Иммунохимический анализ, в котором процессы жидкостной иммунохроматографии основаны на специфических (иммунных) взаимодействиях между аналитом и нанесенными на пористую тонкую мембрану специфичными рецепторными молекулами, получил название иммунохроматографического анализа (ИХА, или LFIA, от англ. lateral flow immunoassay). История развития метода началась в 1980-е годы с создания тест-полосок для выявления хорионического гонадотропина в моче, что позволяло выявлять беременность вне лаборатории [1]. Схема тест-полоски для проведения ИХА в «сэндвич»варианте анализа показана на рис. 1.

Как правило, в иммунохроматографическом тесте используют мультимембранный композит, состоящий из нескольких мембран разной химической структуры и пористости, закрепленных на подложке, обеспечивающей жесткость конструкции, и помещенный в полимерную оправу.

Принцип действия ИХА в «сэндвич»-варианте многократно описан в литературе [2–4]. Жидкую пробу, потенциально содержащую антигены аналитов, помещают на подложку для нанесения образца. Под действием капиллярных сил происходит перемещение жидкости по мультимембранному композиту. Сначала солюбилизируется конъюгат НКЗ со специфичными антителами. Конъюгат НКЗ окрашен в вишневый цвет, его движение по мембране можно наблюдать визуально. При наличии определяемого антигена в пробе образуется антигенный иммунный комплекс, который с током жидкости начинает перемещаться по аналитической мембране вместе с избытком конъюгата. Далее иммунный комплекс иммобилизируется на аналитической мембране специфичными антителами в аналитической зоне (АЗ), образуя «сэндвич», а несвязанные антитела конъюгата — антителами, расположенными в контрольной зоне тестполоски (КЗ), что приводит к образованию двух окрашенных линий. В случае отсутствия антигена в пробе антигенный иммунный комплекс не образуется, поэтому единственная видимая линия формируется за счет связывания антител конъюгата и антител КЗ (антивидовых по отношению к антителам конъюгата) только в КЗ.

В зависимости от решаемых задач в тест-полоску могут быть добавлены дополнительные реагенты, а некоторые мембраны можно добавлять, комбинировать или исключать. Однако общая конструкция и принцип проведения аналитических взаимодействий во время движения реагентов вдоль мембран сохраняются. Упростить анализ по отношению к твердофазному иммуноферментному анализу (ТИФА) можно отказом от дополнительных обработок, промывок, инкубации, усиливающей сигнал, а также визуальной оценкой результатов. Типичное время ИХА составляет 10–25 мин, чувствительность при анализе бактериальных суспензий — 10⁵–10⁶ кл./мл, вирусных суспензий — 10⁴–10⁶ БОЕ/мл; по белковым токсинам чувствительность метода лежит в диапазоне 1–100 нг/мл, в зависимости от вида токсина. Поскольку иммунохимические взаимодействия на мембране идут в неравновесном режиме, считается, что ИХА уступает ТИФА по чувствительности. В то же время существуют приемы и методы, позволяющие поднять чувствительность ИХА по белковым антигенам до 0,1 нг/мл, а по клеткам до 10³ кл./мл, однако это требует либо дополнительных реагентов, либо приборной регистрации и существенно увеличивает время анализа.

Пристальное внимание к методу ИХА возникло на фоне внешних глобальных событий, затрагивающих интересы ведущих экономических держав мира и мирового здравоохранения. Можно выделить четыре волны интереса к средствам ИХА, связанные с массовым применением патогенных для человека бактерий, токсинов и возникновением новых вирусных инфекционных заболеваний.

1. Операция армии США «Буря в пустыне» в январе–феврале 1991 г. Были созданы иммунофильтрационные индивидуальные устройства для выявления спор сибирской язвы, которые входили в экипировку военнослужащих. Предполагалось, что в случае применения иракской армией спор сибирской язвы быстрая их индикация уменьшит потери личного состава.
2. Акты индивидуального биотерроризма — рассылки почтовых конвертов в правительственные учреждения США со спорами сибирской язвы в августе–октябре 2001 г. Несколькими фирмами в США были созданы тестполоски на принципе «сэндвич» ИХА для выявления спор сибирской язвы и других возбудителей опасных инфекций (чумы, туляремии, бруцеллеза).
3. Иракская война США 2003–2011 гг. Произошло расширение номенклатуры тестов для выявления патогенов в объектах окружающей среды.
4. Пандемия COVID-19 с конца 2020 г. — по настоящее время. Появились быстрые ИХА-тесты для выявления нуклеокапсидного антигена коронавируса SARS-CoV-2 и антител к нему у переболевших людей в смывах с носоглотки и в сыворотке крови. Масштаб производства иммунохроматографических тест-полосок в мире достиг сотен миллионов.

Биобезопасность чрезвычайно важна в современном обществе. Информацию о наличии патогенных микроорганизмов и токсинов в объектах внешней среды желательно получать незамедлительно и непосредственно в месте отбора проб. Помимо биологических угроз, связанных с индивидуальным биотерроризмом, опасение вызывает наличие биологических лабораторий, работающих с возбудителями особо опасных инфекций, финансируемых недружественными государствами, в странах СНГ. Деятельность этих биолабораторий непрозрачна и не контролируется местной администрацией.

Применение ИХА в санитарии и гигиене обусловлено не только вопросами биобезопасности, но и потребностью в оперативном получении информации о товарах массового потребления, например о качестве сельскохозяйственного сырья, поступающего на предприятие и готовой пищевой продукции, направляемой в торговую сеть [5]. В последнее десятилетие активизировалась разработка модификаций ИХА, позволяющих проводить высокочувствительный анализ, сохраняя при этом основные достоинства — скорость исполнения, простоту внедрения и интерпретацию результатов [6–8].

Сказанное выше делает актуальным разработку и серийный выпуск отечественных технических средств экспресс-индикации патогенных микроорганизмов и токсинов, пригодных как для медицинских нужд, так и для контроля объектов окружающей среды.

Федеральное государственное унитарное предприятие «Государственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» (ФГУП «ГосНИИБП») ФМБА России является единственным в нашей стране предприятием, ведущим разработки и серийный выпуск технических средств индикации патогенов в объектах окружающей среды, основанных на принципе ИХА.

Цель обзора — представить характеристики отечественных средств на основе ИХА для индикации патогенных микроорганизмов и токсинов в объектах окружающей среды (смывы с поверхностей, жидкости, содержимое пробоотборников биологического аэрозоля), разработанные ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России, и провести сравнение с зарубежными аналогами.

Укладка иммунохроматографических индикаторных элементов УИХЭ-1

Укладка УИХЭ-1 была разработана для индикации возбудителей чумы, сибирской язвы, туляремии, сапа и ботулинического токсина типа А в смывах с поверхностей объектов окружающей среды. Укладка представляет собой иммунохроматографические индикаторные элементы и средства отбора пробы с поверхности, кисти, емкость с буфером анализа, стерильный тампон и схему анализа, уложенные в пылевлагозащищенный полимерный кейс. Расходные элементы укладки позволяют осуществить 10 анализов по пяти разновидностям патогенов. Имеется комплект пополнения, позволяющий быстро заменить израсходованные индикаторные элементы и буфер для проведения анализа и другие одноразовые аксессуары. В нормативных документах ФМБА России укладка рекомендована для использования в практической деятельности центров гигиены и санитарии ФМБА России. Основные технические характеристики укладки представлены в табл. 1.

Характеристики иммунохроматографических индикаторных элементов укладки по чувствительности и быстродействию, в сравнении с другими иммунохимическими экспресс-методами индикации патогенов, приведены в табл. 2. Данные были получены в ходе учений по выявлению микробных клеток вакцинных штаммов возбудителей сибирской язвы, чумы, туляремии [9].

Как видно из сравнительных испытаний, метод ИХА и индикаторные иммунохроматографические элементы укладки УИХЭ-1 обладают чувствительностью, сравнимой с РНГА и ТИФА, а по быстродействию опережают их. Номенклатура иммунохроматографических индикаторных элементов, которыми можно опционально комплектовать укладку, в настоящее время расширена до 15 наименований [10, 11]. Дальнейшим развитием этого технического средства индикации было создание варианта укладки УИХЭ-1 с комплектацией мультианалитными иммунохроматографическими индикаторными устройствами (МИУ), рассчитанными на выявление бактерий и токсинов [12]. Конструктивно в МИУ тест-полоски расположены в полимерных разъемных оправах по 5 штук, при этом отобранную жидкую пробу необходимо вносить в отверстие для нанесения образца и равномерно распределять по всем тест-полоскам. Верхняя крышка полимерной оправы МИУ имеет прямоугольные прорези для визуальной регистрации результатов анализа и соответствующую маркировку. Применение МИУ позволило сделать укладку компактной, а также увеличить номенклатуру выявляемых бактерий (пять наименований) и токсинов (пять наименований) в едином цикле анализа. Возбудители сапа и мелиоидоза не имеют видового различения при проведении ИХА, ввиду близкой антигенной структуры рода Burkholderia. Оба варианта исполнения укладки УИХЭ-1 обладают высокой устойчивостью к воздействию механических и климатических факторов и используются для комплектования мобильных биолабораторий. Полимерные кейсы укладки стойки к воздействию дезинфицирующих средств. Небольшие размеры и масса 5,5 кг и 2,0 кг позволяют использовать их также как переносное средство специфической индикации.

Комплект «Экспресс-комплект-Био»

Комплект «Экспресс-комплект-Био» (ЭкБ) предназначен для:

• отбора и подготовки проб содержимого пробоотборников биологических аэрозолей, культуральных сред после стадии биологического обогащения, смывов с поверхностей объектов окружающей среды;
• индикации методом ИХА вирусов (ортопоксвирусов, возбудителей геморрагических лихорадок Ласса и Мачупо, денге, лихорадки Западного Нила, среды накопления вирусов и риккетсий (антигенов растущих куриных эмбрионов), вегетативных и споровых форм бактерий (возбудителей чумы, сапа и мелиоидоза, бруцеллеза, спор сибирской язвы, туляремии), бактериальных и растительных токсинов (ботулинического токсина типа А (БТА), ботулинического токсина типа В (БТВ), стафилококкового энтеротоксина типа В (СЭВ), холерного экзотоксина, рицина;
• регистрации и фиксации результатов ИХА, передачи результатов органам управления.

Комплект рассчитан для отбора, подготовки и анализа 50 проб и эксплуатируется при температуре от +10 до +40 °С [13]. Он состоит из набора принадлежностей для подготовки отобранных проб к анализу, в который входит устройство для элюирования пробы с твердых сорбирующих сред пробоотборников аэрозоля; набора мультианалитных иммунохроматографических тестов (МИТ). Индикационные возможности комплекта обеспечены тремя видами МИТ: МИТ «Бактерии», МИТ «Вирусы и среда накопления», МИТ «Токсины» (рис. 2).

Индикация возбудителей сапа и мелиоидоза проходит без различения вида бактерий. В случае ортопоксвирусов, вирусов возбудителей лихорадок Ласса и Мачупо индикация методом ИХА также проходит без различения вида. Это обусловлено отсутствием антител, способных дифференцировать антигены указанных возбудителей на уровне вида. Комплект снабжен рефлектометрическим устройством (рис. 3), программное обеспечение которого позволяет автоматически распознавать положительные результаты анализа, задавать пороги интенсивности окрашивания зон МИТ, архивировать данные анализа и передавать их по электронной почте в вышестоящие органы для принятия решения.

Компьютер, используемый в рефлектометрическом устройстве, имеет повышенную стойкость к механическим воздействиям и воздействию влаги. Комплект ЭкБ полностью автономен, имеет собственный источник питания рефлектометра, может быть развернут как в лаборатории, так и в полевых условиях. Конструктивно комплект размещен в четырех ударопрочных водонепроницаемых полимерных кейсах и содержит все необходимые аксессуары для анализа содержимого пробоотборника аэрозоля при отборе в жидкость, на фильтры или плотные сорбирующие среды. Комплект снабжен также транспортной тарой, что позволяет перевозить его любыми видами воздушного и наземного транспорта.

Носимый вариант комплекта «Экспресс-комплект-Био»

Носимый вариант комплекта «Экспресс-комплектБио» (ЭкБ-01) (рис. 4) позволяет использовать его как средство индивидуального контроля биологической обстановки. Комплект ЭкБ-01 рассчитан на анализ пяти проб по 17 видам патогенов. Прибор предназначен для ИХА подготовленных проб содержимого пробоотборников аэрозоля, иммунохимической верификации колоний микроорганизмов после обогащения пробы на культуральных средах, осуществления смывов с поверхностей объектов окружающей среды и их анализа.

В носимом варианте комплекта применены те же МИТ, что и для ЭкБ, корпус комплекта пылевлагозащищенный, выполнен из углеродного композиционного материала, общая масса комплекта — 0,405 кг.

Разработки средств индикации на основе люминесцентных меток в иммунохроматографии

Люминесцирующие маркерные молекулы также успешно используют в ИХА, наряду с НКЗ. Так,  фирмой Responce Biomedical Corp. (Канада) создан анализатор RAMP, для иммунохроматографического выявления патогенных бактерий, ортопоксвирусов и токсинов. Технические характеристики представлены в табл. 1.

В ФГУП «ГосНИИБП» ФМБА России разработан и испытан опытный образец укладки люминесцентной иммунохроматографической УЛИ1, содержащей в своем составе люминесцентные иммунохроматографические индикаторные элементы на основе функционализированных карбоксильными группами латексных субмикронных частиц. Получение конъюгатов антител с латексными частицами происходило за счет ковалентного связывания. Укладка УЛИ-1 содержит также светодиодное визуализирующее устройство, работающее на батарее, позволяющее оператору наблюдать люминесценцию аналитической и тестовой зоны иммунохроматографического индикаторного элемента и проводить визуальную регистрацию результатов анализа [14]. Преимущество относительно чувствительности обнаружения при использовании люминесцентных меток, по сравнению с иммунохроматографическими тестами на основе НКЗ, для споровой формы возбудителя сибирской язвы было в 2 раза, для вегетативных форм возбудителей чумы — в 2 раза, антигена Ф1 чумного микроба — в 5 раз, различных типов ботулинического токсина  —  2–4 раза.

Для целей регистрации результатов ИХА был также разработан  экспериментальный образец рефлектометрафлуориметра «Зондаж», позволяющий регистрировать интенсивность отражения света от аналитической или контрольной зоны иммунохроматографического теста в четырех спектральных диапазонах видимого света: белом (400–800 нм), красном (650 нм), зеленом (525 нм), синем (470 нм). Спектральный диапазон прибора позволяет регистрировать рефлектограммы не только конъюгатов НКЗ, но и различных по окраске цветных латексных частиц, часто используемых в качестве дисперсной фазы в ИХА. В режиме измерения интенсивности люминесценции прибор «Зондаж» позволяет регистрировать люминесцентные иммунохроматограммы. Он обеспечивает длину волны возбуждения люминесценции, равную 380 нм, эмиссии — 490 нм. Принцип действия прибора основан на рефлектометрии цифровых снимков иммунохроматограмм, либо регистрации интенсивности свечения люминесценции в случае люминесцентных тестов. В качестве источников света использованы излучающие светодиоды. Приемником изображения служит твердотельная видеокамера. Прибор питается от электрической сети (220В/50 Гц), имеет массу 1,30 кг. Программное обеспечение позволяет не только задавать параметры регистрации, но и определять интегральную интенсивность пиков иммунохроматограмм и проводить количественное сравнение различных образцов. Протоколы регистрации ИХА хранятся в памяти прибора и могут быть переданы по электронной почте.

Направления совершенствования ИХА для индикации патогенов

Пути совершенствования ИХА — это повышение чувствительности, специфичности, быстродействия метода. Анализ литературы позволяет сделать вывод, что для этой цели перспективны процедура концентрирования пробы на преаналитическом этапе, выбор рецепторных молекул высокой афинности, использование коллоидных меток с низким порогом обнаружения, приборные средства и методы регистрации этих меток. На преаналитическом этапе эффективно применение магнитосорбентов для концентрирования бактерий и вирусов [15, 16]. Для выбора наиболее эффективных рецепторных молекул следует учитывать, что иммунные реакции в ИХА осуществляются в кинетическом режиме. Поэтому неважно, будут ли обнаруживаемые комплексы диссоциировать в течение часов или дней. Их количество определяется, прежде всего, кинетическими константами ассоциации, которые для одинаковых по строению рецепторов и антигенов схожи по величине и изменяются в ограниченном диапазоне. Дополнительно увеличить аффинность можно генетической модификацией (направленным дизайном) активного центра антител. Использование этих методов еще очень ограничено, несмотря на подтверждение их эффективности [17].

С развитием молекулярно-биологических методов становится доступным получение модифицированных традиционных рецепторов (антител) и новых рецепторов — аптамеров [18–20], однодоменных антител [21]. Осуществление направленной иммобилизации антител на дисперсной фазе через рецепторные стафилококковые белки А и стрептококковый белок G, взаимодействия авидин–биотин [22–25], происходит без утраты афинности антител, как это зачастую протекает при физической сорбции на дисперсной фазе, что свидетельствует о полезности такого подхода.

На этапе поиска оптимальных маркеров следует обратить внимание на применение новых оптических маркеров на основе высоко разветвленного коллоидного золота [26, 27] коллоидного углерода [28–30], оксида графена и карбоксилированного оксида графена [31]. Ограничение по регистрации только поверхностных молекул метки, существующее в ИХА, отсутствует у аналитических методов, в которых регистрация метки основана на других физических принципах. Разработан амплификатор-ридер температурного контраста для регистрации наночастиц золота на иммунохроматографических мембранах [32]. Такой ридер позволяет уменьшить предел обнаружения в восемь раз для ИХА вируса гриппа, также при диагностике малярии, ИХА выявлению Clostridium difficile, по сравнению с оптическим считывателем.

Для регистрации сигнала ИХА используют также магнитные свойства нанодисперсной метки [33–35]. В последних исследованиях предложен серийный глюкометр с электрохимическим детектированием в качестве регистратора результатов ИХА [36].

Для учета и регистрации результатов следует ожидать, что тестовые системы будущего будут интегрированы с регистрирующими системами (рефлектометры, флуориметры), а также с инструментами для сбора, хранения и обработки информации.  В литературе обобщены тенденции трансформации ИХА из визуального в инструментальный метод [37] и представлено современное состояние аналитических технологий на основе использования мобильных телефонов/смартфонов [38, 39].

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Данные литературных источников и собственные исследования авторов показывают, что ИХА широко применяют для целей идентификации патогенных для человека бактерий, вирусов и токсинов.

Сравнение технических характеристик разработанных укладок и комплектов для индикации патогенов с аналогичными зарубежными образцами (табл. 1) показало, что наши работы следовали в русле мировой тенденции развития метода — от создания отдельных иммунохроматографических монотестов к мультиплексному анализу, поиску наиболее чувствительных методов регистрации, расширению номенклатуры выявляемых патогенов [40]. Комплекты ЭкБ и ЭкБ-01 выгодно отличаются от зарубежных аналогов более широкой номенклатурой выявляемых патогенов, автоматизацией учета результатов анализа (комплект ЭкБ) при сравнимом, либо лучшем пороге чувствительности. Указанные средства индикации патогенов востребованы в практике центров гигиены и эпидемиологии, специализированных лабораторий других ведомств, обеспечивающих биологическую безопасность.

Рассмотренные в обзоре пути совершенствования позволяют утверждать, что иммунохроматографические аналитические системы смогут более эффективно выявлять патогены бактериальной, вирусно-риккетсиозной и токсинной природы. При этом повысится специфичность анализа до уровня штамма, в случае бактериальных возбудителей, что позволит осуществить процесс специфичной индикации патогенных микроорганизмов и токсинов на новой технологической базе.