Mycobacterium tuberculosis является этиологическим агентом туберкулеза и занимает одно из лидирующих мест среди причин смертельных случаев, вызванных инфекционными агентами. Основные проблемы в лечении туберкулеза включают рост числа случаев заражения штаммами с множественной (МЛУ) и широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), ко-инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) [1]. В настоящее время терапия туберкулеза включает препараты первого ряда, прием которых занимает 6–9 месяцев и имеет серьезные побочные эффекты [2]. Лечение МЛУ/ШЛУ требует гораздо большей продолжительности и включает противотуберкулезные препараты второго ряда в дополнение к препаратам первого ряда, пиразинамиду и высоким дозам изониазида [3]. Несмотря на имеющуюся этапность режимов лечения, рост числа случаев МЛУ и ШЛУ создает новые препятствия для существующей лекарственной терапии [4]. Таким образом, становятся очевидными потребность в совершенствовании лекарственных препаратов и способов борьбы с инфекцией, а также необходимость разработки новых вакцинных препаратов.

M. tuberculosis передается преимущественно воздушно-капельным путем, при вдыхании аэрозоля, содержащего клетки возбудителя [5]. После попадания в легкие бактерии инфицируют альвеолярные макрофаги и обходят иммунный ответ хозяина [6]. Для дальнейшего распространения в организме микобактерии подавляют защитный механизм, используемый макрофагами, включая аутофагию, окисление фагосом и выброс активных форм кислорода и азота [7, 8]. Кроме того, инфицированные макрофаги продуцируют хемокины, которые привлекают воспалительные клетки, включая нейтрофилы и естественные клетки-киллеры, что способствует дальнейшему развитию воспаления и образованию многоядерных гигантских клеток, называемых гранулемами [9]. Таким образом, именно гранулемы, обеспечивают нишу для жизнедеятельности бактерий, а также служат резервуаром для распространения инфекции.

Секретируемые M. tuberculosis белки (секретом) играют ключевую роль в нарушении иммунного ответа и прогрессировании внутриклеточного роста [10, 11]. Ранний секретируемый антиген (ESAT-6), важный фактор вирулентности M. tuberculosis, известен тем, что регулирует иммунный ответ хозяина путем подавления провоспалительных реакций, таких как выработка интерферона гамма (IFN) [12] и интерлейкина-12 (IL12) [13]. Кроме того, ESAT-6 стимулирует выработку IL6 в макрофагах [14] и играет важную роль в индуцировании поляризации макрофагов и их перехода в эпителиоидные макрофаги, являющиеся основной составляющей туберкулезной гранулемы [15, 16]. Показано, что секретируемый эффектор Rv1988 метилирует гистоновые белки клетки хозяина и таким образом эпигенетически модулирует антимикобактериальные функции макрофагов [17]. Все это подтверждает значительную роль белков M. tuberculosis в вирулентности [18]. Помимо того, высокопроизводительный скрининг протеома в масштабе всей системы потенциальных антигенов M. tuberculosis может быть использован для создания новых вакцин [19].

Несмотря на то что геном M. tuberculosis был широко изучен еще в начале 2000-х гг., анализ протеома M. tuberculosis отставал из-за сложных протоколов выделения белков и необходимости использования сложного и дорогостоящего оборудования [20]. Более 30% протеома до сих пор не охарактеризовано и представлено гипотетическими белками [21]. Расшифровка функции этих белков будет способствовать лучшему пониманию физиологии и вирулентности M. tuberculosis. Очевидно, что она возможна только с привлечением других омиксных технологий, таких как транскриптомика и протеогеномика. Несомненно, что важны идентификация и характеристика всех генов, но особое внимание стоит уделить генным продуктам, ответственным за вирулентность и патогенез. Можно определять как транскрипты, так и белковые продукты и метаболиты, в том числе количественно, что позволит выявить различия в патогенности и лекарственной устойчивости между линиями и штаммами M. tuberculosis. В целом, комбинация таких подходов может помочь в поиске новых мишеней для противотуберкулезных препаратов, а также реализации стратегии ВОЗ «Покончить с туберкулезом».

Геномика

На сегодняшний день представление о генетическом потенциале изучаемого объекта будет определять дальнейшую стратегию любого исследования. Впервые полный геном M. tuberculosis H37Rv был опубликован в 1998 г. [22], а развитие технологий секвенирования привело к тому, что на сегодняшний день в базе данных NCBI содержится более 13 тыс. геномов M. tuberculosis. Однако стоит отметить, что большинство из них не собраны в кольцо. Долгое время аннотация M. tuberculosis H37Rv (27-я версия согласно базе данных TubercuList (http://tuberculist. epfl.ch/), содержащая 4018 белок-кодирующих генов, из которых 26% относятся к классу белков с гипотетической функцией, являлась референсной и наиболее полной. В 2019 г. была опубликована полная последовательность штамма RUS_B0, относящегося к семейству Beijing [23].

Микобактерии обладают всеми генами, необходимыми для синтеза незаменимых аминокислот, витаминов, ферментов и кофакторов. Было отмечено, что они имеют высокую долю генов, кодирующих ферменты, участвующие в липогенезе и липолизе. Кроме того, M. tuberculosis обладает генами, необходимыми для синтеза гликолитических ферментов и ферментов анаболического пентозофосфатного пути, который генерирует NADPH и пентозы, ферменты цикла Кребса и глиоксилатного цикла, который синтезирует углеводы из жиров. Туберкулезная палочка обладает также ферментами, используемыми в аэробном, микроаэрофильном и бескислородном переносе электронов. Показано, что микобактерии способны выживать в различных условиях среды, в том числе богатых кислородом легких, макрофагах и в центре казеозных гранулем [24].

Геном микобактерий богат генами метаболизма жирных кислот, в том числе миколовых, содержащих кислые аспарагин- и глицинбогатые полипептиды. Большую часть генома составляют также гены белков семейств PE (proline-glutamate, n = 99) и PPE (proline-proline-glutamate, n = 68), вариабельность которых, предположительно, обеспечивает различия антигенов и способность ингибировать иммунный ответ [25].

Одной из особенностей генома M. tuberculosis является большое число повторяющихся последовательностей ДНК. Например, инсерционные элементы IS (от англ. insertion sequences), способствующие ДНК-полиморфизму микобактерий, и вариабельное количество тандемных повторов VNTR (от англ. variable number of tandem repeats). Наряду с IS-элементами содержатся прямые повторы DR  (от англ. direct repeat region), разделенные вариабельными последовательностями — спейсерами, а также основные полиморфные тандемные повторы MPTR (от англ. major polymorphic tandem repeat) и полиморфная GC-богатая повторяющаяся последовательность PGRS (от англ. polymorphic GC-repetitive sequence). Все эти особенности генома M. tuberculosis легли в основу методов диагностики и типирования патогена: полиморфизм длин рестрикционных фрагментов IS6110 (RFLP-типирование) [26], сполиготипирование [27], VNTR-типирование [28]. Дополнительно, в геноме H37Rv были обнаружены последовательности профагов phiRv1 и phiRv2. В связи с тем, что они не были обнаружены в геноме авирулентных H37Ra и M. bovis BCG, их ассоциируют с факторами патогенности.

Разработка более специфичных методов типирования, например, включающая лекарственную устойчивость и вирулентность внутри определенных семейств M. tuberculosis, требует доподлинно установить функции конкретных генов, их вклад в метаболизм клетки и тем более реализацию уникальных особенностей патогена. Безусловно, определить все это возможно только с использованием дополнительных методов, таких как транскриптомный и протеомный анализ.

Протеомика

Протеомика является важным инструментом идентификации как известных, так и новых белковых мишеней, которые являются частью системы вирулентности и защитных механизмов клетки, а также ключевым звеном взаимодействия хозяина и патогена. Повышение и снижение синтеза тех или иных белков, связанных с иммунитетом хозяина, с вирулентностью патогена, указывают на их роль в защитных механизмах или патогенезе. Такая регуляция и снижение регуляции полезны для идентификации белков, которые могут оказаться важными в качестве мишеней для лекарств или разработки диагностических инструментов, представляющих различные стадии патогенеза и уровень развития инфекции. Начиная с идентификации любого такого белка для установления его в качестве лекарственной мишени или диагностического маркера, а также для мониторинга кинетики содержания белков в различных органах в ответ на инфекцию, необходимо использовать подход, включающий следующие последовательные шаги: идентификация новых мишеней, проверка их роли in vitro, сравнительный анализ уникальности и специфичности мишени, верификация действия мишени в моделях in vivo.

Методы протеомного анализа наиболее полно были описаны ранее [20], где в том числе рассмотрены основные результаты протеомного анализа возбудителя туберкулеза. На сегодняшний день они дополнены сведениями об интеграции протеомных и транскриптомных данных, например, для представителей кластера Bejing B0/W148 проведен системный омиксный анализ [23], позволивший выявить дополнительные уникальные особенности представителей.

Актуальность проведения непосредственно системного подхода обусловлена и тем, что наличие транскрипта, в том числе высоко представленного, не всегда ведет к синтезу белка. Соответственно без протеомного анализа транскриптомика не в полной мере показательна. В свою очередь протеомный анализ позволяет зафиксировать конечный продукт, при этом дополнение указанных данных транскриптомными позволяет в большей степени понять физиологию клетки. Существенным недостатком, на сегодняшний день, является также разрозненность характера вновь получаемых данных. Очевидно, что необходимо помещать каждое открытие в контексте других и рассматривать систему как единое целое при разработке диагностических панелей.

Транскриптомика

Как было сказано выше, бактерии должны крайне быстро адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды, и соответственно изменения в экспрессии генов, возникающие в ответ на защитную реакцию организмахозяина либо на действие лекарственных препаратов, являются необходимым условием для выживания и функционирования патогенов. Изучение транскриптома (полного набора транскриптов, производимого бацктерией) в первую очередь дополняет данные секвенирования генома, и для этого используют различные подходы. Методы, применяемые для анализа транскриптомов микобактерий, подробно рассмотрены ранее [29].

Безусловно, основные открытия транскриптомики связаны с изучением резистентности возбудителя туберкулеза. Развитие технологий способствовало появлению ДНКмикрочипов, которые явились мощным инструментом для изучения дифференциальной экспрессии генов, в том числе в условиях in vivo [30]. Однако данный метод не нашел применения в диагностике. Использование транскриптов в качестве диагностических мишеней имеет ряд существенных недостатков, основным из которых является время жизни. Тем не менее транскриптомика является крайне существенной для понимания метаболизма клетки и использования остальных омиксных данных в диагностике. Так как применение именно системного анализа позволило выявить комплексные изменения в представленности белков (на транскриптомном и протеомном уровнях), ответственных за биосинтез жирных липидов в вирулентных штаммах M. tuberculosis [23, 31, 32].

Последнее в свою очередь продемонстрировало актуальность понимания того, как различные молекулярные части генома (гены и транскрипты) интегрируются в сети, отражающие метаболизм, регуляцию, сигнализацию и белок-белковые взаимодействия. 

Метаболомика

Метаболические пути лежат в основе функционирования клетки. Их изучение и реконструкция метаболизма являются важным шагом в моделировании клеточной деятельности и, что самое важное, понимании глубинных механизмов на системном уровне.

Микобактерии обязаны многими своими уникальными свойствами миколовым кислотам — компонентам их клеточных стенок. В ряде работ показана важность миколовых кислот для роста, выживания и патогенности бактерий [33]. Именно поэтому биосинтез миколовых кислот стал предметом многих биохимических и генетических исследований [34]. Так, была построена подробная модель синтеза миколовой кислоты в M. tuberculosis, включающая 197 метаболитов, участвующих в 219 реакциях, катализируемых 28 белками. В ходе сравнительного анализа метаболических путей M. tuberculosis H37Rv и человека было показано, что AccD3, Fas, FabH, Pks13, DesA1/2, DesA3 являются потенциальными мишенями для разработки противотуберкулезных препаратов [35].

Непрерывное накопление данных о белках M. tuberculosis, расшифровка их ферментных свойств позволили смоделировать ряд метаболических сетей микобактерий. Так, геномная метаболическая сеть GSMN (от англ. genome-scale metabolic network) включает в себя 849 уникальных реакций с участием 739 метаболитов и 726 генов [36]. Следует отметить, что на сегодняшний день многое остается неясным из-за неполной характеристики некоторых белков и неполной информации об их биохимических реакциях. В то же время использование имеющихся метаболических сетей позволило определить 318 белков, необходимых для роста микобактерии [35]. Таким образом, можно предположить, что именно эти 318 белков играют важную роль в поддержании их метаболизма.

Белок-белковые взаимодействия формируют основу для путей передачи сигнала в клетке, а также различных транскрипционных регуляторных сетей. Наиболее расширенная версия сети протеомных взаимодействий M. tuberculosis H37Rv на сегодняшний день представлена базой данных STRING [37]. STRING включает литературные данные, описывающие взаимодействия, изученные экспериментально, а также полученные в результате анализа генома с использованием биоинформатических алгоритмов. Таким образом, сеть охватывает различные типы прямых или опосредованных взаимодействий и связей, таких как: а) физическое образование комплекса между двумя белками, необходимыми для формирования функциональной единицы; б) корегуляция генов, принадлежащих к одному оперону или к общему соседству; в) взаимодействие белков в данном метаболическом пути и, следовательно, влияющих друг на друга; г) связи между белками на основе преобладающего сосуществования, совместной экспрессии или слияния доменов. Сеть является первым комплексным представлением о связях между различными белками, аналогичным получению карты дорог города. В настоящее время наполнение базы данных происходит непосредственно в ходе интеграции системного анализа, в том числе основной акцент делается на экспериментальном уточнение предсказанных взаимосвязей. На основе этой информации была получена матрица функционального расстояния и последующий индекс близости белков, которые помогают понять, как влияние конкретно взятого белка может распространяться на метаболическую сеть в целом. Данный индекс был использован для прогнозирования стратегии максимального нарушения метаболизма путем ингибирования наименьшего количества белков. В ходе исследования было установлено, что ингибирование комбинации из четырех белков одновременно может повлиять суммарно на 471 белок, относящийся к 33 путям, что приводит к нарушению метаболизма на 75% [38]. 

Омиксы в диагностике

В области поисков биомаркеров туберкулеза исследования идут непрерывно, выявлено множество перспективных кандидатов для определения риска заражения, риска заболевания, вероятности излечения и защиты от инфекции [39]. Большинство таких биомаркеров связаны с иммунитетом организма хозяина и включают в себя белки, метаболиты, клеточные маркеры и транскрипты [40]. Несмотря на многочисленные сообщения о корреляции с различными стадиями туберкулеза, особенно у детей [41], на сегодняшний день нет коммерчески доступных прогностических биомаркеров. Безусловно, это говорит о недостаточной клинической значимости описанных маркеров и необходимости ведения дальнейших поисков.

Наибольшие успехи были достигнуты в области молекулярного тестирования как на наличие M. tuberculosis, так и на лекарственную устойчивость с использованием геномных данных. Так, Xpert XDR (Cepheid; CA, США) позволяет обнаружить генетический материал M. tuberculosis вместе с мутациями, вызывающими устойчивость к рифампицину, изониазиду, инъекционным препаратам и фторхинолонам. В свою очередь российский аналог, гидрогелевые чипы разработки Института молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН [42], в частности ТБ-ТЕСТ, позволяет проводить типирование и одновременно определять устойчивость суммарно по 114 генетическим детерминантам: из них 28 мутаций — в гене rpoB, ответственных за устойчивость к рифампицину; 11 мутаций — в гене katG, по пять мутаций — в inhA и ahpC, приводящих к устойчивости к изониазиду; 18 — в embB, ответственных за устойчивость к этамбутолу; 15 — в gyrA; 23 — в gyrB, ответственных за устойчивость к фторхинолонам; 4 — в rrs; 5 — в eis, приводящих к устойчивости к аминогликозидам и капреомицину [43].

Полногеномное секвенирование становится все более привлекательным вариантом для выявления лекарственной устойчивости у M. tuberculosis и может быть также использовано для улучшения понимания передачи туберкулеза [44]. Эта технология основана на выявлении мутаций в геноме M. tuberculosis, ассоциированных с лекарственной устойчивостью, и данные показывают корреляцию между генетическими мутациями и результатами культурального исследования лекарственной чувствительности, по крайней мере, для четырех препаратов первого ряда (изониазид, рифампицин, этамбутол и пиразинамид) [45, 46]. В то же время некоторые расхождения в данных фенотипического и генетического профиля лекарственной устойчивости свидетельствуют в пользу того, что, не всегда используя геномные данные, можно однозначно установить лекарственную чувствительность бактерии. Принимая во внимание тот факт, что структура популяции M. tuberculosis неоднородна и имеет свои особенности, в том числе региональные, можно говорить о разработке региональных диагностических тест-систем. Известно, что на территории нашей страны превалируют штаммы семейства Beijing (50–80% всех случаев) [47]. Для данного генетического семейства доказаны строгая ассоциация с формированием лекарственной устойчивости и большая вирулентность по сравнению с другими генотипами [48]. Последнее подтверждено как на уровне in vivo моделей [49], так и на уровне эпидемиологических исследований. Повышенная представленность факторов вирулентности продемонстрирована для штаммов семейства Beijing на молекулярном уровне, в том числе и в ходе симтемного омиксного анализа [23, 32, 50].

Принимая во внимание все вышесказанное, можно предположить, что наиболее перспективна ранняя диагностика именно штаммов семейства Beijing. В контексте данной задачи на сегодняшний день наиболее актуально использование микрофлюидного безмаркерного биосенсора на поверхностных оптических волнах в одномерном фотонном кристалле (ПВФК-биосенсора). ПВФК-биосенсор позволяет анализировать широкий диапазон взаимодействий: от образования различных белокбелковых комплексов до взаимодействия олигонуклеотидов различной последовательности. Основным преимуществом технологии является прохождение реакций в изолированной зоне минимального объема, что исключает контаминацию, сокращает время анализа, делает удобной процедуру анализа для оператора. Регистрация таких взаимодействий проводится в реальном времени и не требует предварительного мечения целевых биомолекул [51], что в свою очередь значительно упрощает и ускоряет процесс анализа.

С учетом потенциала ПВФК-биосенсора с двумерным пространственным разрешением [52] нами был предложен принципиально новый метод типирования возбудителя туберкулеза [53]: модификация поверхности фотонного кристалла декстраном и использование системы из олигонуклеотидов для детекции одноцепочечной ДНК M. tuberculosis. Стоит отметить, что метод модификации поверхности оптимизирован непосредственно для детекции туберкулезной ДНК [54]. Дополнительно предложен вариант упрощенной дифференциальной детекции штаммов семейства Bejing и LAM как наиболее распространенных на территории нашей страны. Такой подход позволит не только упростить сам процесс диагностики, но и снизить затраты на разработку и производство диагностической тест-системы. При этом саму платформу можно использовать для протеомного типирования M. tuberculosis.

Для диагностики латентной туберкулезной инфекции в настоящее время используют два основных иммунных подхода, которые включены в руководство ВОЗ [55]: туберкулиновый кожный тест TST (от англ. tuberculin skin test) и тест на высвобождение интерферона-γ IGRA (от англ. interferon-γ release assay). Хотя IGRA обладает более высокой специфичностью, по сравнению с TST, ни один из этих тестов не позволяет точно отличить латентную туберкулезную инфекцию от активного туберкулеза. Оба теста имеют низкую чувствительность в различных группах населения с ослабленным иммунитетом. Когортные исследования показали, что и TST, и IGRA имеют низкую прогностическую ценность в отношении перехода латентной инфекции в активный туберкулез [56], поэтому важно тестировать только людей с риском прогрессирования и использовать все клинические данные в дополнение к результатам тестов. Для оценки результатов существуют удобные калькуляторы, такие как Online TST/IGRA Interpreter. Кожный тест C-Tb (Statens Serum Institut; Копенгаген, Дания), основанный на более специфичных для туберкулеза антигенах ESAT-6 и CFP10, показал схожий с TST профиль безопасности и точность, аналогичную IGRA, в ходе третьей фазы клинических испытаний [57, 58].

Несколькими группами исследователей сообщалось о потенциальной возможности использовать белок HspX в качестве маркера заболевания и в том числе латентной формы [59, 60]. Однако последующий системный анализ различных штаммов M. tuberculosis продемонстрировал несостоятельность такого подхода [32]. Таким образом, поиск биомаркеров инфекционного процесса до сих пор остается наиболее актуальной задачей для исследователей во всем мире.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Туберкулез остается одной из главных проблем здравоохранения в нашей стране. Несмотря на наличие различных тест-систем, идентификация и особенно типирование патогена остаются актуальной задачей как в России, так и во всем мире. Имеющиеся технологии базируются преимущественно на использовании хорошо изученных геномных данных. За последние десятилетия в мире появилось множество других омиксных технологий, таких как метагеномика, транскриптомика, протеомика, метаболомика и культуромика, которые играют ключевую роль в понимании основных механизмов вирулентности, резистентности и патогенности бактерии. Мы рассмотрели различные омиксные технологии и возможность их использования в качестве диагностического инструмента. Согласно последним научным достижениям, омиксные технологии следует использовать согласованно, а не по отдельности, для получения значимых результатов в понимании патогенеза Mycobacterium tuberculosis. Помимо этого, для детального и целостного понимания необходимы новые технологии, такие как биоинформатика, нанотехнологии, одноклеточная геномика, а также новые технологии экспрессии генов, такие как наностринг, и инструменты визуализации. Рассматриваемые вместе наборы имеющихся и вновь получаемых омиксных данных должны создать интегрированное представление о глобальной регуляции генов M. tuberculosis и способствовать как развитию диагностических панелей, так и разработке новых эффективных методов лечения.