Гемофильная палочка (Haemophilus influenzae тип b) является возбудителем тяжелых форм менингитов и пневмоний у детей. До широкого внедрения вакцинации инфекции, вызванные Haemophilus influenzae тип b, были причиной 8,13 млн случаев развития инвазивных заболеваний среди детей в возрасте до 5 лет и 371 тыс. случаев смерти. Внедрение вакцинации в 136 странах позволило добиться снижения смертельных случаев на 45,28% [1]. Гемофильная инфекция опасна риском осложнений (тяжелая глухота у детей в 10% случаев) [2]. Гемофильная палочка отличается высокой антибиотикорезистентностью, что усложняет лечение гемофильных инфекций с помощью антиинфекционной химиотерапии [3, 4].

Для профилактики гемофильной инфекции используют комбинированные вакцины. В России зарегистрированы три препарата (Инфанрикс Гекса, аАКДС-Геп В+ Hib, Пентаксим), при этом моновакцины для профилактики гемофильной инфекции отсутствуют. Моновакцины для профилактики гемофильной инфекции необходимы для пациентов c непереносимостью каких-либо компонентов комбинированных вакцин. В настоящие время вакцинация против гемофильной инфекции недостаточна [5], поэтому для надежного обеспечения потребности в вакцинах для профилактики гемофильной инфекции требуется отечественное производство вакцин для профилактики гемофильной инфекции с использованием современных биотехнологических разработок.

Оптимизация биотехнологического производства основана на увеличении количества получаемого продукта за одну производственную серию без потерь в его качестве, а также на сокращении времени производства получаемого продукта. Полисахарид полирибозилрибитолфосфат (PRP) как активный компонент входит в состав вакцин для профилактики опасной детской гемофильной инфекции [6–8]. Он вызывает эффективный иммунный ответ при конъюгации с белком-носителем, относится к веществам, получаемым микробным синтезом на биотехнологическом производстве. Количество произведенного полисахарида напрямую зависит от технологии производства. Основными стадиями, влияющими на выход целевого продукта, являются  ферментация, по завершении которой ожидается максимальное количество PRP, а также выделение и очистка, на которых минимизируют потери.

Решение задач, стоящих перед разработчиком лекарственных препаратов, должно опираться на требования, изложенные в нормативной документации: требования и рекомендации Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) [9], правила надлежащей производственной практики, а также фармакопейные статьи [10, 11]. В Государственной фармакопее РФ ХIV издания впервые вышла фармакопейная статья, регламентирующая производство и контроль качества вакцины для профилактики гемофильной инфекции [11]. Качество процесса производства вакцины для профилактики гемофильной инфекции определяет основная биотехнологическая стадия — культивирование культуры-продуцента в ферментере с целью синтеза PRP. Основная задача на данной стадии — получение максимального количества полисахарида, соответствующего требованиям спецификации.

На количество и качество получаемого PRP может повлиять множество факторов: концентрация растворенного в культуральной жидкости кислорода во время культивирования; концентрация глюкозы, а также способ добавления дополнительных питательных веществ в культуральную жидкость во время культивирования; источник азотного питания и факторы роста в питательной среде; условия культивирования, инактивации культуральной жидкости на стабильность целевого продукта.

Цель данной работы — усовершенствовать технологию получения PRP за счет оптимизации стадии культивирования культуры-продуцента в ферментере.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оценка количества полисахарида

Количественное содержание целевого полисахарида PRP определяли орциноловым методом определения рибоз [12]. Для количественного определения полисахарида в культуральной жидкости проводили пробоподготовку: осаждение полисахарида в культуральной жидкости раствором цетилтриметиламмония бромида (ЦТАБ), центрифугирование, удаление верхнего слоя и последующее растворение осадка, содержащего PRP [13, 14].

Микроорганизм-продуцент

Для производства полисахарида используют природный возбудитель гемофильной инфекции — Haemophilus influenzae тип b. Микроорганизм Haemophilus influenzae тип b — грамотрицательная коккобацилла, ауксотроф (требует наличия в среде факторов роста — гемина и никотинамидадениндинуклеотида (НАД)), факультативный анаэроб. В работе использовали штамм Haemophilus influenzae SPB тип b, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦПМБ под номером В-7884 [15]. 

Культивирование

Посевной материал для культивирования в лабораторном ферментере готовили следующим образом: в 150 мл синтетической жидкой питательной среды, разлитой в колбы, добавляли 1 мл предварительно размороженной культуры из криопробирки (рабочий посевной материал). Засеянную питательную среду устанавливали на шейкер-инкубатор Unimax 1010 (Heidolph; Германия) на 6 ч, контролируя температуру и число оборотов в минуту. Посевной материал проверяли по показателям «Оптическая плотность» и «Микробиологическая чистота». Посевной материал в полном объеме (150 мл) пересевали в лабораторный ферментер Biostat A (Sartorius Stedim Biotech; Германия). Культивирование проводили в лабораторном ферментере объемом 2,0 л в течение 18 ч, при непрерывной подаче кислорода и перемешивании, поддерживая рН на уровне 7,2 ± 0,2. На этапе изучения влияния концентрации кислорода в культуральной жидкости во время культивирования поддерживали концентрацию растворенного кислорода на уровне 10, 30 и 60%. Аппаратурное оформление ферментера включало в себя колбу из боросиликатного стекла (UniVessel), штатив и крышку из нержавеющей стали марки AISI 304, перемешивание культуральной жидкости обеспечивали шестилопастной двухъярусной мешалкой, стерильный сжатый воздух подавали в культуральную жидкость через барботер. Нагрев и охлаждение культуральной жидкости во время культивирования обеспечивали за счет охлаждающего теплообменника, выполненного из нержавеющей стали марки AISI 304 и нагревательной пластины, установленной на внешнюю поверхность колбы ферментера. Необходимые значения pH поддерживали с помощью автоматизированной подачи титрующих растворов: 2,0 М раствора NaOH и 1,0 М раствора HCl. Концентрацию глюкозы во время культивирования регулировали ручной подачей раствора подпитки, состоящего из раствора глюкозы и дрожжевого экстракта. Отбор проб во время культивирования осуществляли через пробоотборник, установленный в крышке ферментера.

Питательная среда

В исследованиях использовали жидкую полусинтетическую питательную среду [16], содержащую солевые растворы, источники азотного и углеродного питания, а также факторы роста. В экспериментах по изучению влияния источников азотного питания и факторов роста был изменен патентный компонентный состав питательной среды: пептон животного происхождения заменен на растительный (соевый) пептон (Sigma-Aldrich, P6463; Германия); свиной гемин — на протопорфирин IX.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Haemophilus influenzae тип b — факультативный анаэроб, поэтому можно влиять на его рост и биосинтез целевого продукта за счет регулирования аэрации во время культивирования. Для этого на первом этапе изучали влияние аэрации на накопление биомассы и синтез целевого продукта — полисахарида PRP. Предполагалось, что изменением концентрации кислорода в культуральной жидкости можно будет регулировать биохимические процессы микроорганизма-продуцента и стимулировать его на накопление биомассы (целевой продукт —полисахарид, являющийся внешней защитной оболочкой бактерии) или регулировать ускоренный синтез целевого продукта при нахождении продуцента в стрессовых условиях.

Насыщение культуральной жидкости кислородом осуществляли с помощью барботажа жидкости стерильным сжатым воздухом, а также перемешиванием двухъярусной шестилопастной мешалкой (аппаратурное исполнение ферментера Biostat A). Результаты экспериментальных работ по изучению влияния концентрации растворенного в культуральной жидкости кислорода во время культивирования представлены в табл. 1.

При увеличении аэрации за счет раннего начала интенсивного перемешивания и подачи стерильного сжатого воздуха с помощью барботажа (для поддержания концентрации кислорода на уровне 60%) происходит существенное увеличение накопления биомассы (в 1,3 раза), при этом синтез целевого продукта увеличивался несущественно (максимально на 10%) (см. табл. 1).

На следующем этапе изучили влияние концентрации глюкозы в культуральной жидкости на выход PRP при культивировании Haemophilus influenzae тип b.

В качестве подпитки для культивирования Haemophilus influenzae SPB тип b B-7884 использовали раствор глюкозы и дрожжевого экстракта. Глюкоза выполняет роль источника углерода, а дрожжевой экстракт — источника азота, витаминов и микроэлементов. Предполагается, что внесение большого объема подпитки, например, в начале экспоненциальной фазы, сможет существенно ускорить образование биомассы за счет высокой концентрации питательных веществ в культуральной жидкости. Регулируемое внесение подпитки на протяжении всего культивирования позволит постепенно добавлять питательные вещества в культуральную жидкость, реагируя на потребности микроорганизмов в глюкозе в текущий момент культивирования.

Для изучения влияния способа внесения подпитки сравнили два способа добавления: большими объемами на определенных этапах культивирования (по достижении определенного значения оптической плотности) (вариант 1) и малыми объемами на протяжении всего культивирования, для поддержания концентрации глюкозы в пределах 12–34 ммоль/л на протяжении всего культивирования (вариант 2). Результаты сравнения указанных способов представлены на рис. 1 и рис. 2.

Согласно полученным результатам, используя первый способ подачи подпитки, удалось достичь оптической плотности культуральной жидкости 3,8 ± 0,2 и поддерживать ее в течение 1 ч культивирования (достижение оптической плотности до значений 3,8 ± 0,2 и продолжительное стабильное значение этого параметра свидетельствует о достижении стационарной фазы) за 16 ч. Используя второй способ подачи подпитки, при культивировании удалось быстрее добиться необходимых для достижения стационарной фазы значений оптической плотности, достигнув стационарной фазы за 12,5 ч.

На следующем этапе изучили влияние различных источников азотного питания и факторов роста на биосинтез PRP.

Фармакопейная статья, регламентирующая производство и контроль качества вакцины для профилактики гемофильной инфекции, включает требования к показателям качества PRP, рекомендации к производству PRP, в том числе к составу питательных сред, применяющихся для культивирования. Среди них — отсутствие в составе питательных сред любых продуктов животного происхождения, для исключения риска прионного заражения. В питательных средах, использующихся для культивирования Haemophilus influenzae тип b B-7884, содержатся некоторые продукты животного происхождения. Одним из таких компонентов является пептон (из мясного сырья), а также Х-фактор роста — гемин, получаемый из животного сырья (чаще всего, свиного или говяжьего). Для соблюдения требований нормативной документации необходимо изучить влияние происхождения источников азота и факторов роста в питательной среде на рост биомассы и биосинтез целевого продукта. Вместо пептонов из животного сырья можно использовать растительные пептоны: гороховый, пшеничный, соевый и протеозопептон. Указанные пептоны могут существенно различаться по химическому составу, а так как накопление биомассы и синтез PRP Haemophilus influenzae тип b зависят от аминокислотного состава среды [17–19], химический состав пептонов может оказать существенное влияние на получение целевого продукта.

Важно также оценить влияние источника происхождения Х-фактора в питательной среде на рост биомассы Haemophilus influenzae тип b и биосинтез PRP. Х-фактор принимает участие в синтезе цитохрома С и других дыхательных ферментов, содержащих железо. У Haemophilus influenzae тип b присутствует фермент феррохелатаза, функция которого — преобразовать протопорфирин IХ в гемин [20]. Следовательно, в составе питательных сред для культивирования Haemophilus influenzae тип b можно применять протопорфирин IХ вместо гемина [20]. Изначально в качестве вещества, выполняющего роль Х-фактора, использовали гемин, полученный из крови крупного рогатого скота.

Потенциально такой источник сырья может быть опасным с точки зрения прионного заражения. Для минимизации влияния риска прионного заражения используют гемин, полученный из крови свиней [21]. Однако использование сырья свиного происхождения недопустимо в ряде стран, что ограничивает импорт вакцины, поэтому замена гемина на протопорфирин может быть перспективной.

Для оценки перспективы замены пептона из животного сырья растительным пептоном провели серии экспериментов. Контрольной средой выступала питательная среда, содержащая пептон из животного сырья и дрожжевой экстракт в соответствии с патентом [16] в соотношении 15 : 2. Для питательных сред, содержащих растительный пептон, использовали то же соотношение пептона и дрожжевого экстракта. Культивирование проводили в качалочных колбах на шейкере-инкубаторе в течение 6 часов, при температуре (35 ± 2) — и при постоянном перемешивании качалочных колб со скоростью 150 об./мин. Результаты экспериментальных работ по оценке перспективы замены пептона представлены в табл. 2.

Использование питательной среды на основе соевого пептона привело к получению схожих результатов культивирования, как и при использовании пептона из животного сырья.

Далее были проведены экспериментальные работы по замене гемина (вещества Х-фактора) на протопорфирин IX. Культивирование проводили в качалочных колбах на шейкере-инкубаторе в течение 6 часов, при температуре (35 ± 2) — и при постоянном перемешивании качалочных колб со скоростью 150 об./мин.

Результаты влияния источника Х-фактора роста на рост биомассы приведены в табл. 3.

Использование питательной среды с протопорфирином IХ в качестве Х-фактора дало похожие результаты культивирования, как и в случае с использованием гемина (патентная среда).

По результатам экспериментальных работ был предложен новый состав питательной среды, соответствующий рекомендациям нормативной документации: изменен источник азотного питания и источник Х-фактора роста. Результаты сравнения двух питательных сред представлены в табл. 4.

Результаты проведенного эксперимента показали незначительное (на 8%) снижение продуктивности Haemophilus influenzae тип b в питательной среде без компонентов животного происхождения. Далее определяли возможность уменьшения потерь PRP на стадии инактивации культуральной жидкости.

За стадией ферментации, для выделения целевого продукта, следуют стадии очистки. В зависимости от характера взаимодействий с очищаемым продуктом, например, химическим (осаждение, экстракция) и механическим (фильтрация), неизбежно следуют потери целевого продукта без возможности их восполнения, так как стадия биологических превращений (биосинтез) уже завершена. Требования, предъявляемые к продуктам, полученным с использованием патогенных микроорганизмов, регулируют полное отсутствие живых патогенных микроорганизмов в готовом продукте. Для устранения риска наличия живых микроорганизмов производители вакцин чаще всего используют метод инактивации, полностью убивая в культуральной жидкости все живые микроорганизмы после культивирования. Инактивация, независимо от способа выполнения (химически или термически), неизбежно связана с потерями целевого продукта. Так, во время инактивации при воздействии высоких температур PRP может деполимеризоваться и разрушаться. Известно, что полисахарид PRP стабильнее в кислой среде (рН 6,5 и ниже), где его деполимеризация, согласно математической модели, практически отсутствует [22].

После завершения процесса культивирования в ферментере рН культуральной жидкости был снижен до 6,5 с помощью подачи титрующих агентов. Затем культуральную жидкость передали на стадию инактивации. В качестве контроля использовали данные культивирования без изменения рН до его завершения (рН 7,2 ± 0,2). Полученные результаты представлены в табл. 5.

За счет снижения рН при инактивации потери на этой стадии были уменьшены на 80%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение влияния концентрации растворенного в культуральной жидкости кислорода во время культивирования

Как демонстрируют проведенные эксперименты (см. табл. 1), зависимость накопления биомассы и синтеза PRP может быть связана с тем, что культура Haemophilus influenzae SPB тип b B-7884 активно потребляет кислород для окисления питательных веществ, использующихся в процессах анаболизма для образования новых клеток, и синтез целевого продукта замедляется. Кроме того, увеличившееся количество биомассы может повлиять на параметры последующих стадий выделения и очистки, существенно их затруднив из-за возросшей нагрузки на оборудование и материалы, что повысит потери целевого продукта на этих стадиях.

Уменьшение концентрации растворенного в культуральной жидкости кислорода до 30% привело к снижению накопления биомассы на 27% и незначительному уменьшению синтеза целевого продукта (до 6%), что позволило получить достаточное количество PRP, выделить его и очистить. Снижение концентрации растворенного в культуральной жидкости кислорода до 10% привело к значительному снижению уровня как биомассы, так и полисахарида PRP.

Полученные результаты о влиянии концентрации кислорода в культуральной жидкости во время культивирования возможно использовать для оптимизации процесса получения производственной культуры, для обеспечения максимально возможного выхода полисахарида PRP при наименьших усложнениях дальнейших стадий выделения и очистки, спровоцированных увеличением количества биомассы.

Изучение влияния концентрации глюкозы в культуральной жидкости на выход PRP при культивировании Haemophilus influenzae тип b

Быстрое достижение стационарной фазы при втором способе подачи подпитки (см. рис. 1) связано с поддержанием определенной концентрации глюкозы в культуральной жидкости (см. рис. 2). При внесении большого количества подпитки в культуральную жидкость (вариант 1) происходит резкое увеличение концентрации глюкозы, что может ингибировать рост культуры. При поддержании постоянного уровня глюкозы (вариант 2), резкого увеличения концентрации глюкозы и, следовательно, ингибирования роста культуры можно избежать. Выход PRP после культивирования при использовании варианта 1 составил 403,2 мкг/мл, при использовании варианта 2 — 443,5 мкг/мл. Полученные результаты позволят оптимизировать стратегию подачи глюкозы во время культивирования.

Изучение влияния различных источников азотного питания и факторов роста на биосинтез PRP

Исходя из результатов экспериментов (табл. 2, табл. 3, табл. 4), замена компонентов животного происхождения на растительные в питательной среде для культивирования Haemophilus influenzae тип b привела к несущественному (менее 9 %) снижению количества получаемого полисахарида PRP. Несмотря на это, показана принципиальная возможность замены некоторых составляющих питательной среды на компоненты неживотного происхождения, что позволит производству вакцин для профилактики гемофильной инфекции соответствовать последним требованиям нормативной документации.

Изучение способа уменьшения потерь PRP на стадии инактивации культуральной жидкости

На основании полученных результатов экспериментальных работ (см. табл. 5), возможно предложить способ снижения потерь PRP на стадии инактивации за счет уменьшения рН культуральной жидкости до 6,5 ± 0,1 после завершения культивирования. Но, несмотря на это, необходимо отметить, что непосредственно проводить культивирование при таких значениях рН нецелесообразно, так как накопление полисахарида в таких условиях происходит медленнее [23].

ВЫВОДЫ

В ходе работы предложено несколько способов оптимизации процесса получения полисахарида PRP при культивировании Haemophilus influenzae SPB тип b B-7884. Результаты позволяют оптимизировать получение полисахарида PRP в соответствии с последними требованиями нормативной документации. Выход PRP в культуральной жидкости увеличен на 10%. Скорость накопления биомассы при культивировании в ферментере увеличена на 25%, время культивирования сокращено на 6,5 ч. Потери PRP на стадии инактивации культуральной жидкости сокращены на 80%. Предложен состав новой питательной среды, соответствующей последним требованиям нормативной документации. Результаты, полученные в этом исследовании, позволят усовершенствовать технологический процесс получения полисахарида PRP, активного компонента вакцин против гемофильной инфекции.