Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным типом злокачественных образований у женщин [1]. В России заболеваемость РМЖ за 15 лет выросла в 2 раза, ежегодно регистрируется около 50 тысяч новых пациенток с этим диагнозом [2]. Сложность лечения данного заболевания усугубляется тем, что более чем у 40% женщин его выявляют на поздних стадиях [2]. Нужно также отметить, что РМЖ представляет собой группу разнородных заболеваний, имеющих разные молекулярные механизмы развития и клеточное происхождение, что еще сильнее усложняет его диагностику и терапию [3]. РМЖ отличают высокие показатели летальности: за 2020 г. было зафиксировано 685 тыс. смертельных случаев в мире [4].

К основным методам терапии РМЖ относят хирургию, химиотерапию, лучевую, гормональную и таргетную терапию [5]. Более благоприятными профилями безопасности обладают препараты гормональной и таргетной терапии, однако они тоже имеют побочные эффекты и не могут быть использованы как единственный способ лечения РМЖ. Другие методы лечения оказывают более серьезное влияние на организм. Например, облучение может повреждать близлежащие к груди лимфатические сосуды, что приводит к лимфедеме [6]. Удаление груди (мастэктомия) может оказать влияние на психическое и эмоциональное развитие пациенток [7]. Наибольшими негативными последствиями обладают химиотерапевтические препараты, которые действуют системно, затрагивая не только раковые клетки, но и быстро делящиеся нормальные клетки организма [8].

Из-за тяжести и распространенности заболевания, а также по причине негативного воздействия на организм существующих методов лечения становится актуальной разработка новых групп лекарственных препаратов для лечения РМЖ. Одной из таких групп могут выступать препараты на основе онколитических вирусов. Как встречающиеся в природе, так и полученные методами генной инженерии, эти вирусы могут специфически поражать клетки опухоли, не нанося вред здоровым клеткам [9]. Рассмотрение онколитических вирусов в качестве терапевтических средств является довольно новым, но в то же время интенсивно развивающимся направлением исследований. Отмечено увеличение числа разработок в данной области: так, в период с 2015 по 2020 г. число публикаций на PubMed по запросу «oncolytic viruses» выросло с 276 до 457, а по запросу «oncolytic viruses for breast cancer» — с 11 до 28 с динамикой роста в каждом году. В данном обзоре представлен анализ возможностей использования онколитических вирусов в качестве платформы для создания препаратов, направленных на лечение РМЖ. Описаны механизмы действия онколитических вирусов, подходы к увеличению селективности их действия и усилению вызываемых ими противоопухолевых эффектов. Приведены направления развития онколитической терапии.

Подтипы РМЖ и механизмы их патогенеза

РМЖ является группой разнородных заболеваний, как по фенотипическим, так и по генетическим признакам [10]. Заболевание классифицируют по гистологическому происхождению, стадиям развития, патологоанатомическому поражению и типам онкогенных маркеров [10, 11]. На основе экспрессии таких доминирующих онкогенов, как рецептор эстрогена (ER), рецептор прогестерона (PR), рецептор эпидермального фактора роста 2 (HER2) и маркер пролиферации ki 67, выделяют четыре молекулярных подтипа РМЖ: люминальный А, люминальный В, HER2 положительный и тройной негативный (табл. 1) [10].

На основе статистики, собранной в разных странах, рассмотрим частоту встречаемости и показатель смертности для каждого подтипа РМЖ. Наиболее распространенным типом РМЖ является люминальный А  — частота его встречаемости достигает 50–60%, пациенты с люминальным А подтипом РМЖ имеют наиболее благоприятный исход заболевания с выживаемостью 95–100% за трехлетний период с начала постановки диагноза [12, 13]. Другие подтипы рака распространены более равномерно с частотой встречаемости 10–15% [14]. Наиболее опасным вариантом является тройной негативный РМЖ: средняя выживаемость пациентов составляет 75–80% в течение 3–4-х лет с момента постановки диагноза [13].

Развитие онкологических заболеваний обусловлено нарушениями на эпигенетическом и генетическом уровне механизмов, отвечающих за пролиферацию, апоптоз и миграцию клеток [10]. Выявление сигнальных путей, обусловливающих патогенез конкретных подтипов рака, позволяет выявить новые мишени для таргетной терапии.

Один из основных механизмов развития РМЖ, затрагивающий около 70% случаев данного заболевания, — путь передачи сигналов с участием эстрогеновых рецепторов [15]. Стоит отметить, что существуют два типа эстрогеновых рецепторов: ERα и ERβ. Экспрессия ERα часто повышена при РМЖ, а экспрессия ERβ, наоборот, понижена [10]. При классическом варианте активации данного пути после связывания ERα с эстрогеном образовавшийся комплекс димеризуется и взаимодействует с белками-корегуляторами и специфическими участками ДНК — ERE-элементами. Данные взаимодействия моделируют транскрипцию целого ряда генов, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоза, репликацию ДНК, дифференцировку клеток и ангиогенез [15]. Так, дополнительная активация ER-пути стимулирует транскрипцию гена циклина D1, что способствует последующей активации протеинкиназы CDK 4/6 и переходу клетки из G1-фазы в S-фазу [15]. Увеличение экспрессии циклина D1 служит одним из признаков раннего патогенеза РМЖ и некоторых других злокачественных образований [15].

Другим важным механизмом в патогенезе РМЖ является передача сигналов через рецептор HER2, который представляет собой тирозиновую протеинкиназу [16]. После связывания HER2 с лигандом и димеризации образовавшегося комплекса происходит фосфорилирование тирозиновых остатков внутриклеточного домена фермента, что приводит к активации нескольких сигнальных путей, таких как Ras/ MAPK и PI3K/AKT, в результате чего усиливается клеточная пролиферация [10].

Механизм терапии рака с помощью онколитических вирусов

Терапия раковых заболеваний с использованием онколитических вирусов — довольно новое направление. К настоящему моменту на рынок вышел лишь один препарат на основе онколитического вируса — Талимоген лагерпарепвек, который используют для лечения меланомы [17]. В то же время некоторые аналогичные препараты находятся на стадии клинических испытаний и в случае их успешного завершения создадут новую нишу противораковых препаратов. Согласно данным ресурса clinicaltrials.gov [18], на сегодняшний день идут клинические исследования 12 препаратов на основе онколитических вирусов для лечения РМЖ (табл. 2). Тройной негативный РМЖ является приоритетным направлением терапии, что может быть связано с высокой молекулярной гетерогенностью, отсутствием ключевых рецепторов для таргетной терапии и самой высокой смертностью среди других молекулярных подтипов РМЖ. Стоит также отметить, что в большинстве клинических исследований комбинируют онколитические вирусы с другими вариантами противоопухолевой терапии для достижения большей эффективности лечения. Кроме того, для повышения эффективности многие онколитические вирусы подвергают генетической модификации (см. табл. 2), что более подробно будет описано в следующем разделе.

Есть ряд положительных особенностей, свойственных онколитическим вирусам: пониженная резистентность к данным препаратам, высокая избирательная направленность к опухолевым клеткам, относительное отсутствие патогенности, увеличение дозы вируса в опухоли из-за его репликации [19]. В качестве онколитических вирусов используют вирусы, доказавшие свою эффективность как векторные вакцины и являющиеся удобными моделями для внесения генетических модификаций [20]. К данным вирусам относят двуцепочечные ДНК вирусы (аденовирусы, вирус простого герпеса, вирус осповакцины), двуцепочечные РНК вирусы (реовирусы), одноцепочечные (+)-РНК вирусы (пикорнавирусы), одноцепочечные (–)-РНК вирусы (вирус кори, вирус визикулярного стоматита, вирус Мараба) [20].

Существует два пути воздействия, которые оказывают онколитические вирусы на опухоль: избирательное поражение раковых клеток и развитие противоопухолевого иммунитета [21]. Эффективность терапии при этом зависит от взаимодействия вируса, иммунной системы и опухоли [21]. Важно, чтобы иммунный ответ формировался после проникновения вируса в раковые клетки и его репликации — в этом случае вирус успеет уничтожить зараженную популяцию раковых клеток и вызвать воспаление в опухолевом окружении. Однако если иммунные клетки свяжутся с вирионами до взаимодействия с опухолью, то терапия не будет иметь положительного результата. В качестве защитной системы от преждевременной нейтрализации вируса компонентами иммунной системы могут выступать клеточные носители и пэгелированные наночастицы [22, 23]. Кроме времени активации иммунного ответа на эффективную терапию онколитическими вирусами влияет также тип раковых клеток, их чувствительность к данному вирусу и строение опухоли, включая степень васкуляризации, от которой зависит скорость поступления лейкоцитов, а также наличие резидентных макрофагов и уровень экспрессии опухолевых маркеров [19].

Избирательное поражение опухолевых клеток зависит от нескольких факторов. Первым и наиболее важным является повышенный тропизм конкретного вируса к конкретному типу опухолевой клетки, который обусловлен сродством клеточного рецептора и поверхностного антигена вируса [21]. В результате рецепторопосредованного взаимодействия вирус проникает в клетку. Для повышения селективности к опухолевым клеткам создают псевдотипированные вирусы, несущие поверхностные антигены другого вируса либо невирусные лиганды, обладающие повышенным сродством к опухолеспецифичным рецепторам [24]. Кроме того, быстрое деление и ускоренный метаболизм опухолевых клеток позволяет вирусу усиленно реплицироваться [21]. Дополнительным фактором является нарушение процесса передачи сигналов интерферона I типа, который обладает противовирусным действием, что защищает вирус от преждевременного клиренса иммунными клетками [9]. Повысить эффективность может также введение большой концентрации онколитических вирусов путем прямой внутриопухолевой инъекции [21].

Как было обозначено выше, второй путь воздействия препаратов на основе онколитических вирусов состоит в активации противоопухолевого ответа. При попадании в кровоток вирусные частицы могут быть захвачены антителами и антигенпрезентирующими клетками (АПК) до момента проникновения в опухолевые клетки, что будет способствовать развитию противовирусного иммунитета, но тормозить проявление противоопухолевого иммунного ответа [25]. После проникновения онколитического вируса в опухолевую клетку, происходит запуск вирусного цикла. Цикл заканчивается образованием множества копий вирионов, которые путем лизиса выходят из клетки, таким образом разрушая ее, и инфицируют близлежащие клетки. Поврежденные клетки выделяют в межклеточную среду большое количество молекул DAMP (damage-associated molecular pattern) — молекул, инициирующих неинфекционное воспаление, что вызывает воспалительную реакцию, приводящую к притоку NK-клеток и макрофагов в опухолевое окружение. Захват связанного с опухолью антигена (TAA) и его презентация лимфоцитам через АПК ведут к запуску адаптивного иммунитета преимущественно по пути цитотоксического иммунного ответа. Дополнительно развитие противопухолевого ответа стимулирует секреция вирусных белков, выделяемых в очаг воспаления [19].

Подходы к терапии РМЖ с использованием онколитических вирусов

Увеличение селективности онколитических вирусов к раковым клеткам молочной железы

Для улучшения безопасности и эффективности онколитической терапии важным шагом является повышение селективности вирусного вектора к раковым клеткам, в рассматриваемом варианте — к опухолевым клеткам молочной железы. При этом селективности онколитических вирусов можно достичь двумя путями: специфическим связыванием поверхностного антигена вируса с рецептором опухолевой клетки и избирательной репликацией вируса только в опухолевых клетках из-за введения в геном вектора промотора, активирующегося при связывании со специфическими опухолевыми маркерами [26]. При использовании обоих подходов аденовирусный вектор Ad5 имел химерный поверхностный белок волокна, полученный из серотипов Ad5 и Ad3, что улучшало его тропизм, и тканеспецифичные промоторы, регулирующие экспрессию ответственного за репликацию вируса белка E1A, благодаря чему вирус нацеленно реплицировался в CD44⁺ CD24^–/low-популяции клеток — стволовых клеток РМЖ [27].

В качестве модификации вирусного антигена можно применять не только вставку антигена другого вируса, обладающего большей тропностью к опухолевым клеткам, но и введение других лигандов к рецепторам опухолевых клеток. Например, белок волокна аденовируса был модифицирован вставкой пептида Lyp-1, рецептор которого — белок р32 гиперэкспрессирован в клетках РМЖ [28]. В результате введения данного онколитического вируса иммунокомпетентным мышам происходило подавление роста опухоли и замедление метастазирования. Примечательно, что тропизм вируса простого герпеса был генетически изменен с перенацеливанием на HER2⁺ клетки путем вставки синтетического одноцепочечного антитела к HER2 (которое выполняло функцию лиганда) в домен gD гликопротеина вируса простого герпеса [29].

Перспективным представляется модификация онколитических вирусов с введением последовательностей опухолевых супрессоров или их сайтов связывания в геном вирусного вектора, что может способствовать не только улучшению селективности, но и большей эффективности противоопухолевого эффекта. Так, Ad5 был генетически модифицирован с целью избирательной репликации в опухолевых клетках молочной железы: модификация представляла собой введение сайтов связывания miR-145 — опухолевого супрессора, чья концентрация снижена в опухолевых клетках, в геном аденовирусного вектора [30]. В результате высокие титры вируса наблюдали в линиях опухолевых клеток молочной железы: MDA-MB-453, BT-20 и MCF-7, а в нормальных эпителиальных клетках молочной железы уровень линий HMEpC оказался пониженным. В другом исследовании в геном аденовирусного вектора была вставлена последовательность опухолевого супрессора гена KISS1 [31]. Экспрессия KISS1 обеспечивала больший цитотоксический эффект при воздействии вируса на опухолевые клетки молочной железы в совокупности с литическим действием аденовирусного вектора.

Усиление противоопухолевого ответа при модификации онколитических вирусов

Помимо непосредственного разрушения раковых клеток эффекторное действие онколитических вирусов основано на развитии противоопухолевого иммунного ответа. Путем введения в геном онколитических вирусов последовательностей генов иммуномодулирующих белков можно добиться еще большего усиления иммунного ответа в опухолевом окружении. В этом случае сам вирус выступает в роли своеобразного «лейкоцита». Существует несколько работ, доказывающих эффективность данной методики. Так, в исследованиях на мышиных моделях было показано, что введение модифицированных вирусов простого герпеса и вируса болезни Ньюкасла с трансгеном IL12 — провоспалительного цитокина, играющего важную роль в инициации противоопухолевого ответа, приводит к ингибированию роста опухоли [32]. Ингибирующее действие на клетки РМЖ было показано при использовании рекомбинантного аденовируса, несущего ген IL15, который кодирует цитокин, активирующий пролиферацию натуральных киллеров и CD8+-Тлимфоцитов [33]. Противоопухолевая эффективность была также выявлена у онколитического вируса осповакцины, который получили внесением гена цитокина GM-CSF в геном вируса. Анализ иммунного профиля на мышиной модели показал повышенную инфильтрацию CD8+-Tлимфоцитов в опухолевое окружение, что доказывает иммуномодулирующее действие данного онколитического вируса [34].

Воздействие онколитических вирусов на противоопухолевый иммунный ответ можно направить не только на общее повышение воспаления через синтез цитокинов, но и на целевые мишени, связанные с развитием опухоли, через производство антител. Так, был сконструирован аденовирусный вектор, содержащий последовательность полноразмерного антитела к HER2 [35]. Вирус показал высокую противоопухолевую эффективность против HER2-позитивного РМЖ на клеточной и мышиной модели. Производство аденовирусом антител к опухолевому маркеру HER2 способствовало усилению антителозависимой клеточной цитотоксичности, что приводило к более эффективному разрушению раковых клеток. В другой работе вирус осповакцины был модифицирован путем вставки гена, кодирующего антитело против фактора роста эндотелия сосудов VEGF (регулятора ангиогенеза, способствующего росту опухоли) [36]. Сконструированный вирус показал онколитическую и антиангиогенную активность в ксенотрансплантатах тройного негативного РМЖ, вживленных мышам.

Дальнейшие направления развития онколитической терапии против РМЖ

Доставка вирусных векторов

Для предотвращения нейтрализации антителами, накопления в других органах и преждевременного выведения вирусных частиц важно найти оптимальный способ доставки онколитических вирусов в опухоль. Наиболее простым методом является прямая внутриопухолевая инъекция вирусных векторов, что позволяет свести к минимуму вышеперечисленные проблемы [37]. Для локализованных и местно-распространенных форм РМЖ такой способ доставки выглядит предпочтительным ввиду доступности раковой опухоли для инъекционного введения, однако в случае метастазирования могут понадобиться более сложные способы доставки: введение вирусов совместно с иммуномодуляторами, использование в качестве носителей липосом и клеток [37]. Так, была показана высокая эффективность онколитической терапии при доставке вирусных векторов к плевральным метастазам РМЖ с использованием дендритных клеток на модели мышей [38].

Онколитические вирусы как вакцины

Сами онколитические вирусы могут выступать в роли иммуномодулирующих агентов, усиливающих противоопухолевый иммунитет. Одна из возможных стратегий — дополнительное применение онколитического вируса в качестве вакцины: в геном вируса встраивают ген опухолевого антигена, и при попадании в клетку происходит увеличение экспрессии антигена, что повышает вероятность инициации и усиления противоопухолевого ответа [26]. В данном подходе онколитический вирус выступает в роли своеобразной приманки для иммунных клеток. На мышиной модели рака яичников было показано, что введение вируса Мараба, несущего опухолевый антиген, вызывало усиление CD8+-противоопухолевого иммунного ответа [39]. Соответственно, можно конструировать вирусные векторы, несущие опухолевые маркеры ER, PR и HER2, что позволит нацелить иммунный ответ на конкретный подтип РМЖ. Отдельного внимания здесь требует тройной негативный РМЖ, для которого необходим поиск специфических опухолевых маркеров. Еще более специфический запуск противоопухолевого иммунного ответа возможен при сочетании CAR-T-клеточной терапии (использовании Т-клеток, несущих химерные рецепторы к опухолевым антигенам) и онколитических вирусов, доставляющих антигенную мишень для CAR-T лимфоцитов [26].

Комбинирование с другими методами терапии

Потенциально использование онколитических вирусов в сочетании с другими методами лечения РМЖ может дать синергический эффект. Кроме того, применение онколитических вирусов в комбинации с химиотерапевтическими средствами нередко позволяет снизить дозу химиотерапевтического агента, что способствует снижению проявления тяжелых побочных эффектов, наблюдаемых при химиотерапии [40]. Скорее всего химиопрепараты не оказывают негативного воздействия на сам вирус. Так, в исследовании на мышах было показано, что паклитаксел не влиял на инфекционную и репликационную способность онколитического вируса, а совместное воздействие на раковые клетки молочной железы оказывало синергичное противоопухолевое воздействие [41]. По результатам второй фазы клинических испытаний совместное использование онколитического реовируса и паклитаксела увеличивало общую продолжительность жизни у пациентов с метастатическим РМЖ в сравнении с группой, принимающей только паклитаксел [42]. Синергический эффект возможен также при комбинации виротерапии с лучевой терапией, что показано в доклиническом исследовании по разработке терапевтической схемы лечения меланомы [43]. К сожалению, схожие работы для оценки влияния на РМЖ отсутствуют, но предполагается, что эффективность подобной терапии будет сопоставимой с результатами лечения других типов опухолей. Механизм данного воздействия не определен, однако вирусы могут препятствовать восстановлению ДНК после лучевой терапии, что приводит к более быстрой гибели опухолевых клеток [44]. Актуальным направлением терапии является использование онколитических вирусов совместно с моноклональными антителами. В фазе I клинического испытания у части пациентов наблюдали клинический ответ с образованием пула реактивных CD8+-Т-клеток при лечении солидных опухолей  вирусом осповакцины p53MVA в комбинации с пембролизумабом [45]. В фазе II клинического испытания была показана противоопухолевая активность в лечении саркомы при использовании Талимоген лагерпарепвека в комбинации с пембролизумабом [46].

Заключение

Использование онколитических вирусов является перспективным методом терапии РМЖ. Его эффективность обусловлена двумя путями воздействия вируса на раковую опухоль: лизисом опухолевых клеток — эффекторное действие и запуском (усилением) противоопухолевого иммунного ответа — иммуномодулирующее действие. Эффекторное действие можно усилить путем повышения селективности онколитического вируса к опухолевым клеткам молочной железы. Иммуномодулирующее действие вируса также может быть повышено с помощью введения генов белков иммунной системы в геном вируса. Дальнейшие вопросы использования онколитических вирусов в терапии РМЖ связаны с методами доставки вирусных частиц в опухоль, рассмотрения вирусных векторов в качестве носителей опухолевых антигенов для более быстрого запуска противоопухолевого ответа и использования онколитических вирусов в комбинации с другими методами лечения. Однако разработки в данной области требуют еще значительного времени для перехода к практическому использованию, так как необходимо накопить определенный объем доказательных данных об эффективности данного подхода. Таким образом, онколитические вирусы представляют собой потенциально эффективные и гибкие к изменениям терапевтические инструменты, которые в будущем могут стать основой для новой группы противоопухолевых препаратов.