Метилирование ДНК является наиболее распространенной эпигенетической модификацией, играющей важную роль в регуляции клеточных процессов, прежде всего экспрессии генов и геномной нестабильности [1]. Из всех эпигенетических модификаций наиболее широко изучено гиперметилирование, которое подавляет транскрипцию промоторных областей генов, приводя к уменьшению экспрессии генов или полному их выключению [2]. Однако в последнее время все больше появляется информация о глобальном гипометилировании генов как факторе развития онкогенеза [3].

Являясь достаточно лабильной системой, статус метилирования ДНК в значительной степени зависит от эндогенных факторов (аберрантная активность метилтрансфераз, нарушение работы систем репарации клетки) [4] и экзогенных факторов, в том числе от факторов радиационной природы. Так, в  экспериментальных исследованиях на мышах показано выраженное аномальное метилирование промотора гена опухолевого супрессора p16(INKa) при хроническом низкодозовом воздействии (50 сГр). При этом авторы указывают, что хроническое воздействие радиации в малых дозах является более сильным индуктором эпигенетических эффектов, а значит и дестабилизации генома, чем острое облучение в той же дозе [5].

Однако, несмотря на активное изучение статуса метилирования у человека при воздействии различных неблагоприятных факторов, в настоящее время существуют единичные работы, свидетельствующие об индукции и сохранении в течение длительного времени эпигенетических модификаций в лейкоцитах периферической крови человека после облучения. Имеющиеся результаты ряда исследований демонстрируют, что ионизирующее излучение опосредует стойкое изменение статуса метилирования ДНК в широком диапазоне доз. Так, в исследовании [6] описано радиационно-индуцированное аберрантное метилирование генов GSTP1, CDKN2A, ARF и RASSF1A в отдаленные сроки после облучения у ликвидаторов аварии на ЧАЭС. У рентгенологов, подвергшихся радиационному воздействию в диапазоне малых доз, уровень метилирования генома был достоверно ниже, чем у людей, не подвергавшихся облучению [7]. Гипометилирование было выявлено в исследовании [8]: с увеличением дозы облучения в лимфоцитах крови работников, подвергавшихся профессиональному внешнему облучению, наблюдалось снижение степени метилирования генов апоптоза (BAD, BID, HRK).  Подобный эффект может свидетельствовать о дифференциальном характере ответа эпигенома на радиационное воздействие в низких и высоких дозах.

Для того чтобы сделать надежные выводы о влиянии метилирования ДНК на фенотип, изменения в статусе метилирования промоторных участков генов необходимо представить в контексте изменения паттернов экспрессии генов. Ранее нами было показано, что в отдаленные сроки в клетках периферической крови облученных лиц наблюдается изменение со стороны экспрессии мРНК генов системы гомеостаза и иммунного ответа клеток. В частности, в отдаленные сроки у хронически облученных людей отмечали низкие показатели относительного содержания мРНК генов BCL-2 и NFKB1 и высокие уровни мРНК генов BAX и PADI4. Было показано снижение экспрессии мРНК генов CDKN1A и ATM у лиц с дозами облучения красного костного мозга (ККМ), превышающими 1000 мГр [9].

Целью настоящего исследования было оценить статус метилирования СpG-островков промоторов генов BCL-2, CDKN1A и ATM в клетках периферической крови у хронически облученных жителей сел, расположенных по берегам р. Течи, в отдаленные сроки.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Оценку метилирования промоторных регионов генов осуществляли у лиц, проживающих в селах, расположенных по берегам р. Течи (Челябинская область). Отбор обследованных лиц проводили с использованием медико-дозиметрической базы данных «Человек», разработанной отделом «База данных — «Человек» ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России. Критерии включения: год рождения обследуемого до 1960 включительно, постоянное проживание на прибрежных территориях р. Течи в период с 1950–1960 г., наличие реконструированной индивидуальной поглощенной дозы облучения ККМ, рассчитанной по дозиметрической системе TRDS (Techa River Dosimetry System, версия 2016) специалистами биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ [10]. Критерии исключения: наличие хронических воспалительных, онкологических и аутоиммунных заболеваний, прием антибиотиков, гормональных и цитостатических препаратов, диагностическое облучение в течение 6 месяцев до момента взятия образца крови, наличие контакта с химическими (генотоксичными) агентами в связи с профессиональной деятельностью.

В группу облученных лиц вошли 54 человека, у которых кумулятивные дозы облучения красного костного мозга (ККМ) находились в диапазоне от  87 до 3510 мГр (среднее значение — 960 ± 100 мГр). Суммарные дозы облучения ККМ большинства облученных людей (36 человек (66,7%)) находились в диапазоне промежуточных значений от 100 до 994 мГр. Дозы, превышающие 1000 мГр, получили 18 человек (33,3%). Группа сравнения состояла из 14 человек, проживающих в сходных социально-экономических и хозяйственно-бытовых условиях (сельское население), но с интенсивностью облучения ККМ, не превышавшей 1 мГр/год, и накопленной дозой менее 70 мГр за весь период жизни. Обследуемые группы включали лиц обоего пола, принадлежавших к следующим этническим группам: тюрки (в основном татары, башкиры) и славяне, представленные преимущественно русскими. Характеристика исследуемых групп представлена в табл. 1.

Исследование уровня метилирования ДНК проводили в лейкоцитах периферической крови. Забор материала осуществляли утром натощак в стерильные вакуумные пробирки с ЭДТА-К3. ДНК из цельной крови экстрагировали с использованием набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit (Thermo Scientific; США) в соответствии с протоколом производителя.

Метод определения метилирования ДНК был основан на специфической детекции 5-метилцитозина или продуктов его превращения в результате бисульфитной конверсии. Проводили полную денатурацию геномной ДНК и обработку бисульфитом в условиях, при которых цитозин стехиометрически конвертировался в урацил, тогда как 5-метилцитозин модификациям не подвергался. Бисульфитная конверсия была выполнена с использованием набора реагентов EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific; США) в соответствии с протоколом производителя.

После обработки ДНК бисульфитом проводили амплификацию с праймерами, специфичными для метилированных и неметилированных участков ДНК. Поиск праймеров для ПЦР фрагментов промоторных регионов генов системы клеточного гомеостаза (ATM, BCL-2, CDKN1A) был проведен на основании имеющихся литературных данных. Олигонуклеотиды были синтезированы фирмой ДНК-Синтез (Россия). Характеристика праймеров представлена в табл. 2.

Определение статуса метилирования интересующих нас последовательностей генов осуществляли методом метилспецифической ПЦР в реальном времени (МСПЦР РВ) на амплификаторе StepOnePlus Real-Time PCR

System (Applied Biosystems; США). Для проведения МСПЦР РВ использовали готовую реакционную смесь qPCRmix-HS SYBR (Евроген; Россия), состоящую из высокопроцессивной Taq ДНК-полимеразы со специфическими моноклональными антителами, красителя SYBR Green I, смеси дНТФ, Mg²⁺ и ПЦР буфера. Объемы компонентов ПЦР смеси и условия амплификации соответствовали протоколу и инструкции производителя.

Наличие целевого продукта в ПЦР смеси после проведения реакции амплификации оценивали методом электрофореза в 2%-м агарозном геле. Основываясь на результатах данного анализа, качественно оценивали наличие или отсутствие аберрантного метилирования в исследуемых пробах.

В качестве положительного контроля метилирования для всех генов была использована геномная ДНК человека CpG Methylated Human Genomic DNA (Thermo Scientific; США) с известным уровнем метилирования ( ≥ 98%).

Для каждой пробы проводили ПЦР с праймерами для метилированных и неметилированных последовательностей генов. Визуализацию результатов гель-электрофореза проводили с использованием системы гель-документирования Gel Doc XR+ (BioRad; США). Присутствие амплификатов на гель-электрофорезе, наработанных в процессе МС-ПЦР РВ с праймерами для метилированных участков генов, указывало на наличие аберрантного метилирования, а наличие амплификатов с праймерами для неметилированных участков генов свидетельствовало об отсутствии метилирования.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программного комплекса Statistica (StatSoft; США). Для сравнения данных использовали точный критерий Фишера. Различия считали значимыми при p < 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Число случаев метилирования СpG-островков промоторов генов BCL-2, CDKN1A и ATM в клетках периферической крови у хронически облученных лиц представлено в табл. 3.

Частота случаев метилирования CpG-островков промоторных регионов генов CDKN1A, BCL-2, ATM в группе облученных лиц значимо не отличалась от группы сравнения. При оценке случаев метилирования CpG островков у обследованных лиц в дозовых подгруппах «от 87 до 994 мГр» и  «более > 1000 мГр» также не выявлено значимых различий с группой сравнения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Эпигенетическая регуляция, в том числе метилирование ДНК, играет важную роль в клеточных процессах, обеспечивая правильную регуляцию экспрессии генов. Однако аберрантное метилирование может приводить к развитию различных патологических состояний, нестабильности генома и раку [11].  Известно, что будучи генотоксическим агентом, ионизирующее излучение способствует как гипер-, так и гипометилированию ДНК. В большинстве исследований in vitro и in vivo, показано, что в ранние сроки после облучения (часы, дни) эпигенетический статус генома изменяется достаточно динамично [12], при этом имеются лишь единичные исследования статуса метилирования ДНК у человека в отдаленные сроки после радиационного воздействия. Так, у ликвидаторов аварии на ЧАЭС и работников реакторного и радиохимического производств ПО «Маяк» было выявлено гиперметилирование СpG-островков промоторов генов p16/INKA и GSTP1 в лейкоцитах крови в отдаленном периоде после радиационного воздействия [13]. Противоположные результаты получены при исследовании рентгенологов. Так, в работе [7] показано, что низкодозовое облучение (20 мЗв в год или 100 мЗв за 5 лет) способствует гипометилированию геномной ДНК клеток крови.

Результаты настоящего пилотного исследования свидетельствуют об отсутствии изменений в статусе метилирования CpG-островков промоторных регионов генов CDKN1A, BCL-2 и ATM в отдаленном периоде у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

Следует отметить, что радиационно-индуцированные эффекты, связанные с метилированием ДНК могут зависеть от ряда факторов: типа клеток, подвергшихся облучению, физиологических особенностей обследованных лиц, вида излучения, дозы и времени после облучения.

Полученные результаты являются предварительными. Для более полного понимания влияния хронического низкоинтенсивного радиационного воздействия на уровень метилирования необходимо расширить выборку обследуемых лиц, а также провести количественный анализ с расчетом процента метилирования промоторных областей генов.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования не выявлено различий в количестве случаев метилирования CpG островков промоторных регионов генов CDKN1A, BCL-2 и ATM у облученных лиц относительно группы сравнения. Полученные результаты являются предварительными — в дальнейшем планируется расширение линейки изученных генов и определение процентного уровня метилирования по каждому промоторному участку гена в группе обследованных лиц.