К настоящему времени убедительно показано, что воздействие ионизирующего излучения (ИИ) вызывает долгосрочное изменение Т-клеточного иммунитета. В ряде исследований отмечен повышенный уровень мутаций в генах Т-клеточного рецептора (TCR-мутаций) у облученных лиц, включая жителей прибрежных сел реки Течи. Углубленный анализ иммунного статуса у облученных людей позволил установить особую роль цитотоксических СD3⁺СD16⁺CD56⁺-лимфоцитов в элиминации TCR-мутантных клеток [1].

В контексте влияния ИИ на популяции Т-клеток существует ряд данных об изменениях показателей Т-хелперов в периферической крови. Так, спустя 20 лет после облучения у переживших атомную бомбардировку Хиросимы и Нагасаки было показано снижение количества наивных Т-хелперов с фенотипом CD4⁺CD45RA⁺ у лиц, облученных в дозе свыше 1 Гр [2]. Схожие данные были получены для лиц, пострадавших при аварии на ЧАЭС: сниженное содержание Т-хелперов в периферической крови наблюдали у лиц, получивших высокие дозы облучения [3]. Исследование работников производственного объединения «Маяк» показало линейное дозозависимое снижение количества Т-хелперов периферической крови [4]. При исследовании влияния низкодозового профессионального облучения на работников болгарской АЭС «Козлодуй» было сделано предположение о возможном смещении иммунного ответа от Th₁ в сторону Th₂ [5]. При этом количественных исследований влияния хронического радиационного воздействия на различные субпопуляции Т-хелперов, в том числе Т-хелперов 17-го типа, Т-хелперов 22-го типа, Т-хелперов 9-го типа и т. д.  в доступной литературе найдено не было.

Целью данной работы было исследовать количественные характеристики различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови лиц, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию, в отдаленные сроки после начала облучения.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование субпопуляций Т-хелперов проводили у 102 человек, условия и характер радиационного облучения которых были подробно описаны ранее [6]. Облучение жителей прибрежных сел реки Течи было обусловлено как внешним гамма-излучением, так и внутренним облучением (преимущественно за счет ⁹⁰Sr и ¹³⁷Cs) вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов ПО «Маяк» в реку Течу. Наибольшие дозы пришлись на красный костный мозг (ККМ) и были сформированы за счет ⁹⁰Sr в 1950–1960 гг. Люди, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию, были разделены на две группы: группу облученных лиц (n = 54) и группу сравнения (n = 48). Важно отметить, что в настоящее время среди жителей прибрежных сел реки Течи зарегистрирован повышенный уровень заболеваемости и смертности от злокачественных новообразований, включая лейкозы, для лиц с накопленной дозой облучения свыше 100 мГр на желудок и ККМ соответственно [6].

Критерии включения облученных лиц в исследование: постоянное проживание в одном из 41 сел, расположенных на побережье реки Течи, в период с 01.01.1950 по 31.12.1960; наличие рассчитанных индивидуальных накопленных доз облучения красного костного мозга (ККМ), тимуса и периферических лимфоидных органов на основе дозиметрической системы TRDST 2016 [7]; отсутствие аутоиммунных, онкологических, острых или хронических (период обострения) воспалительных заболеваний, гемобластозов, почечной или печеночной недостаточности, острого нарушения мозгового кровообращения в течение последних трех месяцев; отсутствие приема антибиотиков, глюкокортикоидов и цитостатиков в течение последних шести месяцев; отсутствие рентгенологического обследования в течение последних шести месяцев.

В группу сравнения были включены люди, проживающие в схожих социально-экономических условиях, с дозой облучения ККМ менее 70 мГр, накопленной за весь период своей жизни [8] (табл. 1).

Для исследования у пациентов натощак отбирали кров в вакуумную пробирку с наполнителем K3-EDTA (Greiner Bio-One; Австрия) в объеме 9 мл. Методом проточной цитометрии оценивали относительное количество субпопуляций Т-хелперов по уровню экспрессии CD45RA (маркер «наивных» Т-хелперов), CD62L (маркер направленной миграции клеток в периферические лимфоидные органы), а также CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5. В одну пробирку для проточного цитометра (Beckman Coulter; США) добавляли 100 мкл исследуемого образца, по 5 мкл моноклональных антител CD3 и CD4 (Beckman Coulter, США; конъюгированы с Krome Orange и Pacific Blue соответственно), по 20 мкл моноклональных антител CD45RA и CD62L (Beckman Coulter, США; конъюгированы с PE и FITC соответственно), по 5 мкл моноклональных антител CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 (Beckman Coulter, США; конъюгированы с APC, Per-CPeFluorTM710, PE-Cyanine7 и PE-eFluor®610 соответственно). Инкубацию образца проводили 20 мин в темном месте при комнатной температуре. Затем к образцу добавляли 1 мл лизирующего буфера VersaLyse (Beckman Coulter; США) для удаления эритроцитов, повторную инкубацию проводили 10 мин в тех же условиях. После инкубации образец анализировали на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter; США).

Для анализа субпопуляций Т-хелперов применяли следующую тактику гейтирования: Т-хелперы выявляли по наличию на поверхности клеток CD3^- и CD4-маркеров. Далее популяцию CD3⁺CD4⁺-клеток разделяли на субпопуляции Т-хелперов на разной стадии дифференцировки по наличию поверхностных маркеров CD45RA и CD62L, а именно наивных Т-хелперов с фенотипом CD3⁺CD4⁺CD45RA⁺CD62L⁺ (T_Naive), Т-хелперов центральной памяти с фенотипом CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L⁺ (Т_CМ), Т-хелперов эффекторной памяти с фенотипом CD3⁺CD4⁺CD45RA^-CD62L^- (Т_ЕМ) и терминально дифференцированных Т-хелперов с фенотипом CD3⁺CD4⁺CD45RA⁺CD62L^- (TEMRA). В популяциях Т_CМ и Т_ЕМ определяли субпопуляции различных Т-хелперов по наличию маркеров CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 [9–11] (табл. 2).

Статистическую обработку данных проводили в программе SigmaPlot (SYSTAT Software; США). Проверку нормальности распределения показателей — с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Массивы непараметрических данных сравнивали при помощи U-критерия Манна–Уитни. В первую очередь выше указанные параметры оценивали для Т-хелперов, находящихся на разных уровнях дифференцировки, затем статистическую обработку проводили для субпопуляций Т-хелперов центральной и эффекторной памяти.

Наличие зависимостей оценивали путем расчета коэффициентов ранговой корреляции по Спирмену и линейной корреляции по Пирсону, а также линейной регрессии. При оценке достоверности результатов был принят 5% уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

На сегодняшний день на основе экспрессии CD-маркеров выделяют Т-хелперы, находящиеся на разной стадии дифференцировки. В литературе хорошо описана способность T_Naive, не прошедших антигензависимую дифференцировку во вторичных лимфоидных органах, давать начало Т-клеткам памяти и эффекторным клеткам. Т_CМ несут на себе адгезионную молекулу CD62L, которая определяет их способность преимущественно локализоваться во вторичных лимфоидных органах. Т_ЕМ не способны проникать в периферические лимфоидные органы, однако несут на своей поверхности большой спектр различных адгезионных и хемокиновых молекул, способствующих их миграции в ткани и органы. Способность Т_ЕМ к пролиферации и дифференцировке снижена, а входящие в эту популяцию клетки являются основными продуцентами эффекторных цитокинов, таких как IFNγ и ИЛ-4. Эффекторные клетки TEMRA считают финальной стадией дифференцировки Т-лимфоцитов, обнаруживаемой в периферической крови. Эффекторные свойства TEMRA не нуждаются в костимуляции и проявляются под действием цитокинов, продуцируемых воспаленной тканью [12].

На первом этапе работы на основе экспрессии поверхностного маркера CD45RA и маркера направленной миграции клеток в периферические лимфоидные органы CD62L было исследовано относительное количество Т-хелперов, находящихся на разной стадии дифференцировки: T_Naive, Т_CМ, Т_ЕМ и TEMRA (табл. 3).

Не было выявлено статистически значимых различий количественных показателей лимфоцитов и Т-хелперов на разной стадии дифференцировки у облученных лиц, по сравнению с группой сравнения (табл. 3).

На основе экспрессии хемокиновых рецепторов CCR4, CCR6, CXCR3 и CXCR5 было оценено количество популяций Т-хелперов в субпопуляциях Т_CМ ^{и Т}_ЕМ. Преимущественно в составе популяций клеток Т_CМ и Т_ЕМ обнаруживаются такие субпопуляции, как Th1, Th2, Th17 и Th22, Th9, а также фолликулярные Т-хелперы. Все эти клетки обладают уникальными путями развития и регуляции и играют разные роли в иммунитете и иммунноопосредованных патологиях [13].

Результаты оценки представленности различных субпопуляций Т-хелперов в популяциях T_CM ^{и Т}_ЕМ, а также соотношение Th₁/Th₂ и Th₁/Th₁₇ у облученных лиц представлены в табл. 4 и табл. 5.

Статистически значимых различий субпопуляций Т-хелперов в популяции T_CM между группой облученных и группой сравнения обнаружено не было.

В популяции Т_ЕМ также не было выявлено статистически значимых различий между показателями субпопуляций Т-хелперов в группе облученных и группе сравнения.

Для определения зависимости количества различных субпопуляций Т-хелперов на разных стадиях дифференцировки в периферической крови облученных лиц в отдаленном периоде от дозы облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов был проведен корреляционный анализ по методу Спирмена и по методу Пирсона, анализ проводили в объединенной группе исследования.

В результате корреляционного анализа не было выявлено достоверных ассоциаций количества Т-хелперов на разной стадии дифференцировки в периферической крови облученных лиц с дозой облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов.

При исследовании зависимости содержания различных субпопуляций Т-хелперов в популяции T_CM от дозы облучения ККМ и тимуса и периферических лимфоидных органов было зарегистрировано статистически значимое повышение содержания субпопуляции «double positive» Тfh₁₇ от дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (p = 0,02; S = 0,23). Однако линейный регрессионный анализ не показал достоверных дозовых зависимостей. Для остальных исследуемых субпопуляций Т-хелперов не было выявлено статистически значимых зависимостей от дозовых характеристик.

Аналогичное исследование было проведено для анализа зависимостей содержания различных субпопуляций Т-хелперов в популяции T_EM от дозы облучения ККМ, тимуса и периферических лимфоидных органов. Не было обнаружено статистически значимых зависимостей исследуемых показателей популяции Т_ЕМ от дозовых характеристик облучения.

Известно, что с возрастом у человека происходят инволюционные изменения иммунной системы: снижается количество некоторых субпопуляций Т-хелперов [14], изменяется направление дифференцировки [15], и нарушается их функционирование [16]. Поэтому было проведено исследование зависимости содержания различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови исследуемых лиц от достигнутого возраста на время исследования (табл. 6).

В результате корреляционного анализа было выявлено достоверное снижение количества T_Naive, ассоциированное с возрастом в группе облученных лиц (по методу Спирмена p = 0,009, S = –0,35; по методу Пирсона — p = 0,01, R = –0,34). В группе сравнения аналогичной зависимости не отмечено. В группе облученных лиц было также обнаружено статистически значимое возрастное увеличение количества Т_ЕМ (по методу Спирмена p = 0,04, S = 0,28; по методу Пирсона — p = 0,02, R = 0,33), которое тоже отсутствовало в группе сравнения. Для данных зависимостей был проведен линейный регрессионный анализ (рис. 1; графики скользящей средней).  

Обнаружена достоверная возрастная зависимость содержания «double positive» Tfh₁₇ в составе субпопуляции Т_ЕМ в периферической крови как облученных лиц, так и лиц из группы сравнения. Однако ассоциации носили разнонаправленный характер: у облученных лиц отмечено достоверное снижение количества данной популяции клеток (p = 0,04; S = –0,28) с возрастом, а в группе сравнения наоборот — увеличение (по методу Спирмена p = 0,003; S = 0,32; по методу Пирсона p = 0,05; R = 0,29). Кроме того, в группе сравнения выявлено возрастное увеличение «double positive» Tfh₁₇ в субпопуляции T_CM (p = 0,009; R = 0,38), при этом в группе облученных лиц данной зависимости зарегистрировано не было.

Линейный регрессионный анализ зависимости количества «double positive» Tfh₁₇ в составе субпопуляций Т_CМ и T_ЕМ от возраста исследуемых лиц в группе облученных не выявил статистически значимых результатов, для группы сравнения результаты представлены в виде графика скользящей средней на рис. 2.

Анализ зависимости содержания различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови облученных лиц от достигнутого возраста на начало облучения показал следующие корреляции: количество T_Naive также снижалось с увеличением возраста (по методу Спирмена p = 0,03, S = –0,34; по методу Пирсона p = 0,04; R = –0,32), а количество Т_ЕМ увеличивалось (по методу Спирмена p = 0,03, S = 0,35; по методу Пирсона p = 0,04, R = 0,32) (рис. 3).

Для остальных популяций Т-хелперов не было выявлено статистически значимых зависимостей от достигнутого возраста на время исследования и на время начала облучения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Т-хелперы играют важнейшую роль в регуляции иммунной системы: от активации В-лимфоцитов, цитотоксических Т-лимфоцитов и других популяций клеток до подавления иммунного ответа.

Однако помимо поддержания функций адаптивного иммунитета Т-хелперы могут принимать участие и в развитии таких патологических состояний, как аутоиммунные [17, 18] и онкологические заболевания [19, 20]. Так, сообщается, что развитие хронического лимфолейкоза связано с распространением аномальных фолликулярных Т-хелперов, продуцирующих повышенные уровни цитокинов и костимулирующих факторов, способствующих пролиферации опухолевых клеток [21]. Показана также проопухолевая активность Th₁₇, выражающаяся в продукции иммуносупрессивных цитокинов и хемокинов в микроокружении опухоли, что приводит к стимуляции роста опухоли и метастазов [22, 23].

Важную роль в иммунном ответе играет баланс различных субпопуляций Т-хелперов. Например, цитокины, продуцируемые клетками Th2, блокируют продукцию цитокинов Th1 и естественными киллерами. Кроме того, клетки Th1 могут ингибировать дифференцировку и пролиферацию базофилов и эозинофилов, активность которых находится под контролем синтеза цитокинов Th2 [24]. Влияние ионизирующего излучения вызывает иммунный дисбаланс Th1/Th2 в направлении доминирования Th2, и этот дисбаланс может способствовать дисфункции иммунной системы после облучения [25]. В ряде работ представлены данные о смещении баланса Th1/Th2 в сторону Th2 при гематологических злокачественных новообразованиях [26–28]. В последнее время начали появляться данные и о другом соотношении иммунокомпетентных клеток, а именно Th1/Th17, дисбаланс которого участвует в развитии аутоиммунных заболеваний, в первую очередь ревматоидного артрита [29, 30].

В проведенном нами исследовании не было выявлено статистически значимых различий относительного содержания различных субпопуляций Т-хелперов, а также соотношения Th1/Th2 и Th1/Th17 в периферической

крови между группой облученных лиц и группой сравнения в отдаленные сроки после начала облучения. Однако у облученных людей были отмечены некоторые различия зависимости отдельных популяций Т-хелперов периферической крови в исследуемых группах от дозы облучения тимуса, периферических лимфоидных органов и достигнутого возраста.

У облученных лиц было обнаружено дозозависимое повышение количества «double positive» Tfh17, входящих в состав популяции Т_CМ, в периферической крови в зависимости от дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов. Дозозависимые изменения количества Т-хелперов, а также их функциональных характеристик наблюдались и в исследованиях других популяций облученных лиц. У переживших атомную бомбардировку Хиросимы и Нагасаки было зарегистрировано дозозависимое снижение количества CD4⁺-Т-клеток в периферической крови [3], повышение мутации Т-клеточного рецептора в основном в популяции CD4⁺-Т-клеток [31], а также дозозависимое укорочение длины теломер Т-хелперов при дозах свыше 0,5 Гр [32]. У работников ПО «Маяк», подвергшихся хроническому радиационному воздействию, также выявлены изменения в Т-звене иммунной системы: с увеличением дозы внешнего облучения (2–4 Гр) снижалось количество CD4⁺-клеток [33], изменялись концентрации ряда цитокинов и хемокинов. Полученные результаты позволил сделать вывод, что выявленные изменения иммунных показателей у обследованных лиц способствовали поддержанию хронического воспалительного статуса и могли способствовать развитию поздних радиационнообусловленных патологий, таких как сердечно-сосудистые и злокачественные заболевания [5, 34].

Помимо дозовых зависимостей, в обследованных группах обнаружены и возрастные изменения. Нами было выявлено возрастное снижение количества T_Naive в периферической крови облученных лиц, а также увеличение с возрастом количества T_ЕМ, способных к миграции через эндотелий сосудов и тканей в очаги воспаления и развитию быстрого иммунного ответа с синтезом преимущественно эффекторных цитокинов [12]. Полученные результаты согласуются с литературными данными, описывающими феномен снижения количества наивных Т-хелперов с возрастом у лиц старше 70–75 лет [14]. Кроме того, в пожилом возрасте наивные Т-клетки приобретают склонность к эффекторной дифференцировке [35]. Стоит заметить, что в группе сравнения подобных корреляций выявлено не было; для этой группы обследованных лиц отмечено увеличение с возрастом количества «double positive» Tfh17 в субпопуляциях Т_CМ и Т_EM. При этом содержание «double positive» Tfh17 в субпопуляции Т_ЕМ у облученных лиц наоборот очень слабо снижалось с возрастом. Фолликулярные Т-хелперы экспрессируют хемокиновый рецептор CXCR5, что позволяет им мигрировать к его лиганду CXCL13 B-клеточного фолликула. Нормальные фолликулярные Т-хелперы продуцируют уникальный спектр цитокинов и хемокинов, необходимых для поддержания выживания и пролиферации B-клеток в зародышевых центрах [9, 21, 36, 37]. Так, Tfh17 продуцируют ИЛ-21 и ИЛ-17, участвующие в усилении взаимодействия Т- и В-клеток и необходимые для образования зародышевых центров [38].

Таким образом, у облученных лиц в отдаленном периоде после хронического радиационного воздействия наблюдаются некоторые изменения в Т-хелперном звене, которые зависят как от дозы облучения, так и от достигнутого возраста на момент исследования, однако в связи с небольшим количеством лиц, вошедших в обследованные группы, однозначные выводы на данном этапе работы невозможно сделать, и требуется дальнейшее продолжение исследований.

ВЫВОДЫ

1. В отдаленные сроки после хронического радиационного воздействия с преимущественным облучением ККМ (средняя накопленная доза облучения ККМ 567 ± 73 мГр) у жителей прибрежных сел реки Течи в возрастном диапазоне 67–84 года не установлено изменения относительного содержания различных субпопуляций Т-хелперов в периферической крови. 2. Относительное количество «double positive» Tfh17, содержащихся в популяции TCM в периферической крови облученных лиц, положительно коррелировало с дозой облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (p = 0,02), однако линейной регрессионной зависимости зарегистрировано не было. 3. Полученные данные косвенно свидетельствуют об интенсификации инволюционных процессов у облученных лиц за счет снижения с возрастом количества T_Naive и увеличения Т_ЕМ. У облученных лиц в отдаленном периоде регистрируются следующие возрастные зависимости: снижение относительного количества TNaive (p = 0,009) и «double positive» Tfh17 в составе субпопуляции Т_ЕМ (p = 0,04), а также увеличение относительного содержания Т_ЕМ (p = 0,04) в периферической крови. Однако в группе сравнения аналогичных зависимостей не отмечено.