В экстремальных ситуациях важна роль достоверного обнаружения психотропных веществ при минимальных терапевтических концентрациях, что позволит проводить адекватную реанимационную терапию. В настоящее время производные бензодиазепинов являются одними из наиболее распространенных психотропных средств, которые применяют при тревожных расстройствах и других психосоматических состояниях. Наиболее мощный из бензодиазепинов и часто используемый в медицинской практике [1–5] бромдигидрохлорфенилбензодиазепин (феназепам) помимо положительного клинического эффекта обладает большим числом побочных действий [6], которые при неправильном медицинском применении или с немедицинскими целями могут привести к отравлениям вплоть до летального исхода [7–9].

Бромдигидрохлорфенилбензодиазепин — анксиолитическое средство (транквилизатор) бензодиазепинового ряда. Оказывает анксиолитическое, седативно-снотворное, противосудорожное и центральное миорелаксирующее действие. Химическое название — 7-бром-5-(ортохлорфенил)-2,3-дигидро-1Н-1,4-бензодиазепин-2-он; молекулярная формула — C₁₅H₁₀BrClN₂O; наиболее известно на территории РФ под торговым названием «феназепам». Лекарственная форма — таблетки по 0,5; 1,0 и 2,5 мг [10] и в виде раствора 1 мг/мл по 0,5 и 1,0 мл [11]. Является рецептурным лекарственным средством (отпуск по рецепту формы № 148–1/у-88), в 2021 г. поставлен на предметно-количественный учет (ПКУ) при отпуске как сильнодействующее вещество. Для феназепама риск лекарственной зависимости и синдром отмены был и остается достаточно высоким, чем обусловлены случаи отравления, а наличие побочных эффектов, например галлюцинации, эйфория и другие, определяют потенциальную возможность злоупотребления этим препаратом [1, 9].

Феназепам применяют в небольших количествах, так как он оказывает высокий терапевтический эффект, а его возможность потенцирования эффекта во много раз другими веществами предполагает его низкие концентрации в биологических объектах организма. Поскольку немедицинское применение, комбинация с другими психотропными средствами и алкоголем и наличие побочных эффектов могут привести к наступлению острого и летального отравления феназепамом, разработка методики обнаружения и идентификации его сверхнизких концентраций современными методами в биологических объектах до настоящего времени остается актуальной задачей судебно-химического и химико-токсикологического исследования. Одновременное обнаружение метаболитов феназепама и действующего вещества в нативном виде (бромдигидрохлорфенилбензодиазепин) позволяет достоверно утверждать о применении его пациентом/ потерпевшим и отсутствии ложноположительного результата при подлоге в виде добавления его в биологический объект. Из неинвазивных наиболее распространенным биологическим объектом в клинических лабораториях (в том числе в химико-токсикологических) является биологическая жидкость — моча [12, 13].

В настоящее время высокоэффективную жидкостную хроматографию — тандемную масс-спектрометрию (ВЭЖХ-ТМС) успешно применяют в качестве надежного селективного и чувствительного метода для скрининга, идентификации и количественной оценки малых молекул [14–16]. Цель исследования — разработать методику обнаружения феназепама и его основного метаболита методом ВЭЖХ-ТМС высокого разрешения (ВР) с использованием технологии Orbitrap для целей и задач судебно-медицинской экспертизы при наличии сверхнизких концентраций в биологическом объекте (моча).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

У пациентов (n = 6) отбирали образцы мочи утром натощак через 8 ± 1 ч после приема терапевтических концентраций феназепама (1 мг в таблетированной форме) по назначению врача при психосоматических расстройствах. Критерии включения пациентов: первичный прием препарата, позволяющий избегать депонирования и увеличения концентрации в организме человека. Критерии исключения: коморбидные пациенты с текущими назначениями психотропных препаратов; заболевания почек; лица старше 45 лет и моложе 25 лет. Средний возраст пациентов обоего пола составлял 34 ± 6 лет. Забор проб биологической жидкости производили неинвазивным способом, добровольно с согласия пациентов и на анонимных условиях.

Исследовали действующее вещество бромдигидрохлорфенилбензодиазепин лекарственного препарата «Феназепам» (ЛП-005121-191018) после очистки от вспомогательных веществ. Для исследования были получены рабочие образцы (РО) — спиртовой раствор с содержанием 1 мг/мл исследуемого вещества.

Для работы использовали: ВЭЖХ-ТМС с высоким разрешением и технологию Orbitrap [15, 16]; массспектрометр Oritrap Exploris 120 MS (ThermoFisher Scientific;

США), представляющий собой автономный прибор OrbitrapTM с источником ионизации при атмосферном давлении (ИАД) для высокопроизводительных задач массспектрометрии (МС) с жидкостной хроматографией (ЖХ).

Поскольку при направлении на судебно-медицинскую экспертизу для химико-токсикологического исследования симптоматика побочных эффектов у феназепама ярко выражена для производных бензодиазепина, пробоподготовку проводили по общепринятой схеме для соединений производных бензодиазепинов. Изолирование феназепама проводили в двух вариациях: 1) без проведения гидролиза: нативную мочу объемом 5 мл подщелачивали гидроксидом натрия (3–6 мл) до рН 10; 2) после солянокислого гидролиза методом жидкость– жидкостной экстракции: к 5 мл утренней мочи добавляли 5 мл концентрированной соляной кислоты и нагревали в закрытой пробирке на кипящей водяной бане в течение часа (кислотный гидролиз). Далее нейтрализовали, подщелачивая 60%-м гидроксидом натрия (3–6 мл) до рН 10. Затем в обоих вариантах экстрагировали дважды хлороформом по 10 мл в делительной воронке при умеренном ручном встряхивании в течение 3 мин. После отстаивания хлороформ сливали в выпарительную чашку и упаривали досуха на водяной бане, сухой остаток растворяли в 0,5 мл ацетонитрила и отправляли на исследование.

Условия хроматографирования ВЭЖХ-ТМС ВР

Программное обеспечение — Thermo Scientific Xcalibur 4.4 (Thermo Scientific; США); колонка TF Accucore PhenylHexyl column (100 × 2,1 мм, 2,6 мм), температура колонки 30 °С.

Предварительно разработали комбинированную подвижную фазу. Для повышения экспрессности анализа и уменьшения ширины хроматографических пиков использовали разные градиенты по составу подвижной фазы и изменяли скорость ее подачи. Подвижная фаза представлена в градиентном режиме: подвижная фаза A — 2 мM раствор аммония формиата 0,1%-й муравьиной кислоты (pH 3,0) в воде и подвижная фаза В — 2 мM раствор аммония формиата 0,1% муравьиной кислоты в смеси ацетонитрила и метанола (1 : 1). Скорость потока — 0,5 мл/мин. Градиентный режим представлен в табл. 1.

Детектирование проводили в режиме информационно зависимой фрагментации. Режим полного сканирования с обнаружением ddMS2 следующий: диапазон сканирования — 100–1000 m/z; RF Lens 50%, сбор данных с высоким разрешением Orbitrap 120 000 FWHM. Режим диапазона сканирования автоматический. Автоопределение времени инжекции ионов в ловушку. Порог интенсивности для фрагментации — 2000. Обнаружение вершины — 30%, изолирующее окно — 1 m/z, режим энергии столкновения — ступенчатый, тип энергии столкновения — абсолютный. Энергия диссоциации (HCD) — 15, 30, 45%. Разрешение для фрагментов — 30 000. Для оптимизации условий качественного и количественного анализа уточнение окон обнаружения проводили рутинным для лаборатории методом. Режим исключения ионов осуществляли после получения одного спектра за 3 с.

В работе использовали систему, оснащенную источником ионизации со следующими параметрами: тип ионного источника — H-ESI; напряжение электроспрея — положительная ионизация 3500 V; напряжение электроспрея — отрицательная ионизация 2500 V. Распыляющий газ — азот 50 отн. ед., вспомогательный газ — азот 13 отн. ед. Температура капилляра — 280 °C; температура испарителя — 350 °C. Встроенная подстройка массы — EASY-IC™ (флуорантрен).

Идентификацию нативного соединения феназепама и его метаболита после хроматографирования проводили при использовании библиотек масс-спектрометрической информации: TRACEFINDER 5.1 SP1; TOXFINDER 1.0; EFS_HRAM_Compound_Database; Toxicology_HRAM_Compound_Database; Thermo Scientific™ mzVault HRAM MS/MS spectral library; COMPOUND DISCOVERER 3.1; MzCloud.

Полученные результаты обрабатывали статистически с использованием t-критерия Стьюдента. Различия считали достоверными при доверительной вероятности р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Применение подобранного режима сканирования позволило получить максимальную чувствительность (ввиду отсутствия потерь в процессе соударительной ионизации), что необходимо при оценке временных окон обнаружения, так как при оптимизации метода на быстрое разделение могли возникнуть ложноотрицательные результаты изза низкой скорости сканирования, в то время как ее существенное повышение могло привести к значительному падению интенсивности сигналов, что очень важно при определении метаболитов при низких (терапевтических) концентрациях в биологических жидкостях (моче). Условия хроматографирования — комбинированный градиент подвижной фазы и температурный режим позволили уменьшить количество коэлюирующихся соединений из мочи и обеспечили получение достоверных результатов (рис. 1 и рис. 3).

При изолировании после гидролиза наблюдали только пик феназепама ( (2-амино,5-бром)-2ˈ-хлорбензофенон не обнаружили), а без гидролиза — феназепам и 3-гидроксифеназепам.

На представленных хроматограммах идентифицирован феназепам и его метаболит 3-гидроксифеназепам по избранным ионам. Обнаружение проводили по временам удерживания с последующей идентификацией после анализа характерных ионов масс-спектров данных соединений. Статистическая обработка значений времени удерживания приведена втабл. 2.

В организме феназепам метаболизируется до 3-гидроксифеназепама. Доля нативного феназепама, который выводится, составляет 47–89%, поэтому определение возможно и рекомендуется проводить по феназепаму.

При идентификации кроме времени удерживания значимым фактором являются спектральные характеристики исследуемых веществ (рис. 2).

Провели статистическую обработку полученных данных и валидационную оценку (табл. 3) по параметрам: «оценка переноса аналита», «определение интерференционных эффектов», «подавление/повышение ионизации» [17]. Параметры валидационных характеристик соответствуют критериям приемлемости.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Полученные полные спектры исследованных веществ с диссоциацией масс-спектров ионов, характерных фрагментам молекулы в различных функциональных группах, позволяют выделить характерные ионы для феназепама: 179, 183, 206, 242, 271, 285, 320, 348 (основной) m/z.

Согласно данным, представленным в табл. 3, можно выделить для каждого исследуемого соединения характерный ион, однако идентификацию необходимо проводить не менее чем по пяти. При исследовании возможно выполнение анализа в режиме селективного ионного мониторинга (SIM) по заданным ионам. Для феназепама наиболее интенсивным в масс-спектрах является ион с m/z 348. Следует отметить, что ионы, находящиеся в «неинформативном» диапазоне (т. е. менее 150 а.е.м.), присутствуют в обоих изучаемых соединениях, поэтому на результаты идентификации сильно влияют компоненты матрицы исследуемого образца и «фона» хроматографической колонки. Следовательно, рекомендовано оптимально использовать для идентификации данные более 150 а.е.м.

ВЫВОДЫ

Разработана методика идентификации феназепама в извлечениях из мочи методом ВЭЖХ-ТМС с ВР с использованием технологии Orbitrap для установления факта наличия феназепама в сверхнизких концентрациях в биологических объектах человека (на примере мочи) для использования в судебно-химическом и химикотоксикологическом исследованиях. Обнаружено и установлено время удерживания метаболита 3-гидроксифеназепама после перорального приема и определены характерные ионы для использования при идентификации. Проведена валидационная оценка разработанной методики по параметрам: «оценка переноса аналита», «определение интерференционных эффектов», «подавление/повышение ионизации», по которым она соответствует критериям приемлемости.