Принято считать, что происходящие под влиянием ионизирующего излучения генетические и эпигенетические нарушения могут способствовать развитию злокачественных новообразований (ЗНО). Несомненно, важную роль в онкотрансформации клеток играет функциональное состояние защитных систем организма — репарации ДНК, остановки клеточного цикла, антиоксидантной системы и противоопухолевого иммунитета. В случае эффективной работы протективных механизмов облучение может не вызвать патологических изменений, однако при неэффективности той или иной системы защиты возникает риск развития онкопатологии.

Системный иммунитет играет важную роль в противоопухолевой защите организма [1]. В частности, нейтрофилы, моноциты и НК-клетки способны не только распознавать, лизировать и элиминировать из организма опухолевые и мутантные клетки, но и оказывать регуляторное воздействие на другие иммунокомпетентные клетки (макрофаги, Т- и В-лимфоциты, эозинофилы, базофилы) за счет выработки хемокинов, про- и противовоспалительных цитокинов, простагландинов, лейкотриенов [2, 3]. Кроме того, активированные макрофаги могут проявлять свою противоопухолевую активность благодаря лизирующим ферментам и свободным радикалам, повреждающим опухолевые клетки, а также продуцировать противоопухолевый цитокин ФНОα [4].

У жителей прибрежных сел р. Течи (Южный Урал), подвергшихся длительному низкоинтенсивному радиационному воздействию вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов производственным объединением «Маяк» в р. Течу, в отдаленном периоде регистрировали изменения в иммунной системе, выражавшиеся в снижении количества лейкоцитов (главным образом за счет нейтрофилов и лимфоцитов) в крови, повышении лизосомальной активности нейтрофилов, некоторой супрессии внутриклеточного кислородозависимого метаболизма моноцитов и смещении баланса системы цитокинов в сторону провоспалительного ответа [5, 6]. Кроме того, у облученных лиц с облигатными формами предраковых заболеваний наблюдалось повышение абсолютного и относительного количества натуральных киллеров (СD16⁺/CD56⁺-клетки) в крови относительно группы облученных пациентов без предраковой патологии [7]. По результатам эпидемиологических исследований в когорте облученных на р. Тече лиц выявлены повышенные риски заболеваемости и смертности от злокачественных опухолей и лейкозов [8, 9].

Целью исследования было провести количественную и функциональную оценку системы нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и натуральных киллеров у лиц, которые подверглись хроническому радиационному воздействию и у которых впоследствии были диагностированы онкозаболевания.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено исследование систем нейтрофильных гранулоцитов, моноцитов и натуральных киллеров у 104 человек, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов в р. Течу производственным объединением «Маяк» в 50–60-х гг. ХХ века. Характер облучения подробно описан в книге [10].

Критериями включения в группы обследуемых были: постоянное проживание в одном из 41 села, расположенного на побережье р. Течи, в период с 1 января 1950 г. по 31 декабря 1960 г.; наличие рассчитанных на основе дозиметрической системы Techa River Dosimetry System-2016 (TRDS-2016) [11] индивидуальных кумулятивных доз облучения красного костного мозга (ККМ), тимуса и периферических лимфоидных органов. Критерии исключения: отсутствие информации об истории проживания на радиоактивно загрязненных территориях; диагностированные на момент обследования аутоиммунные, острые или хронические (период обострения) воспалительные заболевания, гемобластозы, почечная или печеночная недостаточность, острое нарушение мозгового кровообращения в течение последних 3-х месяцев, онкозаболевания (для группы сравнения); прием препаратов, влияющих на изучаемые показатели (антибиотики, глюкокортикоиды, цитостатики).

Все обследованные лица были разделены на две группы: основная группа — 34 облученных лица, у которых впоследствии были диагностированы опухолевые заболевания (иммунологическое исследование проводили однократно за 1–7 лет до манифестации заболевания в период с 2007 по 2014 г.), группа сравнения — облученные лица без онкологических заболеваний (70 человек). В основной группе облученных лиц в период с 2009 по 2017 г. были диагностированы рак тонкого и толстого кишечника (пять случаев), желудка (два случая), мочевого пузыря (три случая), кожи (семь случаев), соединительной ткани глазницы и позадиглазного пространства (один случай), губы (один случай), молочной железы (два случая), женских половых органов, в том числе рак шейки матки (три случая), мужских половых органов (три случая), бронхов и легкого (четыре случая), а также остеосаркома черепа (один случай) и ЗНО неуточненных локализаций (два случая).

Исследуемые группы были сопоставимы по половому и этническому составу, а также возрасту на момент обследования и дозам облучения. Характеристика исследуемых групп представлена в табл. 1.        

Для исследования у лиц изучаемых групп забирали венозную кровь из локтевой вены в шприц с гепарином в объеме 10 мл. Количество лейкоцитов, нейтрофильных гранулоцитов, базофилов и моноцитов в периферической крови определяли с использованием автоматического гематологического анализатора Pentra 120 DX (HORIBA ABX S.A.S.; Франция). Для подсчета НК-клеток (CD16⁺/CD56⁺ лимфоциты) использовали моноклональные антитела к соответствующим CD-рецепторам, меченные флуорохромами (конъюгированное антитело CD3^–FITC/CD16⁺CD56-PE, Beckman Coulter; США). Анализ численности клеток проводили на проточном цитометре Navios (Beckman Coulter; США).

Фагоцитарную, лизосомную активность и интенсивность внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов и моноцитов определяли стандартными методами [12, 13]. Оценивали следующие показатели: активность фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов (АФН, АФМ), интенсивность фагоцитоза нейтрофилов и моноцитов (ИФН, ИФМ), фагоцитарное число нейтрофилов и моноцитов (ФЧН, ФЧМ), интенсивность внутриклеточного кислородозависимого метаболизма нейтрофилов и моноцитов в спонтанном и индуцированном вариантах (НСТН, НСТМ), лизосомную и суммарную лизосомную активность нейтрофилов и моноцитов (ЛАН, ЛАМ, СЛАН, СЛАМ). Подробное описание методик исследования приведено в ранее опубликованных статьях [7]. Во всех случаях для учета реакций применяли метод световой микроскопии с использованием микроскопа Axio Imager A2 (Carl Zeiss; Германия).

Статистическую обработку первичных данных проводили в программе SigmaPlot, версия 12.5 (SYSTAT Software; США) с использованием U-критерия Манна-Уитни для сравнения двух массивов данных. Выполняли корреляционный анализ по методам Спирмена и Пирсона, а также линейный регрессионный анализ. Статистически значимыми считали результаты, уровень значимости которых был ниже 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено сравнение количества форменных элементов в периферической крови, а также показателей функциональной активности нейтрофилов и моноцитов в исследуемых группах. Результаты представлены в виде медианы (Mе) и 25–75-х процентилей (Q₁–Q₂) (табл. 2, табл. 3).

В результате исследования не выявлено значимых различий по показателям клеточного иммунитета у облученных лиц, впоследствии заболевших онкологическими заболеваниями, по сравнению с облученными лицами без онкопатологии.      

При анализе функциональных характеристик систем нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов обнаружено значимое увеличение интенсивности фагоцитоза моноцитов и лизосомальной активности нейтрофилов у лиц, впоследствии заболевших онкологическими заболеваниями, по сравнению с группой лиц без ЗНО.

При анализе дозовых зависимостей у облученных лиц, впоследствии заболевших онкологическими заболеваниями, обнаружено значимое увеличение процентного содержания эозинофилов в крови в зависимости от дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (по методу Спирмена — ρ = 0,38, p = 0,03). Однако анализ линейной регрессии не показал достоверных результатов (рис. 1А). Также отмечено дозозависимое увеличение интенсивности фагоцитоза моноцитов с увеличением накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (по методу Спирмена — ρ = 0,45, p = 0,009, по методу Пирсона — r = 0,36, p = 0,04) и активности фагоцитоза нейтрофилов с увеличением накопленной дозы облучения ККМ (по методу Спирмена — ρ = 0,44, p = 0,01, по методу Пирсона — r = 0,38, p = 0,03). Результаты линейного регрессионного анализа для этих показателей представлены на рис. 1Б, В.

В группе сравнения имели место иные зависимости: показано значимое снижение относительного количества базофилов в крови с увеличением накопленной дозы облучения ККМ (по методу Спирмена — ρ = –0,26, p = 0,03, по методу Пирсона — r = –0,27, p = 0,03), и накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (по методу Спирмена — ρ = –0,42, p = 0,0005, по методу Пирсона — r = –0,32, p = 0,009). Результаты линейного регрессионного анализа для этих показателей представлены на рис. 2.      

Также обнаружено значимое увеличение активности фагоцитоза моноцитов с увеличением накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов (по методу Спирмена — ρ = 0,27, p = 0,03). Однако анализ линейной регрессии не показал достоверных результатов (рис. 3).     

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование показало, что спустя более 60-ти лет после начала хронического радиационного воздействия за несколько лет до диагностирования онкологического заболевания у облученных лиц наблюдается значимое повышение интенсивности фагоцитоза моноцитов и лизосомальной активности нейтрофилов по сравнению с пациентами, не заболевшими ЗНО. Кроме того, установлено дозозависимое увеличение интенсивности фагоцитоза моноцитов с увеличением накопленной дозы облучения тимуса и периферических лимфоидных органов и активности фагоцитоза нейтрофилов с увеличением накопленной дозы облучения ККМ.

Ряд исследований свидетельствует о важной роли нейтрофилов в противоопухолевом иммунитете. Так, в экспериментах на мышах линии SR/CR показано, что нейтрофильные гранулоциты первыми из иммунных клеток мигрируют в опухолевую ткань и принимают участие в реализации феномена спонтанной регрессии опухолей разных гистологических типов [14]. Механизм цитолитического действия нейтрофилов на опухолевые клетки связан с выработкой этими клетками активных форм кислорода и азота, причем главенствующую роль в процессе гибели опухолевых клеток играет некроз [14].

Вместе с тем, нейтрофилы и моноциты могут способствовать инвазивному росту опухоли, ее васкуляризации и метастазированию [15, 16], а селектинопосредованная адгезия атипичных клеток к мембране нейтрофильных гранулоцитов может приводить к их гематогенной диссеминации [17]. Кроме того, изобилие в строме опухоли инфильтрирующих клеток врожденного иммунитета, таких как макрофаги, тучные клетки и нейтрофилы, соотносится не только с повышением уровня ее ангиогенеза, но и неблагоприятным прогнозом [18].

Стоит заметить, что в ранее проведенных ретроспективных динамических исследованиях клеточного состава периферической крови у лиц, облученных на р. Тече, впоследствии заболевших хроническим миелоидным лейкозом и острым лейкозом, было установлено, что количество нейтрофилов и их состав являются предикторами, позволяющими прогнозировать повышенную вероятность развития радиационно-индуцированных лейкозов в ранние сроки после начала облучения [19]. Вероятно, наблюдаемые нами за несколько лет до манифестации клинически диагностируемых раков изменения в функциональной активности нейтрофилов и моноцитов у хронически облученных людей могут быть ответом на увеличение количества онкотрансфрмированных клеток. Однако стоит отметить, что на интенсивность фагоцитоза моноцитов и лизосомальной активности нейтрофилов также могут влиять факторы нерадиационной природы, в том числе вредные привычки и образ жизни.

В связи с этим на данном этапе работы невозможно сделать окончательные выводы о рассмотрении выявленных показателей в качестве кандидатных биологических маркеров развития ЗНО в отдаленные сроки после начала облучения. Для формирования заключения об отнесении данных показателей к предикторам развития ЗНО необходимы дополнительные исследования, направленные на изучение чувствительности и специфичности.

ВЫВОДЫ

В результате исследования у лиц, облученных в широком диапазоне доз, в отдаленном периоде после хронического радиационного воздействия за несколько лет до развития ЗНО (ЗНО диагностированы с 2009 по 2017 г.) выявлено значимое повышение интенсивности фагоцитоза моноцитов и лизосомальной активности нейтрофилов по сравнению с облученными в сопоставимых дозах людьми без ЗНО. В отдаленном периоде выявлены дозозависимые изменения интенсивности фагоцитоза моноцитов и активности фагоцитоза нейтрофилов у хронически облученных лиц.