В этиологической структуре детской инвалидизации и смертности одно из первых мест принадлежит тяжелой механической травме (ТМТ) [1, 2]. ТМТ сопровождается развитием декомпенсации систем жизнеобеспечения организма в результате комплексного воздействия таких факторов повреждения, как травматическое механическое повреждение, кровопотеря и гипоксия. Инициирующим фактором является механическое повреждение. Оно ведет к выбросу ассоциированных с повреждением молекулярных паттернов DAMP (от англ. damageassociated molecular pattern), которые в свою очередь способны нарушать клеточный иммунный ответ на экзогенные антигены и патоген-ассоциированные молекулярные паттерны PAMP (от англ. pathogenassociated molecular pattern), что вносит свой вклад в развитие дисфункции иммунной системы. Одним из таких эндогенных тканевых сигналов DAMP, запускающих и регулирующих иммунный ответ на повреждение, является внеклеточный АТФ (eATФ) [3]. При травматическом воздействии наблюдается стойкое повышение уровня eATФ в очаге повреждения [4, 5]. Являясь одним из основных компонентов пуринергической системы и сильным провоспалительным сигналом, eATP важен при регуляции функционирования Т-клеток. Как мощный молекулярный паттерн, связанный с повреждениями, eАТФ играет ключевую роль в инициировании воспалительной реакции через пуринергические рецепторы P2R. В то же время конечный продукт расщепления eАТФ — внеклеточный аденозин, являясь иммуносупрессором, играет важную роль в ограничении воспалительного ответа. Он осуществляет свои функции через аденозиновые рецепторы A2А, блокируя сигнал Т-клеточного рецептора (TCR) путем ингибирования фосфорилирования зета-acсоциированного белка 70 (ZAP-70) и активации активирующего белка 1 (AP-1), что приводит к снижению продукции IL2, экспрессии CD25 и ингибированию пролиферации Т-клеток. Уровни eATФ и внеклеточного аденозина, а также их биологические эффекты жестко регулируются каталитическими эффектами эктоферментов, экспрессируемых на плазматической мембране иммунных клеток, — CD39 (E-NTPDasa1) и CD73 (Ecto5'NTasa). CD39 метаболизирует АТФ до АДФ, пирофосфата и АМФ.  АМФ расщепляется с помощью эктонуклеотидазы CD73 до аденозина и фосфата. Таким образом, активность экзонуклеотидаз CD39 и CD73 обеспечивает баланс провоспалительного действия АТФ и противовоспалительного аденозина в очаге воспаления [6–9]. Тяжелая травма обычно сопровождается периодом выраженной иммуносупрессии, в патогенезе которой ключевую роль занимает снижение уровня T-лимфоцитов. Оценка абсолютного и относительного количества субпопуляций Т-хелперов — значимый маркер для определения тяжести и прогноза исхода патологического процесса [10–13]. По причине высокой клинической значимости определения уровней экспрессии экзонуклеотидаз CD39 и CD73 на различных популяциях циркулирующих лимфоцитов в диагностике и прогнозе широкого круга заболеваний [14] целью настоящего исследования было выявить информативные иммунологические критерии тяжести и прогноза исхода травматической болезни у детей на основе оценки абсолютного и относительного количества субпопуляций T-лимфоцитов, а также уровня экспрессии эктонуклеотидаз CD39 и CD73 в популяциях T_reg и Th17 при тяжелой механической травме у детей.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

В ходе исследования было обследовано 43 пациента (28 мальчиков (65,1%), 15 девочек (34,9%); 116 наблюдений) с ТМТ, проходивших лечение в отделении анестезиологииреанимации НИИ НДХиТ ДЗ г. Москвы в период с 2020– 2021 гг. Лабораторное обследование выполняли на базе лабораторного отдела ФГАУ НМИЦ здоровья детей Минздрава РФ в динамике травматической болезни от 1 до 5 раз в зависимости от длительности пребывания ребенка в отделениии анастезиологии-реанимации (ОАР) НИИ НДХиТ ДЗ г. Москвы. Средний возраст детей составлял 13,0 (6,0–15,0) лет (Me (Q₂₅–Q₇₅)). В качестве декретированных сроков лабораторного обследования были выбраны первые, третьи, пятые, седьмые, 14-е сутки с момента получения травмы.

Контрольную группу в исследовании составил 41 условно здоровый ребенок. Все дети, вошедшие в контрольную группу, проходили диспансеризацию на базе ФГАУ НМИЦ здоровья детей Минздрава РФ и были сопоставимы по возрасту и полу: возраст — 12,41 (7,4–16,2) лет; 26 мальчиков (63,4%), 15 девочек (36,6%).

Для объективной оценки тяжести повреждения в работе использовали шкалу тяжести повреждения (Injury severity score, ISS), шкалу комы Глазго — Glasgow Coma Scale (ШКГ, GCS) и ее модификацию для пациентов младше двух лет педиатрическую ШКГ — Pediatric GCS (pGCS) [15].

Для оценки исхода ТМТ использовали шкалу исходов комы Глазго — Glasgow Outcome Scale (ШИГ, GOS) и шкалу исходов тяжелой травмы — Severe Injury Outcomes Scale (ШИТТ, OISS) [16]: категория 1 — полное восстановление (способность вести прежний уровень жизни с прежним уровнем активности); категория 2 — хорошее восстановление (имеются  последствия, не ограничивающие уровень социальной адаптации, но ограничивающие прежний уровень функциональной активности, требующие продолжения этапного или восстановительного лечения); категория 3 — умеренная инвалидизация (имеются последствия, не позволяющие восстановить прежний функциональный уровень, не нуждается в уходе посторонних); категория 4 — тяжелая инвалидизация (нуждается в постороннем уходе); категория 5 — смерть.  Оценку по ШИТТ и ШИГ проводили при выписке пациента.

Критерии включения пациентов в исследование: пациенты с ТМТ (ISS ≥ 16), проходившие лечение в отделении ОРИТ. Критерии исключения: наличие сопутствующих острых воспалительных и хронических заболеваний.

На первом этапе проводили анализ полученных результатов для контрольной группы и группы детей с ТМТ. На втором этапе — для двух групп больных, разделенных по ШИГ и ШИТТ: ТМТ с благоприятным исходом (ТМТбл, n = 24), ТМТ с неблагоприятным исходом (ТМТнебл, n = 17) (табл. 1). Благоприятным исходом при ТМТ считали по ШИГ 4–5 балла  или ШИТТ 1–2 балла, неблагоприятным исходом по ШИГ 2–3 балла или по ШИТТ 3–4 балла. Отдельно была описана группа ТМТ с летальным исходом (ТМТли, n = 2) (табл. 1).

У пациентов оценивали количество Th17-лимфоцитов (Th17 — CD3⁺CD4⁺CD161⁺), количество регуляторных Т-лимфоцитов (T_reg — CD4⁺CD127^lowCD25^high), а также определяли уровень экспрессии рецепторов пуринергического сигналинга на T_reg (СD39⁺T_reg — CD4⁺CD127^lowCD25^highCD39⁺ и СD73⁺T_reg — CD4⁺CD127^lowCD25^highCD73⁺) и Th17-лимфоцитах (СD39⁺Th17 — CD3⁺CD4⁺CD161⁺CD39⁺ и СD39⁺Th17 — CD3⁺CD4⁺CD161⁺CD73⁺). Оценку количественных показателей субпопуляционного состава T-лимфоцитов периферической крови выполняли с использованием двухплатформенной технологии. Для подсчета абсолютного числа лимфоцитов в работе использовали гематологический анализатор Sysmex XT-2000i (Sysmex Corporation; Япония). Пробоподготовка цитофлуориметрического анализа включала в себя инкубирование в течение 20 мин в темном месте 100 мкл цельной крови с 10 мкл моноклональных антител, меченных флуорохромами. Для лизирования эритроцитов использовали лизирующий раствор BD FACS™ Lysing Solution (BD Biosciences; США), длительность инкубации с которым в темноте при комнатной температуре не превышала 10–12 мин. Запись полученного образца и анализ результатов выполняли на проточном цитофлуориметре Novocyte (ACEA Biosciences; США). Для определения субпопуляций лимфоцитов использовали следующие поверхностные маркеры: CD45, IgG1, IgG2a, CD3, CD4, CD25, CD127, CD161, CD39, CD73 (Beckman Coulter, США; BD Biosciences, США; SONY corp., Япония).

Обработку полученных данных проводили с помощью компьютерных программ MS Excel 2016 (Microsoft corp.; США), Statistiсa 10 (StatSoft, Inc.; США), IBM SPSS Statistics 25 (IBM corp.; США). Результаты представлены в виде медианы (Me) и квартилей (Q₂₅–Q₇₅). Анализ различия признаков проводили при помощи U-критерия Манна–Уитни с корректировкой уровня достоверности с учетом поправки Бонферрони для множественных сравнений. Для оценки связи между признаками использовали корреляционный анализ с вычислением матрицы коэффициентов ранговых корреляций Спирмена R. Оценку значимости количественных показателей и выбор пороговых значений (cut-off point) выполняли по рабочей характеристической кривой (ROC-кривой). Пороговые значения определяли исходя из требований максимальной чувствительности и специфичности. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали величину p < 0,05 (*).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Анализ, проведенный в контрольной группе и у детей с ТМТ, выявил выраженное снижение абсолютного количества Т_reg и Th17 в раннем посттравматическом периоде. Значения данных показателей для больных с ТМТ значимо отличались от показателей контрольной группы (табл. 2, табл. 3). При этом соотношение T_reg/Th17 c третьих по пятые сутки с момента травмы было снижено в сравнении с контрольной группой, за счет постепенного повышения уровня Th17 начиная с третьих суток (табл. 2, табл. 3).

Динамика абсолютного количества T_reg и Th17, экспрессирующих ферменты CD39 и CD79, повторяла динамику малых субпопуляций CD4⁺-лимфоцитов в остром посттравматическом периоде, однако для Treg изменения были более выражены (табл. 2, табл. 3). Относительное количество СD39⁺T_reg у детей с ТМТ изменялось от 6,3 до 76,6% и существенно превышало значение CD39⁺Th17 (диапазон изменчивости: 0,3–24,1%) (табл. 2). Для CD73 относительное количество было существенно выше на Th17 (диапазон изменчивости — 2,6–99,9%), чем на Т_reg (диапазон изменчивости — 0,5–55,2%). Достоверных отличий от контрольной группы выявлено не было. Однако для части наблюдений значения существенно превышали максимальные уровни контрольной группы (табл. 2).

Анализ средней интенсивности флюоресценции (FL) эктонуклеотидаз на T_reg и Th17 выявил различия для CD73 на T_reg. Значения FL для CD73 для 3-х суток после травмы было повышенным по сравнению с контрольной группой (табл. 2, табл. 3).                  

Корреляционный анализ позволил выявить зависимость процентного содержания T_reg и Th17, экспрессирующих CD39 и CD73, и уровня флюоресценции маркеров. Для Th17 процентное содержание клеток, экспрессирующих ферменты, незначительно увеличивается с повышением уровня флюоресценции CD39 (r = 0,27; p = 0,002) и CD73 (r = 0,20; p = 0,018) (рис. 1 А, В).  Процентное содержание T_reg, экспрессирующих ферменты, увеличивается с повышением уровня флюоресценции: CD39 (r = 0,71; p < 0,001), а для CD73 незначительно снижается (r = –0,18; p < 0,025; рис. 1). Для CD39⁺T_reg выявлена наиболее сильная прямая зависимость (рис. 1 Б). 

При сравнительном анализе посттравматического периода в группах с ТМТбл и ТМТнебл показано существенное повышение относительного количества Th17 с первых по третьи сутки в группе с неблагоприятным течением, при этом по количеству T_reg группы не различались (табл. 4). Показатели экспрессии CD39 на T_reg и Th17-лимфоцитах значимо различались в группах ТМТбл и ТМТнебл и были существенно повышены у пациентов с неблагоприятным течением посттравматического периода (табл. 4, рис. 2). Для двух пациентов с летальным исходом сравнительный анализ не проводили по причине недостаточного числа наблюдений (число наблюдений — три), но для данной категории больных при сопоставимых значениях относительного количества T_reg и Th17 были получены крайне низкие показатели экспрессии эктонуклеотидаз на Treg и Th17 (табл. 4). 

Приведенные ниже клинические примеры показывают динамику экспреcсии CD39 на T_reg и Th17 у пациентов с неблагоприятным (клинический пример 1, рис. 3) и с благоприятным (клинический пример 2, рис. 3) исходом травмы. 

Анализ параметров флюоресценции эктонуклеотидаз на T_reg и Th17 у детей с ТМТбл и ТМТнебл выявил достоверные различия для CD39 на Т_reg. Для ТМТнебл отмечалось повышение флюоресценции CD39 на T_reg с 1 по 7 сутки после травмы (табл. 5). Для 2-х пациентов с летальным исходом значения параметров флюоресценции составили: FL CD39 T_reg — 3,95 (3,7–4,67), FL CD73 T_reg — 4 (2,55–4,55), FL CD39 Th17 — 6,77 (5–8,55), FL CD73 Th17 — 3,52 (3,1–3,95), значения FL CD39 T_reg оказались крайне низкими при сопоставлении с ТМТбл и ТМТнебл (табл. 5).

Для показателей, продемонстрировавших высокую прогностическую значимость при травматической болезни у детей, был проведен ROC-анализ для групп ТМТбл и ТМТнебл. Получено хорошее качество разделительной модели для CD39⁺ T_reg % (AUC = 0,741) и FL CD39 T_reg (AUC = 0,721). В результате для CD39⁺T_reg cut-off составил 44,4% (чувствительность — 66,6 и специфичность — 84,7) и FL CD39 T_reg — 8,25 у.е. (чувствительность — 87,5 и специфичность — 62,5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В исследовании показано, что в результате травматического повреждения у детей с ТМТ развивается дисбаланс T_reg/Th17 в раннем посттравматическом периоде с незначительным смещением в сторону Th17 на фоне выраженного снижения абсолютного количества T_reg и Th17, что согласуется с данными других авторов [11–13, 17]. Среди T_reg и Th17 абсолютное число клеток, экспрессирующих CD39 и CD73, также пропорционально снижается в критическом периоде травматической болезни.

Анализ содержания клеток, экспрессирующих эктонуклеотидазы CD39 и CD73 в популяциях CD4⁺лимфоцитов, у детей с ТМТ выявил наибольшую экспрессию CD39 в популяции T_reg до 76,6%, а CD73 — Th17 до 99,9%, в отличие от условно здоровых детей, для которых экспрессия CD39 в популяции T_reg колебалась от 19 до 49%, а экспрессия CD73 Th17 — от 7 до 35% [18].

В нашей работе мы обнаружили различия в экспрессии эктонуклеотидаз в раннем посттравматическом периоде ТМТ у детей в зависимости от исхода травматической болезни. Для детей с неблагоприятным исходом ТМТ отмечалось увеличение процетного содержания CD39 на T_reg и Th17, а также отмечалось повышение интенсивности флюоресценции CD39 на T_reg с первых по седьмые сутки после травмы в отличие от группы пациентов с благоприятным исходом. Это может быть связано с ролью эктонуклеотидаз, особенно CD39, в усилении гидролиза eATФ и накопления в очаге повреждения внеклеточного аденозина, что приводит к запуску через систему аденозиновых рецепторов A2R каскада реакций, приводящего к подавлению иммунного ответа для предотвращения массивного повреждения тканей [14]. Выявленная нами прямая корреляционная связь между уровнем флюоресценции CD39 и процентным содержанием CD39⁺T_reg указывает на то, что в ответ на повреждение увеличивается доля T_reg, высокоэкспрессирующих эктонуклеотидазу CD39. В более ранних работах на взрослых здоровых донорах было показано, что клетки с большим количеством CD39 на T_reg более эффективно гидролизуют ATФ [8]. Для эктонуклеотидазы CD73 связи процентного содержания с интенсивностью флюоресценции выявлено не было, вероятно, из-за того, что CD73 присутствует как на мембране клеток, так и в растворимой форме [19]. Для пациентов с летальным исходом были обнаружены крайне низкие значения экспрессии эктонуклеотидаз, что может свидетельствовать о развитии декомпенсации функций иммунной системы при крайне тяжелых повреждениях.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты показывают, что экспрессия CD39 и CD73 в популяциях T_reg и Th17 в значительной степени связана с тяжестью повреждения и может быть использована для прогноза исхода травматической болезни у детей. Более глубокое понимание роли пуринергического сигналинга в патогенезе травматичекой болезни позволяет задуматься о терапевтическом потенциале биопрепаратов на основе растворимых форм эктонуклеотидаз для воздействия на иммунную систему при таких критических состояниях, как тяжелое травматическое повреждение [20].