ (4 мкг/л) [9]. Уточнение дозовых диапазонов позволило установить, что подавление репликации in vitro в отношении SARSCoV-2 достигается при добавлении мефлохина к культуре клеток Vero С1008 в концентрациях более 1,25 мкМ (0,5 мкг/мл). При этом концентрация мефлохина, при которой происходит элиминация SARS-CoV-2, может быть достигнута через 2–3 суток после начала приема препарата в дозах, соответствующих терапевтическим [5, 10, 11].

На основании положительных результатов, полученных в ходе экспериментальных и клинических исследований [12, 13], гидроксихлорохин был включен в схему терапии пациентов с COVID-19 во многих странах мира, в том числе и в России [14]. Противовирусная активность мефлохина в отношении SARS-CoV-2, выявленная в эксперименте, послужила основанием для его включения в клинические рекомендации по лечению пациентов с COVID-19, выпущенные Минздравом России в 2020 г. [14].

Несмотря на то что мефлохин был разрешен к применению у пациентов с COVID-19, до настоящего времени не проводилось изучения его влияния на течение заболевания в экспериментах in vivo, а также клинических исследований его эффективности при новой коронавирусной инфекции. Это определило актуальность исследования.

Цель исследования состояла в оценке влияния мефлохина на накопление SARS-CoV-2 в легких инфицированных животных и изучении его эффективности и безопасности в сравнении с гидроксихлорохином для лечения пациентов с COVID-19.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Экспериментальное исследование

Исследование проводили на самцах сирийских хомяков массой 50–70 г (НПО «Дом Фармации»; Россия). Животных содержали в стандартных условиях вивария, со свободным доступом к корму и воде и световым режимом 12 ч / 12 ч. Мефлохин растворяли в 1%-м растворе крахмала и вводили перорально в объеме 100 мкл ежедневно в течение шести дней по схеме: 1 и 2-й дни — 8,8 мг/кг; 3–6-й дни — 3,3 мг/кг. Контрольным животным по аналогичной схеме вводили 1%-й раствор крахмала. В качестве препарата сравнения использовали рибавирин (Dragon Hwa ChemPharm Co. Ltd; Китай), который вводили внутримышечно в дозе 14,3 мг/кг один раз в день в течение шести дней. Число животных в каждой из групп составляло 10 особей.

В работе использовали вирус SARS-CoV-2, вариант В (ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России). Инфицирующий препарат готовили на культуре клеток Vero С1008, множественность инфицирования составила 1 БОЕ (бляшкообразующая единица) на клетку. Активность рабочей культуры вируса составила 7,4 lg БОЕ/мл, цитопатическое действие (ЦПД) — 6,5 ЦПД₅₀/мл. Животных инфицировали перорально в дозе 3 × 10⁵ БОЕ, наблюдение продолжали 7 суток. Сравнивали показатель накопления вируса в легких (lg БОЕ/г) у животных, которым вводили мефлохин, с группой контроля и животными, которым вводили рибавирин, на 1, 2, 4 и 6-е сутки после заражения. Дополнительно рассчитывали коэффициент ингибирования и снижение накопления вируса в легких.

Клиническое исследование

Было проведено открытое рандомизированное многоцентровое сравнительное исследование эффективности и безопасности off-label применения мефлохина и гидроксихлорохина для лечения пациентов с новой коронавирусной инфекцией, вызванной SARSCoV-2  в соответствии с Постановлением Правительства Российской Федерации от 03.04.2020 № 441 в период с 07.04.2020 по 21.07.2020.

Критерии включения пациентов в исследование: пациенты мужского и женского пола в возрасте от 18 лет с легким и средне-тяжелым течением новой коронавирусной инфекции, подтвержденной по результатам ПЦР-теста на вирусную РНК; госпитализация пациента; наличие информированного согласия на участие в исследовании (всего 172 человека). Пациенты со средне-тяжелым течением составляли более 95%. При определении степени тяжести применяли рекомендованную классификацию [14].

Критерии исключения: тяжелое и крайне тяжелое течение COVID-19; неврологические и психические расстройства; психические заболевания в анамнезе; судороги или повышенная судорожная готовность, эпилепсия; кардиомиопатия, ретинопатия; беременность и период лактации; хронические заболевания печени в стадии печеночной недостаточности или обострения; активное злокачественное новообразование; тяжелое неконтролируемое сердечно-сосудистое заболевание; иные заболевания и состояния, не позволившие принять участия в исследовании.

Средний возраст пациентов составил 52,5 года, соотношение мужчин и женщин составляло 45/55. Все пациенты прошли рандомизацию и были распределены в две группы: пациентам 1-й группы (98 человека) назначали мефлохин; пациентам 2-й группы (74 человека) — гидроксихлорохин. Препараты назначали по схемам, рекомендованным Минздравом России [14].

Средняя продолжительность заболевания до скрининга (M ± SD) составляла 8,4 ± 5,35 дней в группе мефлохина и 7,9 ± 4,66 дней в группе гидроксихлорохина. Основными симптомами заболевания были температура более 38,5 °С, сухой кашель, одышка, утомляемость и ощущение заложенности в грудной клетке. Поражение легких по результатам компьютерной томографии (КТ) соответствовало КТ-II – КТ-III.

Продолжительность приема препаратов в обеих группах составляла 7 дней. Через 11 дней после начала приема препарата фиксировали клинический статус пациента. В случае клинического выздоровления пациента выписывали из стационара, а при необходимости продолжения госпитализации наблюдения продолжали.

В качестве первичных конечных точек эффективности использовали показатели клинического улучшения: достижение легкой степени тяжести коронавирусной инфекции; разрешение дыхательной недостаточности.

Вторичные конечные точки: улучшение состояния пациента по данным КТ; достижение оценки «КТ-1 и менее»; разрешение пневмонии; достижение дыхательной недостаточности 1-й степени тяжести (ДН-1); оказание кислородной поддержки.

Для оценки безопасности препаратов проводили анализ частоты нежелательных явления (НЯ) и серьезных нежелательных явлений (СНЯ), а также регистрацию состояний, которые послужили основанием для прекращения применения исследуемых препаратов.

Для статистического анализа использовали пакет прикладных программ SAS версии 9.3. (SAS Institute Inc.; США). Сравнительный анализ параметрических данных был проведен с использованием двухфакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для параметрических показателей, а также сравнения результатов на основе таблиц сопряженности (критерий Хи-квадрат или точный критерий Фишера). Данные проверяли на соответствие закону нормального распределения с помощью критерия Шапиро–Уилка. Для сравнения групп использовали критерий Стьюдента (в случае нормального распределения) или критерий Манна–Уитни. Различия между группами считали статистически значимыми при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная оценка влияния мефлохина на накопление вируса в легочной ткани сирийских хомяков, инфицированных SARS-CoV-2

Результаты оценки уровня инфекционного титра вируса SARS-CoV-2 в ткани легких сирийских хомяков представлены в табл. 1. Для групп мефлохина и рибавирина дополнительно приведены значения показателя снижения уровня накопления вируса и коэффициента ингибирования, которые рассчитывались по отношению к контролю.

На 2-е сутки после инфицирования отмечено снижение вирусной нагрузки у животных, которым вводили мефлохин и рибавирин, хотя различия с контрольной группой были не значимы. На 4-е сутки после инфицирования во всех группах отмечали увеличение вирусной нагрузки. На 6-е сутки титр вируса в легочной ткани в группе мефлохина был статистически значимо ниже (р < 0,05) по сравнению как с группой контроля, так и с группой рибавирина. Снижение уровня накопления SARSCoV-2 по сравнению с контролем составил 1,34 lg, коэффициент ингибирования — 95,5%.

Сравнительная оценка эффективности мефлохина и гидроксихлорохина у пациентов с новой коронавирусной инфекцией

Результаты, полученные при анализе первичных конечных точек, представлены в табл. 2.

Доля пациентов с достижением легкой степени тяжести коронавирусной инфекции в группе мефлохина была значимо (р = 0,021) выше, чем в группе гидроксихлорохина. И хотя среднее время до достижения этой конечной точки быстрее происходило после приема гидроксихлорохина, различия между группами не были статистически значимы (р > 0,05).

Доля пациентов с полным разрешением дыхательной недостаточности (ДН) в группе мефлохина была выше (р < 0,001), чем в группе гидроксихлорохина. Несмотря на то что отмечалось более быстрое разрешение ДН после приема гидроксихлорохина, межгрупповые различия по данному показателю не были статистически значимы.

Результаты, полученные при анализе вторичных конечных точек проведенного клинического исследования, представлены в табл. 3.

При анализе вторичных конечных точек статистически значимых отличий между группами пациентов, принимавших мефлохин и гидроксихлорохин, выявлено не было ни по одному из исследованных показателей. В ходе оценки безопасности в общей сложности было зарегистрировано 165 нежелательных явлений (НЯ) у 85 пациентов (86,73 %) в группе мефлохина и 112 НЯ у 57 пациентов (77,03 %) пациентов в группе гидроксихлорохина (различия между группами статистически не значимы, р = 0,108). Общее количество серьезных нежелательных явлений (СНЯ) составило 5 у четырех пациентов (86,7%) в группе мефлохина и 1 у одного пациента (1,35%) в группе гидроксихлорохина. Характеристика нежелательных явлений представлена в табл. 4.

Другие НЯ, в том числе психические расстройства (с которыми связывают основной риск приема мефлохина), наблюдали в единичных случаях. При этом такие НЯ, как делирий и острый психоз, регистрировали только у одного пациента после приема мефлохина.

У большинства пациентов, принимавших участие в исследовании, регистрировали НЯ легкой степени: 81 (82,7%) пациент (160 событий) после приема мефлохина и 56 (75,7%) пациентов (111 событий) после приема гидроксихлорохина (р = 0,339). НЯ средней степени тяжести зарегистрировали у одного (1,02%) пациента (1 событие — острый психоз) после приема мефлохина и у 0 (0,0%) пациентов после приема гидроксихлорохина (р = 0,99). НЯ тяжелой степени были зарегистрированы у четверых (4,08%) пациентов (5 событий) после приема мефлохина и у одного (1,35%) пациента (1 событие) после приема гидроксихлорохина (р = 0,392):

• в группе мефлохина: снижение насыщения кислородом у четверых пациентов (4,08%), и делирий — у одного (1,02%) пациента;
• в группе сравнения: острый коронарный синдром у одного пациента (1,35%).

Развитие делирия потребовало медикаментозной коррекции (введение нейролептиков), в остальных случаях СНЯ разрешились после отмены препарата.

Связь НЯ с исследуемым препаратом расценивали как «возможная» в одном случае и как «вероятная» в одном случае после приема мефлохина, для остальных НЯ связь была сомнительная или не была установлена как для мефлохина, так и для гидроксихлорохина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В ходе систематического обзора клинических исследований, связанных с применением гидроксихлорохина при новой коронавирусной инфекции, был сделан вывод, что препарат снижает частоту прогрессирования заболевания и ускоряет регресс клинической симптоматики [15], но не влияет на скорость конверсии ПЦР на SARS-CoV-2 [16], сроки госпитализации, смертность и перевод на ИВЛ [17]. Метаанализ клинических исследований показал, что применение гидроксихлорохина сопровождается повышенной смертностью пациентов с COVID-19 [18]. Вместе с тем, такой эффект может быть связан с тем, что дозы препарата, применяемые для лечения новой коронавирусной инфекции, зачастую превышают безопасные [19].

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что эффективность мефлохина при назначении пациентам с новой коронавирусной инфекцией, которая оценивалась по уменьшению выраженности клинической симптоматики и динамике результатов компьютерной томографии, была не ниже, а по ряду показателей превышала эффективность гидроксихлорохина. Безопасность применения мефлохина и гидроксихлорохина у пациентов с новой коронавирусной инфекцией была сопоставима.

В настоящее время противомалярийные препараты исключены из клинических рекомендаций по лечению пациентов с COVID-19 в связи с недоказанной эффективностью и риском развития побочных эффектов. Однако результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что эффект мефлохина в отношении SARS-CoV2 в экспериментах in vivo может быть достигнут при введении препарата в дозах, которые по результатам межвидового переноса были в 3–10 раз меньше, чем разовая доза, рекомендованная для применения у человека при развитии COVID-19 [20]. В связи с этим можно предположить, что подтверждение противовирусной активности мефлохина в более низком диапазоне доз позволит пересмотреть взгляды на его применение при COVID-19 и других вирусных инфекциях.

ВЫВОДЫ

1. При курсовом введении мефлохина в дозах 75–150 мг сирийским хомякам, инфицированным SARS-CoV-2 в дозе 5 × 10⁵ БОЕ, отмечено статистически значимое снижение накопления вируса в ткани легких по сравнению с животными группы контроля, не получавшими лечения, и с группой рибавирина. 2. При назначении пациентам с COVID-19 легкой и средней степени тяжести, подтвержденной по результатам ПЦР-теста на вирусную РНК, мефлохин показал не меньшую эффективность, чем гидроксихлорохин, а по отдельным показателям статистически значимо превосходил его. 3. Результаты оценки безопасности позволяют сделать вывод о сравнимом профиле безопасности мефлохина и гидроксихлорохина при их применении для лечения пациентов с COVID-19 (легкое и средне-тяжелое течение). При этом все регистрировавшиеся нежелательные явления были указаны в инструкции по медицинскому применению препарата.