При производстве инактивированных гриппозных вакцин необходимо обеспечивать полную инактивацию вируса гриппа для достижения безопасности готового препарата. Указанное положение рекомендовано как Всемирной организацией здравоохранения, так и Европейским медицинским агентством [1, 2], и требуется при производстве вакцин международного качества.

В свою очередь куриные эмбрионы, используемые в процессе производства гриппозных вакцин, потенциально могут быть заражены зоонозными инфекциями, такими как вирус лейкоза птиц, аденовирус птиц, микоплазма. Согласно указанным выше рекомендациям, разработанный технологический процесс должен обеспечивать инактивацию и перечисленных контаминантов.

Известны различные способы инактивации вирусов при производстве вакцин, в том числе при помощи УФ-излучения, воздействия формальдегида или β-пропиолактона [3]. Указанные методы обладают различной эффективностью в отношении вирусов.

Ранее было рассмотрено влияние инактивирующих агентов на аденовирус птиц штаммов CELO и Fontes [4], показана эффективность β-пропиолактона и УФ-излучения при инактивации в отношении указанных штаммов. Выявлено, что спустя 10 ч инактивации β-пропиолактоном аденовирус штамма CELO показал снижение вирусной нагрузки на 4,12 ± 0,06 lg (БОЕ)/мл, а аденовирус штамма Fontes — на 4,20 ± 0,19 lg (БОЕ)/мл, что указывает на эффективное действие β-пропиолактона при инактивации. Проведение инактивации УФ-излучением позволяет снизить вирусную нагрузку штамма CELO на 4,69 ± 0,89 lg (БОЕ)/мл, а штамма Fontes на 4,44 ± 1,06 lg (БОЕ)/мл за 5 мин. Отмечено, что добавление детергента на стадии расщепления также снижает вирусную нагрузку на 0,93 ± 0,15 lg (БОЕ)/мл и 1,04 ± 0,12 lg (БОЕ)/мл для штаммов CELO и Fontes соответственно при использовании н-октил-β-D-глюкопиранозида и на 1,18 ± 0,17 lg (БОЕ)/мл и 1,12 ± 0,38 lg (БОЕ)/мл — при использовании тетрадецилтриметиламмоний бромида.

В связи с этим возникла необходимость подробного изучения влияния указанных выше агентов на еще один возможный контаминант — вирус лейкоза птиц. Известно, что вирус лейкоза птиц относится к РНК-содержащим онкорнавирусам семейства Retraviridae, которые вызывают лейкоз и саркомы у птиц и включают шесть антигенных подгрупп А, В, С, D, Е, J. Вирусы этой группы обнаруживают в опухолевой ткани, крови, в паренхиматозных органах, а также в яйцах кур. Согласно проведенному ранее исследованию, на територии Российской Федерации в 90% исследованных птицеводческих хозяйств были выявлены антитела к вирусу лейкоза птиц [5]. Таким образом, существует серьезный риск контаминирования яйца для вакцинного производства вирусом лейкоза птиц. Следует также отметить, что в Российской Федерации возникает острая необходимость регламентирования отсутствия вируса лейкоза птиц в яйце курином инкубационном для вакцинного производства.

В литературе описаны методы инактивации при помощи УФ-излучения, однако изучение инактивации проведено только на штамме RAV-1 [6]. Еще одним возможным инактиватором является формальдегид, но формальдегид может оказывать влияние на стабильность готовой гриппозной вакцины и на ее иммуногенность в связи с высокой реакционной способностью формальдегида и возможностью химической модификации гемагглютинина вируса гриппа с затрагиванием антигенных детерминант [7, 8]. В свою очередь другой химический инактиватор — β-пропиолактон не приводит к указанным недостаткам, эффективно инактивирует вирус гриппа, а также гидролизуется до 3-гидроксипропионовой кислоты, которая является промежуточным метаболитом липидного обмена человека [9], что влияет и на безопасность вакцины.

Целью настоящего исследования было выбрать оптимальный агент для инактивирования контаминанта гриппозных вакцин — вируса лейкоза птиц, в частности наиболее распространенных групп RAV-1 (подгруппа А) и RAV-2 (подгруппа B) и минимальную длительность стадии инактивации для гарантированного снижения вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg инфекционных единиц (ИЕ)/мл [10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы

При работе использовали:

• вирус лейкоза птиц RAV-1 (ATCC-VR-335), полученный из коллекции ATCC (США);
• вирус лейкоза птиц RAV-2 (ATCC-VR-1828), полученный из коллекции ATCC (США);
• куриные эмбрионы 10-дневные («Птицефабрика Синявинская»; Россия);
• тест-систему IDEXX ALV Ag: Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit (IDEXX Laboratoties, Inc., США).

Получение вируссодержащей аллантоисной жидкости

Для культивирования вируса гриппа использовали 9–11-дневные куриные эмбрионы. Заражение куриных эмбрионов проводили дозой 0,2 мл c инфекционной активностью 102,0–104,5 и эмбриональной инфекционной дозой, равной 50 (ЭИД50). Инкубацию куриных эмбрионов осуществляли при 35 °С в течение 48 ч для вируса гриппа типа А и в течение 72 ч — для вируса гриппа типа В. После инкубации эмбрионы охлаждали и собирали вируссодержащую аллантоисную жидкость (ВАЖ). Получение вирусных концентратов (ВК)

ВАЖ подвергали фильтрации через каскад фильтров с диаметром пор 10, 6 и 1 мкм с последующим концентрированием и использованием ультрафильтрационной установки с пределом отсечения 300 кДа. Сконцентрированную вируссодержащую аллантоисную жидкость подвергали ультрацентрифугированию в градиенте плотности сахарозы (60–20%). Собирали фракции сахарозного градиента в диапазоне 40–25% сахарозы. Отобранные фракции сахорозного градиента объединяли и хранили при температуре –20 °С до проведения исследования.

Культивирование вируса лейкоза птиц штаммов RAV-1 и RAV-2

Культивирование вируса лейкоза птиц штаммов RAV-1 и RAV-2 проводили на первичной культуре клеток фибробластов (ФЭК), приготовленной из 10-суточных эмбрионов кур. Клеточную культуру ФЭК получали в соответствии с методом, описанным в литературе [11] в культуральных флаконах объемом 75 см³.

После формирования монослоя культуры клеток готовили рабочее разведение вируса на поддерживающей среде (питательная среда 199, с добавлением TPCKтрипсина до конечной концентрации 2 мкг/мл и БСА (V фракция) до конечной концентрации 0,2%). Подготовленное разведение вируса вносили в первичную культуру клеток фибробластов КЭ (85–95% монослой), предварительно дважды отмытую ФБР, в объеме 2–3% от объема матраса (необходимом для полного покрывания монослоя вируссодержащей жидкостью). Разведение вируса вносили на культуру клеток фибробластов в объеме 3 мл, оставляли на контакт в течение 1 ч при температуре +37 °С. Затем добавляли поддерживающую среду (6 мл) и инкубировали в СО₂-инкубаторе при +37 °С. Смену среды проводили на 5-е сутки инкубации.

Забор образцов (вируссодержащую культуральную жидкость) производили на 13-й (RAV-1) или на 7-й (RAV-2) день. По окончании инкубации флаконы с вируссодержащей жидкостью замораживали при –20 °С и оставляли оттаивать при комнатной температуре (процедуру замораживанияразмораживания повторяли 2–3 раза). Проводили сбор вируссодержащей жидкости из флаконов, центрифугировали при 1159 g 10 мин для осаждения клеток.

Определение титра вируса лейкоза птиц штаммов RAV-1 и RAV-2 в первичной клеточной культуре фибробластов куриного эмбриона

Определение титра вируса RAV-1 и RAV-2 в ВАЖ и ВК при моделировании инактивации вируса β-пропиолактоном (β-ПЛ) и УФ-облучением проводили путем титрования образцов на разных сроках инактивации на первичной культуре клеток ФЭК с последующим определением наличия антигена р27 в ИФА в каждом разведении. Каждый образец исследовали в трипликатах. Готовили 10-кратные разведения образцов (от 10^–1 до 10^–6), полученных на поддерживающей среде. Подготовленные разведения образцов, полученных в процессе моделирования инактивации RAV-1 β-ПЛ или УФ-облучением, и отрицательный контроль (не контаминированные серии ВК и ВАЖ) вносили на культуру клеток ФЭК в объеме 0,5 мл на лунку (каждое разведение исследовали в трех повторностях), оставляли на контакт в течение 5 ч при температуре +37 °С. Затем удаляли вируссодержащую культуральную жидкость и вносили поддерживающую среду по 1 мл в лунку. Планшеты инкубировали в СО₂-инкубаторе при +37 °С и 5% СО₂ в течение 7 дней.

По окончании инкубации планшеты с первичной клеточной культурой фибробластов замораживали при –20 °С и оставляли оттаивать при комнатной температуре, процедуру замораживания-размораживания повторяли 2 раза. Проводили сбор культуральной жидкости из лунок планшетов, центрифугировали при 3000 об./мин для осаждения собранных вместе с жидкостью клеток.

Надосадочную жидкость далее исследовали на наличие антигена р27 в ИФА с помощью тест-системы IDEXX ALV Ag: Avian Leukosis Virus Antigen Test Kit (IDEXX Laboratoties, Inc.; США) в соответствии с инструкцией к тест-системе. За титр принимали наибольшее разведение образца вируссодержащей жидкости, которое дает значение соотношения оптических плотностей исследуемой пробы к положительному контролю больше 0,2. Предел чувствительности метода — 1lg ИЕ/мл. Титр меньше 1lg ИЕ/мл принимали за 0,5.

Статистическая обработка результатов

Статистическую обработку результатов осуществляли при помощи программного пакета Microsoft Excel 365 (Microsoft corp.; США), а также Minitab 19 (Minitab Inc.; США). Доверительные интервалы среднего значения рассчитывали с доверительной вероятностью 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение динамики инактивации вируса лейкоза птиц в вируссодержащей аллантоисной жидкости β-пропиолактоном

Для моделирования инфицирования вируссодержащей аллантоисной жидкости (ВАЖ) вирусом лейкоза птиц и их инактивации эксперимент проводили аналогично изучению инактивации аденовируса птиц [4]. К образцам ВАЖ добавляли предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий вирус лейкоза птиц, в объеме, равном 10% от исходного объема пробы, так чтобы конечное его содержание составляло не менее 5 lg ИЕ/мл. К полученным контаминированным образцам добавляли β-пропиолактоном до конечной концентрации 0,09% и определяли значение титра вируса лейкоза птиц в образцах в соответствии с описанной методикой. Динамика инактивации представлена на рис. 1.

Согласно полученным данным, снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg ИЕ/мл происходило не менее чем через 12 ч после добавления β-пропиолактона при температуре от +4 до +8 °С (таблица).

Изучение динамики инактивации вируса лейкоза птиц в вирусных концентратах с помощью ультрафиолетового облучения

Для моделирования инфицирования ВК вирусом лейкоза птиц и их инактивации эксперимент проводили аналогично изучению инактивации аденовируса птиц [4]. К образцам ВК добавляли предварительно оттитрованный инфекционный материал, содержащий вирус лейкоза птиц, в объеме, равном 10% от исходного объема пробы, так чтобы конечное его содержание составляло не менее 5 lg ИЕ/мл. В чашки Петри диаметром 90 мм помещали по 7 мл контаминированного ВК. Чашки Петри облучали УФ-излучением, мощностью 60 Вт на расстоянии 20 см в течение 0; 0,5; 1; 2 и 5 мин. Инактивацию проводили при температуре +18 °C.

Через указанные промежутки времени чашки удаляли из установки и проводили отбор проб объемом 1 мл для дальнейшего определения инфекционного титра в соответствии с описанной методикой. Динамика инактивации представлена на рис. 2. 

Снижение вирусной нагрузки не менее чем на 4 lg ИЕ/мл происходит не менее чем через 5 мин действия УФ-излучения (таблица).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Согласно многолетним данным ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, для полной инактивации вируса гриппа штаммов, рекомендованных Всемирной организацией здравоохранения для включения в состав инактивированной гриппозной вакцины, под действием β-пропиолактона достаточно 4–6 ч, а для УФ-излучения — 3–4 мин. Однако этой продолжительности недостаточно для инактивации возможных контаминантов и вызывает риски получения небезопасной вакцины. По результатам более раннего исследования [4], нами было доказано, что инактивация как β-пропиолактоном так и УФ-излучением эффективна в отношении контаминанта — аденовируса штаммов Fontes и CELO. При этом снижение вирусной нагрузки более чем на 4 lg БОЕ/мл достигается не менее чем за 10 ч при инактивации ВАЖ β-пропиолактоном (4,12 ± 0,06 lg и 4,20 ± 0,19 lg для CELO и Fontes соответственно) и не менее чем через 5 мин инактивации УФ-излучением (4,69 ± 0,89 lg и 4,44 ± 1,06 для CELO и Fontes соответственно).

Согласно литературным данным, для инактивации вируса лейкоза птиц используют термический метод и инактивацию формалином в течение 24 ч [12, 13], но указанные способы малоприменимы при производстве гриппозных вакцин в связи со снижением иммуногенности готового продукта, а также токсичности формальдегида. Инактивация вируса лейкоза птиц УФ-излучением описана только для RAV-1 [6], снижение вирусной нагрузки на 2 lg за 10 мин при облучении вирусосодержащих материалов с расстояния 40 см лампами суммарной мощностью 30 Вт.

Проведенное исследование показало, что β-пропиолактон и УФ-излучение эффективны и в отношении штаммов RAV-1 и RAV-2 вируса лейкоза птиц. Однако время для достижения полноты инактивации вируса лейкоза птиц β-пропиолактоном составляет 12 ч, что больше на 2 ч по сравнению с аденовирусом, поэтому, для гарантированного инактивирования обоих контаминантов, длительность стадии инактивации β-пропиолактоном в технологическом процессе получения противогриппозных инактивированных вакцин должна составлять не менее 12 ч при температуре +4–+8 °С. При инактивации с помощью УФ-излучения нижняя граница доверительного интервала (p = 0,95) коэффициента снижения вирусной нагрузки составляет менее 4 lg, что свидетельствует о необходимости увеличения продолжительности инактивации более чем 5 мин.

Таким образом, инактивация β-пропиолактоном позволяет получать более воспроизводимые результаты и гарантированно снижать вирусную нагрузку более чем на 4 lg в отношении и вируса лейкоза птиц и аденовируса птиц в процессе получения гриппозных вакцин. Указанный факт минимизирует риски, и β-пропиолактон используют в качестве инактиватора в технологических процессах производства инактивированных гриппозных вакцин различных компаний, например ФГУП СПбНИИВС ФМБА России, Novartis, GSK, ID Biomedical Corp of Quebec [14–16].

ВЫВОДЫ

В результате исследования выявлено, что минимальное время инактивирования аллантоисной жидкости, содержащей вирус лейкоза птиц, с использованием β-пропиолактона при получении гриппозных вакцин составляет 12 ч, что гарантированно снижает нагрузку вируса лейкоза птиц на 4 lg ИЕ/мл. В случае использования УФ-излучения для инактивации вирусных концентратов время инактивации должно составлять не менее 5 мин экспозиции, что снижает нагрузку вируса лейкоза птиц на 4 lg ИЕ /мл. Такие схемы инактивации позволят гарантированно обеспечить полноту инактивации аденовируса и вируса лейкоза птиц  добиться должного уровня безопасности при производстве гриппозных вакцин в отношении указанных контаминантов. Следующим этапом работы будет изучение кинетики инактивации микоплазм различными инактиваторами в процессе получения гриппозных вакцин.