Детский организм отличается от организма взрослого не только физической кондицией, но и зрелостью органов, особенностями метаболизма, реактивностью иммунной и эндокринной систем и др. Динамические физиологические процессы в детском организме сопровождают существенные изменения концентрации многих биомаркеров в крови, в том числе гормонов [1].

На практике объективная оценка и последующая интерпретация результатов лабораторных и инструментальных исследований с учетом определенных возрастных периодов ребенка нередко достаточно сложны и не всегда однозначны, что негативно отражается при определении тактики ведения детей и организации лечебнопрофилактических мероприятий [2, 3]. Помощь в решении этих проблем могут оказать референтные интервалы — базовый инструмент в медицине, позволяющий правильно интерпретировать результаты анализа крови и отличать нормальные физиологические изменения от дебюта патологических процессов в организме ребенка [2].

С точки зрения статистики, референтный интервал (РИ) — это предельные значения диапазона, в который входит определенный процент значений (обычно 95%) здоровой популяции. Контрольные пределы определяются путем расчета 2,5-го и 97,5-го процентилей результатов анализа [2, 4, 5]. Исходя из этого, 5% результатов могут быть интерпретированы как отклонение от нормы.

Согласно нормативным документам, выбор статистического метода расчета референтного интервала обусловлен характером распределения в ряду референтных значений: при наличии нормально распределенных данных применяют параметрические методы, при отсутствии предварительных гипотез касаемо распределения данных используют непараметрические методы. Определение 95%го доверительного интервала возможно при нормальном распределении референтных значений; в свою очередь при расчете референтных интервалов для выборок, которым свойственны распределения значений в референтных группах здоровых субъектов, отличающиеся от нормального распределения, применяют непараметрические методы, и, в частности, ранговый метод [5].

При «прямом» традиционном подходе РИ обычно определяют как интервал между двумя «эталонными» пределами (2,5 и 97,5-й процентили), полученными из выборки эталонной популяции [4, 5].

На сегодняшний день широкое распространение получили также косвенные методики установления РИ, в которых анализируют базы данных лабораторных параметров. Главной проблемой, ограничивающей применение косвенной методики, является наличие сложных статистических алгоритмов, необходимых для создания и применения критериев исключения нездоровых субъектов.

Следует отметить, что расчет и верификация РИ довольно сложные процессы. В 2008 г. сотрудниками института стандартов клинических лабораторий (CLSI) и Международной федерацией клинической химии и лабораторной медицины (IFCC) было создано руководство (C28-A3) для определения и проверки РИ [6]. Точно установленные РИ имеют решающее значение для корректной постановки диагноза и выбора метода лечения, тогда как общепопуляционные и неадаптированные для детей РИ показателей крови могут привести к постановке ошибочного диагноза, неадекватного лечения, более высоких расходов на здравоохранение и т. д.

Анализ литературных данных о педиатрических РИ выявил основные направления современных исследований по расчету РИ показателей крови у детей: костные маркеры [7], маркеры сердечно-сосудистых заболеваний и риска возникновения метаболического синдрома [8], гормоны щитовидной железы и соматотропный гормон [9], а также врожденные особенности метаболизма [10].

За рубежом в последние годы были опубликованы итоги нескольких масштабных проектов по расчету РИ показателей крови на многочисленных выборках здоровых детей (таблица). К сожалению, в нашей стране до настоящего времени подобных проектов нет. Исключением является реализованный в 2020 г. в ФГБУ ФНКЦСМ ФМБА России проект по расчету РИ показателей крови у несовершеннолетних спортсменов, который по объему выборки может сравниться с зарубежными проектами, указанными выше [11].

Проект KiGGS

В Европе одним из наиболее масштабных проектов по расчету РИ показателей крови у детей и подростков стал проект KiGGS, реализованный в институте Роберта Коха (RKI) в Германии. В рамках KiGGS на выборке здоровых детей были определены РИ для многочисленных лабораторных параметров сыворотки крови и мочи [30–34]. Выборка состояла из 17 641 образцов крови и мочи детей и подростков в возрасте 0–17 лет. Были изучены 43 показателя крови, разделенных на три основные категории в зависимости от их связи с питанием, риском неинфекционных заболеваний и иммунного статуса. Рассчитаны медиана и РИ для таких показателей, как общий уровень холестерина, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и липопротеинов высокой плотности (ЛПВП), триглицеридов, кальцидиола. Для тиреоидных гормонов были определены значения медианы, 25-го и 75-го процентилей у 12 756 субъектов старше трехлетнего возраста. В KiGGS, кроме того, изучали взаимосвязь биомаркеров. Например, была выявлена положительная взаимосвязь между тиреотропным гормоном и концентрацией показателей липидного обмена, за исключением ЛПВП.

Важной задачей проекта KiGGS было набрать большое число участников (получить репрезентативную выборку), чтобы иметь возможность разделить их на возрастные группы для дифференцированной оценки с достаточной статистической значимостью. Определенной проблемой стало включение в выборку детей и подростков разных национальностей, проживающих в Германии, большая численность которых была способна исказить результаты расчета РИ показателей крови для европейской популяции. В результате формирования выборки доля детей и подростков без немецкого гражданства в выборке составила 8,4%, что является незначительным показателем. Авторы планируют продолжить проект и рассчитать РИ показателей крови детей, дифференцированные по полу и возрасту, федеральным землям Германии, статусу мигранта и т. д.

Проект NORIP

Другим проектом по расчету педиатрических норм является скандинавский проект NORIP, инициированный еще в 1998 г. [45–48]. Общим критерием включения в выборку для расчета РИ показателей крови были здоровые лица младше 18 лет. Сыворотка крови, образцы плазмы и цельной крови были получены от 3036 здоровых детей в Дании, Финляндии, Исландии, Норвегии и Швеции. РИ были рассчитаны для 25 показателей сыворотки крови, включая ферменты. Выборка была дифференцирована по возрасту и полу.

Проект COPENHAGEN

В проекте COPENHAGEN (2006–2008 гг.) исследователи анализировали 21 показатель крови на основе 1421 образца крови здоровых детей (596 мальчиков и 825 девочек) в возрасте 5–20 лет [29]. Для расчета РИ использовали методы непараметрической статистики. РИ были получены для обоих полов и шести возрастных групп. Кроме того, было проведено сравнение РИ самой старшей по возрасту группы детей проекта COPENHAGEN с результатами самой младшей группы проекта NORIP. Многие рассчитанные значения РИ были схожи между этими проектами, некоторые различия наблюдались для таких показателей, как щелочная фосфатаза, лактатдегидрогеназа и креатинин. Эти различия вполне закономерны, поскольку данные показатели увеличиваются или уменьшаются с возрастом по мере роста ребенка. Особенность проекта COPENHAGEN заключалась в том, что выборку детей формировали из здоровых школьников без жалоб и отклонений в состоянии здоровья, тогда как в других проектах образцы крови брали у детей, которые находились на амбулаторном лечении. Кроме того, рассчитанные в этом проекте РИ сравнивали между собой с учетом метода измерения.

Проект CHILDx

В США с 2002 г. реализовывали проект CHILDx, в котором педиатрические РИ рассчитывали на основе здоровой когорты детей, в возрасте от 6 месяцев до 17 лет [23–28]. Были определены РИ для целого ряда показателей крови: витаминов, ферментов, гормонов, коагуляционных параметров и маркеров костной ткани. В 2005 г. в проекте CHILDx на основе образцов крови 902 здоровых детей и подростков в возрасте 7–17 лет определяли РИ для показателей свертывающей системы крови (протромбиновое время; частичное тромбопластиновое время; факторы VIII, IX и XI; антиген фактора фон Виллебранда). В итоге обнаружено несколько существенных различий между РИ показателей свертывающей системы крови у детей и взрослых, что еще раз подтверждает необходимость расчета РИ, адаптированных для детей. Например, медиана протромбинового времени детей составила 14,0 с, что почти на 1 с больше, чем среднее значение для взрослых, равное 13,2 с.

Другое исследование CHILDx, проведенное в 2011 г., было посвящено расчету РИ таких показателей крови, как ферменты, преальбумины и мочевая кислота, на основе образцов сыворотки крови 1765 здоровых детей и подростков [25]. Выборка включала разные возрастные группы. Рассчитывали среднее значение, медиану и статистически значимые различия между возрастными и половыми группами (половые различия были определены примерно для 35% показателей). Например, для показателя альдолазы установлены гендерные различия в возрасте 6–8, 12–14 и 15–17 лет. Только уровень фермента амилаза не имел существенных гендерных различий ни в одной из исследованных возрастных групп. Наряду с этим церулоплазмин и мочевая кислота различались между группами детей 12–14 и 15–17 лет. У показателя креатинкиназы выявлены статистически значимые гендерные различия во всех возрастных группах, за исключением группы 6–8 лет.

Проект NHANES

В проекте NHANES, тоже реализованном в США, изучали влияние возраста, пола, индекса массы тела, социальноэкономического статуса и этнической принадлежности на различные параметры здоровья, включая показатели крови. Для него собирали данные лабораторных исследований и опросов, а также набирали тысячи дополнительных участников каждый год [37–44]. Например, в исследовании, опубликованном в 2000 г., рассматривали верхний 95-й процентиль концентрации С-реактивного белка (CRP) в выборке из более чем 22 000 здоровых детей и взрослых с учетом возраста, пола и этнической принадлежности [43]. Женщины, как правило, имели более высокую концентрацию CRP по сравнению с мужчинами. Его уровень был также выше у пожилых людей по сравнению с детьми. Кроме того, в 2004 г. в рамках данного проекта рассчитывали РИ показателей крови на основе 25 000 здоровых людей в возрасте 10–75 лет, разделенных по возрасту, полу и этнической принадлежности [41]. Кроме этого, определяли РИ содержания витаминов и липидного обмена для разных этнических групп.

Проект LOOK

В проведенном в Австралии масштабном исследовании «Образ жизни наших детей» (LOOK) изучали влияние физической активности на здоровье 3528 здоровых детей и подростков. В одном из наиболее значимых исследований, проведенных в рамках этого проекта, на основе выборки из 852 здоровых детей, разделенных по полу и возрасту, были рассчитаны РИ и медианы для 37 показателей крови [36]. Образцы крови собирали у одних и тех же детей в 8, 10 и 12 лет. Среди важных обнаруженных закономерностей были следующие:

• активность фермента щелочной фосфатазы (ЩФ) у девочек выше, чем у мальчиков, в 8 и 10 лет, но к 12 годам у мальчиков она становилась выше;
• активность креатинкиназы у мальчиков выше, чем у девочек, во всех возрастах;
• уровень холестерина выше у девочек, чем у мальчиков, в возрасте 10 и 12 лет, в то время как уровень ЛПВП выше у мальчиков во всех возрастах. Концентрация триглицеридов выше у девочек во всех возрастах;
• уровень уратов значительно выше у мальчиков в возрасте 12 лет;
• уровень ферритина выше у мальчиков, чем у девочек, в возрасте 12 лет (во время забора крови у 50 из 256 девушек была менструация, чем можно объяснить данное различие);
• концентрация глюкозы практически одинакова у мальчиков и девочек и прогрессивно возрастала у обоих полов с возрастом. Концентрация инсулина у девочек выше, чем у мальчиков, и у обоих полов прогрессивно возрастала с возрастом.

В работе LOOK 2012 г. данные 854 детей использовали при расчете РИ для NT-proBNP (N-terminal pro-brain natriuretic peptide B-type, аминотерминальный фрагмент промозгового натрийуретического пептида типа В) в крови [36]. Медиану, доверительные интервалы и РИ рассчитывали в зависимости от пола и для трех возрастных групп (8, 10 и 12 лет). Было показано, что в возрасте 8–12 лет концентрация NT-proBNP у здоровых детей снижается.

Проект AACB

В проекте по адаптации общих РИ, рассчитанных на образцах крови здоровых людей, используемых в больницах Австралии и Новой Зеландии (AACB), 123 лаборатории в 2014 г. представили РИ, используемые каждой лабораторией, а также новые результаты анализов крови с разделением по полу [12, 13]. С помощью этих данных выявляли различия в РИ и аналитических методах, используемых каждой лабораторией. Применяя линейную регрессию, сравнивали результаты расчета верхних и нижних пределов РИ. Группа AACB определяла расположение значений нового образца относительно РИ каждой лаборатории, и его относительное расположение от верхнего и нижнего пределов РИ. Затем результаты сравнивали между лабораториями. Этот проект предоставил ценную информацию об используемых РИ показателей крови в Австралии и Новой Зеландии.

Проект CALIPER

Одним из масштабных проектов по расчету педиатрических РИ показателей крови является проект «Инициатива Канадской лаборатории по педиатрическим референтным интервалам» (CALIPER), который направлен на создание базы данных по педиатрическим РИ для использования в детских центрах на национальном и глобальном уровнях [8, 10, 14, 15–22]. В этом проспективном исследовании у тысяч здоровых детей и подростков рассчитывали дифференцированные по полу и возрасту РИ для многих рутинных и специализированных биохимических маркеров. На начальных этапах проект CALIPER включал 2809 образцов сыворотки и плазмы крови от внешне здоровых и метаболически стабильных детей из амбулаторных клиник. Было проанализировано более 50 показателей крови методами биохимического и иммуноферментного анализа. На основании полученных данных разработаны предварительные РИ в соответствии с CLSI и рекомендациями IFCC C28-A3.

На начальном этапе были установлены РИ для пяти возрастных групп, разделенных по полу. Данный этап послужил основой для дальнейших проектов в рамках CALIPER. Однако, как указано в руководстве CLSI/IFCC C28-A3, для установления РИ выборка должна состоять по меньшей мере из 120 здоровых людей по каждому показателю. В первоначальных пилотных исследованиях CALIPER принимали участие внешне здоровые дети из амбулаторных клиник, но имеющие заболевание, которое могло оказать влияние на показатели крови. Кроме того, выборка была недостаточного объема на один показатель крови. Затем исследователи усовершенствовали места сбора образцов, помимо клиник забор крови стали осуществлять и в общественных центрах, детских садах, церквях и школах. Первое из этих исследований было посвящено установлению РИ по возрастным группам для более чем 40 часто определяемых показателей крови. Этот этап проекта был первым из многих исследований CALIPER, который позволил начать заполнять пробелы в педиатрических РИ для показателей крови, включая маркеры костной ткани, маркеры риска сердечнососудистых заболеваний и метаболизма [8].

Результаты исследования показали, что РИ многих показателей крови различаются в зависимости от возрастных диапазонов. При этом возрастные диапазоны не обязательно коррелируют с общепринятыми возрастными этапами развития. Например, при расчете РИ было выявлено, что для ЩФ требуется разбить выборку на семь возрастных диапазонов (от 0 до 14 дней, от 15 дней до < 1 года, от 1 года до < 10 лет, от 10 до < 13 лет, от 13 до < 15 лет, от 15 до < 17 лет и от 17 до < 19 лет), в то время как для аланинаминотрансферазы (АЛТ) достаточно трех возрастных диапазонов (от 0 ло < 1 года, от 1 года до < 13 лет, от 13 до < 19 лет) [8].

Что касается эндокринных маркеров, то в 2013 г. в рамках проекта CALIPER была собрана выборка здоровых детей и подростков для расчета РИ семи половых гормонов. В этом исследовании были определены РИ половых гормонов, специфичных для конкретной стадии развития по Таннеру (эстрадиол, тестостерон, прогестерон, глобулин, связывающий половые гормоны, пролактин, фолликулостимулирующий гормон и лютеинизирующий гормон). Стадии развития по Таннеру используют для мониторинга полового созревания у детей. Особенно важно иметь РИ для половых гормонов, специфичных для стадии развития по Таннеру, поскольку каждый ребенок вступает в период полового созревания в разном возрасте. Стадии развития по Таннеру основаны на пятиступенчатой шкале, где I ступень соответствует препубертатному развитию, а V ступень — взрослому развитию. Развитие по Таннеру было определено субъективным методом: участникам исследования показывали изображения стадий развития по Таннеру от I до V, и они оценивали свое развитие относительно этих изображений [14].

После расчета РИ половых гормонов были установлены педиатрические РИ для других биохимических маркеров, а также возрастная специфика стероидных гормонов, РИ для витаминов А и Е [15], и витамина D [16]. В дополнение к этим крупным этапам в рамках проекта CALIPER проводили и более мелкие, но практически актуальные исследования. В них анализировали влияние условий замораживания на образцы и стабильность аналитов, суточные колебания в крови концентраций маркеров, и влияние голодания на концентрацию некоторых биомаркеров [17–19].

Для дальнейшего расширения базы данных CALIPER были установлены возрастные и половые РИ для онкомаркеров, биомаркеров метаболических заболеваний, индексов тестостерона и специализированных биохимических маркеров. На сегодняшний день CALIPER создал всеобъемлющую и надежную базу РИ для педиатрии с учетом возраста и пола для более чем 100 показателей крови [20–22].

Рассмотренные проекты по расчету РИ показателей крови у детей и подростков широко изучают концентрации показателей крови в зависимости от возраста и пола. Однако влияние дополнительных параметров, таких как этническая принадлежность, индекс массы тела (ИМТ), объем физической нагрузки и т. д., на концентрацию показателей до сих пор недостаточно изучены.

Еще одной актуальной темой при расчете РИ показателей крови является ожирение в детском возрасте. Необходимо учитывать, как изменяются концентрации веществ в крови в зависимости от ИМТ [51]. Референтная популяция должна состоять из субъектов, репрезентативных для местного населения, но некоторые факторы, например ИМТ, постоянно меняются с течением времени, что усложняет получение репрезентативной выборки. По мере того как средний показатель ИМТ в выборке увеличивается, РИ для показателей крови, зависящих от ИМТ, могут тоже изменяться. Поэтому важно понимать, на какие показатели крови оказывает значительное влияние ИМТ, и являются ли эти изменения физиологическими или имеют клиническое значение, указывая, например, на субклиническое прогрессирование метаболического синдрома [51].

Проект «Референт-20»

Среди проектов по расчету педиатрических РИ показателей крови отметим проект «Референт-20», выполненный в 2020 г. в Федеральном научно-клиническом центре спортивной медицины ФМБА России (ФНКЦСМ ФМБА России). Исследование проводили на многотысячной выборке несовершеннолетних профессиональных спортсменов (2986 мальчиков и 2181 девочек), сформированной на основе результатов углубленного медицинского обследования (УМО) членов спортивных сборных команд России в 2015–2019 гг. на базе клиники ФНКЦСМ ФМБА России [11, 49, 50]. В рамках проекта были рассчитаны РИ для маркеров крови, характеризующих отдельные звенья метаболизма, а также для показателей общего анализа крови, всего 26 показателей.

Спортсмены были разбиты на группы по полу, возрасту (14–15 и 16–17 лет) и спортивным специализациям: циклические (группа «выносливость» (стайеры) и группа «скорость + выносливость» (спринтеры), скоростносиловые (технические виды легкой атлетики), сложнокоординационные, игровые и единоборства. При расчете РИ для анализируемых параметров крови были исключены результаты обследования спортсменов, не допущенных к учебно-тренировочному процессу в результате прохождения УМО по уровню функциональных возможностей организма и состоянию здоровья [11, 49].

После формирования выборки с учетом всех критериев исключения проводили проверку типа распределения данных, исключали статистические выбросы и рассчитывали РИ изучаемых в рамках УМО биохимических маркеров крови. Учитывая отсутствие нормального распределения по целому ряду изучаемых показателей крови, для построения соответствующих РИ использовали центильный метод, относящийся к непараметрическим методам [11, 49].

В результате сравнения РИ для некоторых показателей крови, например, маркеров переносимости физических нагрузок, рассчитанных на выборке несовершеннолетних спортсменов, с РИ этих же показателей, полученных в рамках зарубежных педиатрических проектов, мы пришли к выводу о различиях как в ширине самого референтного диапазона, так и в его максимальных и минимальных значениях [11]. Например, при сравнении РИ содержания креатинина в крови, рассчитанных на выборке несовершеннолетних спортсменов (РИ sport) с РИ, рассчитанными в рамках проектов Caliper/Norip, было обнаружено, что в выборке спортсменов мальчиков 14–15 лет максимальные значения РИ для этого показателя на 30% больше, чем РИ Caliper/Norip-мальчиков, тогда как в 16–17-летнем возрасте они практически идентичны. В выборке спортсменок 14–15 лет максимальные значения РИ содержания креатинина больше на 13%, а в 16–17-летнем возрасте — на 16%, чем РИ Caliper\Norip. В спорте содержание креатинина в крови также используют как маркер переносимости физических нагрузок. Увеличение максимальных значений РИ содержания креатинина у несовершеннолетних спортсменов по сравнению с обычными подростками может быть обусловлено значительными физическими нагрузками и повышенным потреблением белковой пищи [11]. 

В данном проекте было также показано, что максимальные и минимальные значения РИ для кортизола, рассчитанные на выборке несовершеннолетних спортсменов, выше на 58–67%, чем у нетренированных детей. Причем у мальчиков и девочек, занимающихся спортом, одного возраста рассчитанные РИ кортизола схожи. Если сравнивать рассчитанные РИ для кортизола в проекте «Референт-20» и в проекте Caliper/Norip, то можно отметить следующее: у мальчиков 14–15 лет, занимающихся спортом, максимальные значения РИ для кортизола на 64,7% больше по сравнению с максимальными значениями РИ для кортизола у мальчиков в проекте Caliper/Norip, а в возрасте 16–17 лет максимальные значения РИ для кортизола больше на 67,2%. У девочек 14–15 лет, занимающихся спортом, максимальные значения РИ кортизола на 64,8% больше по сравнению с максимальными значениями РИ для кортизола у девочек в проекте Caliper/Norip, а в возрасте 16–17 лет — на 66,7%. Полученные данные о более высоких максимальных значениях РИ для кортизола у несовершеннолетних спортсменов могут быть обусловлены уровнем стресса, который они испытывают при занятиях профессиональным спортом [11]. 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, анализ мировой и отечественной литературы свидетельствует о том, что в последние годы предприняты весьма успешные попытки по установлению РИ для показателей крови в популяции несовершеннолетних детей и подростков. Однако остается открытым вопрос по расчету педиатрических РИ для показателей крови у отдельных когорт детей, например, спортсменов или детей из различных этнических групп или детей с разным ИМТ. Необходимы дальнейшие исследования по определению РИ для маркеров крови несовершеннолетних спортсменов с учетом не только их пола и возраста, но и специфики спортивной нагрузки, профессионального стажа и спортивной результативности.

Данные, полученные в результате этих исследований, помогут врачам по спортивной медицине своевременно планировать и проводить коррекционные мероприятия по оптимизации функционального состояния.