Пандемия новой коронавирусной инфекции (COVID-19), объявленная ВОЗ в марте 2020 г., потребовала серьезных усилий со стороны органов здравоохранения разных стран, в том числе России, по организации надзора за заболеваемостью и принятию мер по снижению риска заражения. С эпидемиологических позиций наиболее надежную защиту обеспечивает формирование коллективного иммунитета, который формируется либо естественным путем за счет возрастания в популяции доли невосприимчивых лиц, перенесших инфекцию в той или иной форме, либо благодаря вакцинации.

Для оперативного мониторинга состояния системы иммунитета целесообразно контролировать уровень циркулирующих антител класса IgG [1, 2]. Для этой цели необходимо использовать зарегистрированные тестсистемы, позволяющие количественно определить уровень антител против разных антигенов коронавируса (S, S1, RBD, N). Считается, что уровень антител к рецепторсвязывающему домену (RBD) S1-субъединицы шипового белка S наилучшим образом коррелирует с титром вируснейтрализующих антител, измеренных в реакции биологической нейтрализации [3].

Вместе с тем, до настоящего времени неясно, какой уровень антител может обеспечить достаточную защиту при встрече пациента с тем же, и, особенно, с новым вариантом коронавируса SARS-CoV-2, и как долго сохраняется необходимый уровень защиты после перенесенной инфекции или в результате вакцинации [4]. Показатели напряженности и длительности иммунитета сильно варьируют у пациентов [5] и в значительной степени зависят от пола, возраста, тяжести течения COVID-19 [6–9].

Изучение динамики гуморального иммунного ответа ограничивается, в основном, 6–8 месяцами после начала заболевания или вакцинации [5, 8, 9]. В связи с этим необходимы более продолжительные наблюдения для оценки индивидуальных особенностей формирования протективного иммунитета как основы для прогнозирования будущих тенденций в развитии пандемии [10], разработки персонализированных протоколов вакцинации [8] и лечения.

Представляется актуальным получить сведения о формировании и поддержании уровня IgG-антител к вирусу SARS-CoV-2 за наиболее продолжительный из описанных в литературе двухлетний период наблюдений.

Цель работы — оценить динамику уровней IgG к SARS-CoV-2 в двухлетнем контролируемом наблюдении сотрудников Государственного научно-исследовательского института биологического приборостроения и установить факторы, влияющие на напряженность и продолжительность гуморального иммунного ответа.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Пациенты

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики ФГУП «ГосНИИБП» в период с апреля 2020 г. по апрель 2022 г. В обследование включены 77 сотрудников института и 8 членов их семей, заболевших COVID-19 или прошедших вакцинацию в указанный период. Включение «семейных» случаев было обосновано возможностью расширения возрастного диапазона (16–88 лет) при оценке уровня и динамики IgG у переболевших и вакцинированных людей, а также установлением вероятных особенностей течения заболевания между совместно проживающими родственниками. Критерии включения: документально подтвержденный факт заболевания COVID-19 или вакцинации / ревакцинации (выписка из истории болезни, сертификат о профилактических прививках). Критерии исключения: неполная информация о пациенте; ошибка в маркировке или неадекватный вид образцов сыворотки (гемолиз, высыхание, микробный прирост).

Обследуемых (всего 155 человек) разделили на три группы (табл. 1): контрольная группа З — условно здоровые доноры (70 человек, сыворотки от которых были получены до начала пандемии для выполнения другого проекта [11]); группа Б — реконвалесценты (переболели COVID-19, не были вакцинированы до начала заболевания); группа В — вакцинированные (не болели COVID-19 до вакцинации, вакцинированы двумя дозами вакцины «Спутник V»).

В группе Б 24 из 42 (57,1%) переболевших прошли полный цикл вакцинации «Спутником V» через 6–22 (в среднем 13,5) месяца после начала заболевания; из них 3 человека позже были вакцинированы дополнительно «Спутником Лайт» (подгруппа Б + В).

В группе В 14 из 43 (32,6%) человек были ревакцинированы (РВ) бустерными дозами одной из вакцин (через 6–9 месяцев после введения первой дозы вакцины «Спутник V»): «Спутник V» — две дозы (8 человек), «Спутник Лайт» (4 человека) или «Ковивак» — две дозы (2 человека) (подгруппа В + РВ).

Все перечисленные выше вакцины: «Спутник V», «Спутник Лайт» (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи», Россия), Ковивак (ФГАНУ ФНЦИРИП им. М. П. Чумакова; Россия) зарегистрированы и разрешены к применению на территории Российской Федерации. Вакцинацию проводил медицинский работник в соответствии с инструкциями производителя.

Выделенные группы не различались статистически значимо по полу (всего 71 мужчина и 84 женщины) и возрасту (в среднем 52 года, диапазон от 16 до 88 лет).

От каждого участника получено от 1 до 12 порций сывороток крови, в том числе до начала заболевания (или вакцинации) и на разных сроках после начала заболевания (или введения первой дозы вакцины); всего 312 сывороток (табл. 1). До исследования аликвоты сыворотки хранили при –20 °С.

Согласно истории болезни (с учетом продолжительности госпитализации и степени поражения легких по результатам компьютерной томографии) среднетяжелое и тяжелое течение COVID-19 установлено у 11 из 42 (26,2%) заболевших группы Б; остальные перенесли заболевание в легкой форме.

Определение IgG к SARS-CoV-2

В 99 из 312 (31,7%) сывороток содержание IgG измерено иммунохемилюминесцентным методом на иммунохимическом анализаторе ARCHITECT i1000sr («Эббот лабораториз»; США) с помощью Набора «SARS-CoV-2 IgG II Quant Reagent Kit» («Эббот Ирландия Диагностическое подразделение»; Ирландия). Анализ был выполнен в компании INVITRO (Москва).

В 312 (100%) образцах сыворотки содержание IgG измерено на экспериментальном иммуночипе (ФГУП «ГосНИИБП»), разработанном на основе отечественной патентнозащищенной технологии фосфоресцентного анализа ФОСФАН, предназначенной для выявления маркеров инфекционных и соматических заболеваний [11–13]. Иммуноанализ проводили в лунках стандартных полистироловых микропланшетов аналогично методу твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА). В отличие от ИФА, на дне каждой лунки напечатаны восемь микрозон (диаметром 0,5 мм каждая), по четыре микрозоны на каждый из двух антигенов: рекомбинантный SARS-CoV-2 белок S-RBD: «уханьский» вариант (кат. № ATMP02479COV; AtaGenix, Китай) и рекомбинантный SARSCoV-2 белок S-RBD (L452R, T478K): вариант B.1.617.2, Дельта (код:YP-009724390.1, кат. № ATMP02527COV; AtaGenix, Китай).

Образцы сыворотки в разведении 1 : 100 вносили по 50 мкл в лунки микропланшета. После инкубации в течение 1,5 ч вносили по 50 мкл моноклональных антител против IgG человека («СОРБЕНТ»; Россия), биотинилированных (100 нг/50 мкл, инкубация 1 ч) и по 40 мкл конъюгата стрептавидина (Sigma-Aldrich; США) с платинакопропорфирином (13 нг/40 мкл, инкубация 30 мин). Все стадии выполняли при комнатной температуре и встряхивании на шейкере. Между стадиями проводили трехкратную промывку микропланшета буферным раствором, а на финальной стадии — дополнительную трехкратную промывку дистиллированной водой. Микропланшет высушивали и измеряли интенсивность фосфоресценции на приборе-индикаторе ИФИ-05 («Иммуноскрин», Россия; РУ № РЗН от 21 января 2022 г.) путем сканирования дна лунок в режиме временного разрешения.

Концентрацию IgG рассчитывали (в BAU/мл) по калибровочным кривым для каждого из двух антигенов иммуночипа. Калибровочные пробы были аттестованы относительно первого международного стандарта ВОЗ. Диапазон измерений: 0–10000 BAU/мл. Качество измерений контролировали с использованием положительной контрольной сыворотки (от переболевшего COVID-19 человека) с уровнем IgG примерно 500 BAU/мл и отрицательной контрольной сыворотки (приготовлена на основе сыворотки, полученной от условно здорового донора до начала пандемии; по данным тестирования в коммерческом тесте не содержит IgG к SARS-CoV-2), которые включали в каждую постановку анализа. Результат исследования пробы считали положительным (антитела выявлены) при содержании IgG ≥ 10,0 BAU /мл.

Статистическая обработка

Статистическую обработку результатов проводили с помощью стандартных программ Microsoft Office Professional Plus Excel 2013 версии 15.0.4727.1000 (Microsoft; США) и MedCalc версии 10 (MedCalc Software; Бельгия) с использованием параметрических и непараметрических методов анализа данных. Степень корреляции результатов оценивали по методу Пирсона, а достоверность различий — по критерию Maнна–Уитни для уровня значимости р ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Установлена высокая степень корреляции между уровнями IgG, измеренными в коммерческом тесте и на иммуночипе с «уханьским» вариантом SARS-CoV-2 (r = 0,928544; N = 99) или вариантом Дельта (r = 0,933363; N = 99); коэффициент корреляции результатов между двумя вариантами вируса составил 0,978057 (N = 312). С учетом этого результаты выявления IgG представлены только для иммуночипа c «уханьским» вариантом вируса.

Распределение случаев заболевания COVID-19 среди участников обследования представлено на рис. 1. Первые случаи зарегистрированы в апреле 2020 г. с максимальным числом заболевших в мае того же года. С сентября 2020 г. по январь 2021 г. отмечена вторая волна подъема заболеваемости: заболели 27 из 42 (64,3%) человек группы Б. С июля по октябрь 2021 г. заболели шесть человек; из них пятеро не были вакцинированы, тогда как один ранее переболел COVID-19 и был вакцинирован «Спутником V» через 10 месяцев после выздоровления. 

Вакцинация стартовала с конца декабря 2020 г. Уже к апрелю 2021 г. полный цикл вакцинации «Спутником V» прошли 30 из 43 (69,8%), а к октябрю того же года — 100% участников группы В. Два человека этой группы заболели в январе 2022 г. через шесть месяцев после введения первой дозы вакцины (рис. 1).

У людей старшего возраста (60+), перенесших COVID-19, уровень IgG был статистически значимо выше (р = 0,0268), чем у людей моложе 60 лет. Наоборот, после полного цикла вакцинации неболевших людей выявлена статистически значимая отрицательная корреляция с возрастом (р = 0,0191). Пол пациента не оказывал статистически значимого влияния на уровень антител (табл. 2).

Большинство заболевших (73,8%) перенесли заболевание в легкой форме. Среднетяжелое и тяжелое течение отмечено у 11 (26,2%) человек. Эти случаи были равномерно распределены по месяцам в течение периода наблюдений. Мужчины тяжело болели чаще (восемь из 22 или 36,4%), чем женщины (три из 20 или 15%); различия, однако, статистически незначимы из-за малого объема выборки. Возраст заболевших с тяжелым течением COVID-19 составил 35–77 лет (в среднем 58 лет). Из восьми тяжело болевших мужчин лишь трое были старшего возраста (70–77 лет), тогда как возраст остальных не превышал 53 лет.

Отмечена высокая гетерогенность уровней антител как у переболевших COVID-19 (рис. 2А), так и у вакцинированных двумя дозами «Спутника V» людей (рис. 2Б), особенно на ранних сроках после начала болезни или введения первой дозы вакцины (рис. 2А, Б).

У вакцинированных уровень IgG снижался постепенно (рис. 2В). Максимальное значение (медиана 195,3; 95% ДИ: 45,5–403,2 BAU/мл) отмечено на 37–55-й день после введения первой дозы вакцины. К 3–4 месяцу уровень антител снизился в два раза (медиана 108,7; 95% ДИ: 75,1–147,2 BAU/мл), а к 7–9 месяцу — в четыре раза (медиана 48,7; 95% ДИ: 29,8–145,7 BAU/мл). У реконвалесцентов отмечен схожий характер снижения IgG (рис. 2В). Исключение составил уровень антител к третьему–четвертому месяцу от начала заболевания. Его значение (медиана 249,8; 95% ДИ: 94,9–427,5 BAU/мл) было статистически значимо выше (р = 0,029) по сравнению с вакцинированными на аналогичном сроке после введения первой дозы вакцины. Через 5–9 месяцев содержание антител стабилизировалось на уровне менее 100 BAU/мл (рис. 2В) примерно у 60% обследованных.

В целом, измеренные уровни антител у реконвалесцентов группы Б (медиана 97,1; 95% ДИ: 80–162 BAU/мл) и вакцинированных группы В (медиана 103,1; 95% ДИ: 78–139 BAU/мл) были сопоставимы и статистически значимо выше (р < 0,0001), чем у условно здоровых доноров (медиана 4,3; 95% ДИ: 4,1–4,5 BAU/мл). Вакцинация переболевших (подгруппа Б + В) или введение бустера вакцинированным (подгруппа В + РВ) приводили к статистически значимому (р < 0,0001) повышению напряженности иммунного ответа: до значений медианы 1023 BAU/мл (95% ДИ: 657–1191) и 413 BAU/мл (95% ДИ: 213–545 BAU/мл) соответственно (рис. 3).

За весь период наблюдений выявлено три «новых» случая заболевания COVID-19 (рис. 1, табл. 3), подтвержденных положительным результатом ПЦР. Заболели три женщины в возрасте 40–43 года. Из них двое ранее не болели COVID-19, одна переболела примерно за 16 месяцев до нового заболевания. Все заболели после полного цикла вакцинации «Спутником V» примерно через шесть месяцев после введения первой дозы вакцины; у всех отмечено легкое течение заболевания.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Определено достоверное влияние возраста на уровень IgG (табл. 2). У реконвалесцентов старшего возраста (60+) уровень антител был статистически значимо выше, чем у людей моложе 60 лет. Наоборот, у людей не болевших, но прошедших полный цикл вакцинации, отмечена отрицательная корреляция с возрастом. Аналогичные закономерности выявлены и в других работах [6, 7].

Статистически значимое влияние пола на уровень антител при COVID-19 выявить не удалось вследствие ограниченного объема выборки. Вместе с тем, очевидно, что гормональный фон, обусловленный биологическими различиями между мужчинами и женщинами, может влиять на характер иммунного ответа. По нашим данным, уровень антител у мужчин был почти в два раза ниже, чем у женщин (табл. 2), при этом мужчины в два раза чаще, чем женщины, болели COVID-19 в среднетяжелой и тяжелой форме.

Эти наблюдения согласуются с результатами исследований репрезентативных выборок пациентов [6, 14, 15]. По некоторым данным, у мужчин отмечен сниженный уровень CD4⁺-Т-клеток и CD19⁺-В-клеток, играющих ключевую роль в формировании гуморального и клеточного иммунитета в защите от COVID-19 [6]. Это может обусловить замедленное формирование протективных антител к рецепторсвязывающему домену белка S1 коронавируса. У женщин уровень IgG резко возрастал и достигал пика на четвертой неделе после появления клинических симптомов, тогда как у мужчин уровень антител повышался постепенно с пиком на седьмой неделе [6, 14]. Факт замедленного формирования антител в сочетании с комплексом других клинических и биохимических данных позволил рассматривать мужской пол пациента как фактор риска более тяжелого течения COVID-19 и смерти [6, 9].

Нам не удалось проследить влияние тяжести заболевания на уровень и динамику протективного иммунитета, хотя сведения о наличии такой связи имеются [7]. К сожалению, мы располагали только «поздними» образцами, собранными, в основном, не ранее 7–12 месяцев от начала заболевания в связи с отказом сотрудников, перенесших COVID-19 в среднетяжелой и тяжелой форме, предоставить образцы вскоре после выздоровления.

Анализ «семейных» случаев заболевания у трех сотрудников Института не выявил каких-то закономерностей в характере течения COVID-19 у совместно проживающих с ними родственников (всего шесть человек), заболевших с интервалом в 2–3 дня. Двое сотрудников (женщина 63 лет и мужчина 58 лет) перенесли заболевание в легкой форме; из числа их родственников (три человека в возрасте 26–78 лет и два человека 16 и 42 лет, соответственно) только один (78 лет) был госпитализирован в состоянии средней тяжести. Третья сотрудница (62 лет) болела в критически тяжелой форме, однако ее муж (65 лет) перенес заболевание легко.

Напряженность гуморального иммунитета зависела от срока после начала заболевания или введения первой дозы вакцины. Уровень IgG у вакцинированных быстро снижался уже к 3–4 месяцу наблюдений (рис. 2Б), что согласуется с данными литературы [8]. Уровень антител у реконвалесцентов на 3–4 месяце наблюдений был статистически значимо выше (р = 0,029), чем у вакцинированных (рис. 2Б). Это обусловлено вкладом сывороток с высоким уровнем антител от пациентов старшего возраста обоих полов, прежде всего мужчин, уровень антител у которых достиг максимальных значений на данном сроке (данные не представлены). Полученные результаты подтверждают вывод о положительной корреляции между возрастом и уровнем IgG у переболевших COVID-19 (табл. 2) и, по-видимому, косвенно свидетельствуют о замедленном формировании протективного иммунитета у мужчин, что было отмечено ранее [6].

В целом, к 5–9 месяцу содержание антител снижалось, стабилизируясь на уровне менее 100 BAU/мл (рис. 2В) примерно у 60% обследованных, что отмечено и другими [10]. Вместе с тем, выявлены значительные индивидуальные различия в динамике гуморального иммунного ответа между участниками обследования, от которых удалось получить не менее двух порций сывороток. Если у каждого из вакцинированных уровень IgG постепенно снижался, как было отмечено ранее для интегрального показателя по данной группе (рис. 2Б, рис. 2В), то у некоторых пациентов, перенесших COVID-19, уровень протективного иммунитета оставался неизменным до конца периода наблюдений (данные не представлены).

За весь период наблюдений выявлено лишь три «новых» случая заболевания после полного цикла вакцинации «Спутником V» (рис. 1, табл. 3). Люди заболели в легкой форме в октябре 2021 г. и в январе 2022 г., то есть в период доминирования в Москве высококонтагиозных вариантов «Дельта» и «Омикрон» коронавируса с ежедневным приростом заболевших до 9000 и 26 000 человек соответственно [16, 17]. Вместе с общим числом (табл. 1) вакцинированных неболевших (43 человека) и вакцинированных переболевших людей (24) частота заболевания COVID-19 среди вакцинированных составила 4,5%. Эти данные согласуются с известными сведениями о том, что вакцина «Спутник V» не обеспечивает 100% защиты [18, 19], однако способствует более легкому течению COVID-19 у вакцинированных [20].

Следует отметить, что у одной из трех заболевших после вакцинации пациенток уровень IgG на момент начала заболевания был низким (37,2 BAU/мл). У двух других содержание антител составило 360,5 и 617,2 BAU/мл на 42-й или 90-й день от введения первой дозы вакцины, соответственно (табл. 3), т. е. за 3–4,5 месяца до начала заболевания; этот уровень, однако, мог снизиться в два раза и более к моменту нового заражения, если учитывать динамику IgG у вакцинированных (рис. 2Б). Хотя до настоящего времени неясно, какой уровень антител может обеспечить достаточную защиту при встрече пациента с тем же, и, особенно, с новым вариантом коронавируса SARSCoV-2 [4], наличие антител, безусловно, не единственный фактор защиты от COVID-19 [9]. Отсутствие новых случаев заболеваний у 95,5% обследованных, среди которых значительная часть была с уровнем циркулирующих антител ниже 100 BAU/мл (рис. 2В), позволяет согласиться с мнением о том, что длительный протективный иммунитет в значительной степени обеспечивается за счет комплексного взаимодействия факторов гуморального и клеточного иммунитета [5].

Важная особенность работы состоит в использовании иммуночипа, позволяющего оценить уровень антител к рецепторсвязывающим доменам одновременно двух вариантов SARS-CoV-2 («уханьского» и «Дельта»). Результаты приведены для первого варианта, поскольку измеренные с каждым из вариантов уровни антител практически совпадали (r = 0,978057). Это позволяет предположить, что иммунный ответ у переболевших COVID-19 и вакцинированных «Спутником V» обеспечивает эффективную защиту от обоих вариантов, что было отмечено ранее [21]. Вместе с тем, такое совпадение установлено только для сывороток пациентов, заболевших с апреля 2020 г. по январь 2021 г., т. е. в первые две волны подъема заболеваемости среди сотрудников (рис. 1), когда заболевания COVID-19 были в значительной мере обусловлены «уханьским» (референсным) и местными российскими вариантами вируса [22, 23]. У заболевших с июля по октябрь 2021 г. (третья волна заболеваемости на рис. 1) отмечен не менее чем в два раза более высокий уровень антител к варианту Дельта, который в тот период доминировал в популяции [17, 23].

Повышение мультиплексности анализа и, как следствие, его информативности — это общемировая тенденция, связанная с возможностью объединения нескольких тестов в едином формате за счет миниатюризации и создания микроэррев высокой плотности. Сложные мультиплексные технологии на основе методов хемилюминесценции и проточной цитофлуориметрии (например, тесты компаний Мерк, Люминекс и др.) обеспечивают возможность одновременного выявления до 100 различных маркеров и наиболее хорошо подходят для оценки комплексного ответа иммунной системы при изучении различных аспектов COVID-19 [24, 25]. Вместе с тем, такие тесты дорогостоящие, требуют сложного оборудования и высокой квалификации оператора.

На наш взгляд, для целей мониторинга преимущества имеют более простые и экономичные тесты, такие как ФОСФАН. Действительно, совокупность полученных данных (высокая степень корреляции с коммерческим тестом, выявление особенностей связывания специфичных антител с рецепторсвязывающими доменами двух вариантов нового коронавируса) с учетом принципиальной возможности построения мультиплексных тестов различного дизайна в зависимости от задач исследования (например, использование в составе иммуночипа более широкого спектра диагностически значимых антигенов, внутренних положительных и отрицательных контролей) подтверждает предположение о том, что технологическая платформа ФОСФАН может иметь хорошие перспективы для целей мониторинга уровня циркулирующих антител у перенесших COVID-19 и вакцинированных людей. Возможно, разработанный иммуночип позволит не только выявлять специфичные антитела, но и дифференцировать варианты вируса на основе статистически значимых различий в титрах антител, по крайней мере, у ранее не болевших COVID-19 и не вакцинированных пациентов. Подробный разбор этой ситуации выходит за рамки настоящего исследования и будет представлен позже.

ВЫВОДЫ

1. Показатели напряженности и продолжительности иммунного ответа у переболевших COVID-19 и вакцинированных людей сильно варьируют в зависимости от возраста, срока наблюдения, дополнительной вакцинации / ревакцинации. 2. Уровень IgG был статистически значимо выше: у людей старшего возраста (60+), переболевших COVID-19, по сравнению с людьми моложе 60 лет; у переболевших COVID-19 и вакцинированных «Спутником V» по сравнению с неболевшими и невакцинированными людьми; у переболевших после последующей вакцинации и у вакцинированных после введения бустера. 3. Уровень IgG был статистически значимо ниже у вакцинированных старшего возраста (60+) по сравнению с людьми моложе 60 лет. 4. Уровень IgG у вакцинированных снижался быстрее (через 3–4 месяца), чем у переболевших COVID-19, а через 5–9 месяцев стабилизировался на уровне менее 100 BAU/мл примерно у 60% обследованных. 5. Частота заболевания COVID-19 среди вакцинированных составила 4,5% (трое заболевших из 67 вакцинированных человек). 6. Мультиплексный анализ с использованием иммуночипа — перспективный подход к количественному определению уровня антител одновременно к двум и, возможно, более вариантам нового коронавируса SARS-CoV-2.