Ионы металлов играют важную роль в обменных процессах живых систем, от переноса электронов и реакций биокатализа до формирования третичной структуры металлопротеинов, определяющей их биологическую активность. Нарушение гомеостаза эссенциальных металлов ассоциировано с функциональными нарушениями и тяжелыми патологическими состояниями. Известно, что превышение физиологичных уровней Fe, Mn, Cu, Zn вызывает проявления нейротоксичности, избыток Zn и Cu провоцирует токсическое поражение почек и печени, сердечно-сосудистой системы, желудочно-кишечного тракта, угнетение функции иммунной и центральной нервной систем [1]. Значительное количество металлов обнаруживают в бляшках, тельцах Леви и включениях в цитоплазму клеток при нейродегенеративных заболеваниях (болезни Альцгеймера, Паркинсона и др.), а также при боковом амиотрофическом склерозе [2]. При этом ионы Zn обладают и антиатерогенными свойствами [3]. Дефицит эссенциальных металлов тоже оказывает негативное влияние на организм, в частности ионы Zn незаменимы для реализации функций ферментов (алкогольдегидрогеназы, щелочной фосфатазы, карбоангидразы, лейцинаминопептидазы и супероксиддисмутазы), дефицит Zn провоцирует развитие дерматозов, анорексии, задержек роста, наблюдается при плохом заживлении ран и нарушениях репродуктивной функции [1]. Роль металлов с переменной валентностью может быть и позитивной и негативной — ионы Mn способствуют генерации гидроксильного радикала и одновременно являются кофакторами ферментов антиоксидантной защиты при развитии атеросклеротических процессов [3]. 

Крайне важно учитывать реакции металлов друг с другом, в том числе в составе органических соединений, ферментов и белков, при оценке их воздействия на организм. В частности, Pb, Hg, Cd высокотоксичны и вызывают тяжелые интоксикации при попадании в организм [4], селеноорганические соединения демонстрируют антиоксидантную и антитоксическую активность при отравлении солями тяжелых металлов [5]. В целом около трети белков сыворотки крови содержат ионы металлов в своем составе [2]. Наибольший интерес представляет изучение металлопротеинов с регуляторными и транспортными функциями, способных оказывать опосредованное воздействие на целый ряд органов и систем организма за счет изменений ионного состава. В частности, альфа-2-макроглобулин (а2-МГ) человека содержит в своей структуре четыре иона Zn. При этом концентрация данного белка достаточно высока (2–3 г/л), а функции разнообразны: ингибирование протеиназ широкого профиля; транспортирование и регуляция синтеза цитокинов, гормонов и фактора роста; регуляция апоптоза клеток, синаптогенеза, роста и пролиферации нейронов; регуляция концентрации дофамина в дофаминэргических нейронах и синтеза ацетилхолинтрансферазы [6].

При изучении роли ионов металлов в физиологических процессах немаловажно учитывать их распределение в тканях и биожидкостях. В частности, ионы Ag, Ca, Cu, In, Li, Na, Se, Si, Sr обнаруживают преимущественно в плазме крови человека, а Fe, K, Mn, Ni, V, Zn — в кровяных тельцах. С увеличением ионного радиуса распределение тяжелых металлов смещается из клеток в плазму крови, а распределение щелочных металлов — наоборот, в клетки [7]. Соответственно, для изучения общего содержания металлов в организме предпочтительно использовать метод масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС), позволяющий определять значительное количество металлов, в том числе в минорных концентрациях. Однако для изучения взаимодействия с белками необходимо применять другие методы: кристаллографию, ядерный магнитный резонанс, электронный парамагнитный резонанс, методики с применением флуоресценции, спектрометрические методы, а также поверхностный плазмонный резонанс [2]. Подавляющее большинство вышеперечисленных методов связано с частичной или полной денатурацией белка и малоприменимо для анализа смесей, что осложняет получение объективных научных данных о процессах, происходящих в живом организме. Перспективными представляются менее чувствительные, но более щадящие методы с хорошим потенциалом сравнительной визуализации результатов, например, варианты метода перекрестного иммуноэлектрофореза.

Целью исследования было сравнить возможности связывания различных ионов металлов с белками сыворотки крови человека.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали сливную сыворотку крови (от 40 практически здоровых доноров обоего пола 20–40 лет для выявления всех возможных взаимодействий) и сливную плазму крови здоровых доноров.

Высокоочищенные препараты а2-МГ были получены из плазмы крови сочетанием дробного осаждения ПЭГ-6000, анионообменной хроматографии и цинк-хелатной хроматографии [8].

Поликлональные кроличьи антисыворотки против всех белков крови человека и против а2-МГ человека были получены путем внутрикожной иммунизации двух групп кроликов (сывороткой крови и высокоочищенным препаратом а2-МГ соответственно).

Для изучения возможности связывания белков сыворотки крови человека с ионами металлов использовали перекрестный вариант иммуноэлектрофореза с адсорбцией in situ во втором направлении. Горизонтальный иммуноэлектрофорез осуществляли в пластинах агарозного геля на стеклянной подложке. Для этого использовали агарозу типа 1 (Sigma; США) в виде 1%-го золя в трис-трициновом буфере рН 8,6 [9]. В сформированном слое геля толщиной 1 мм вырезали круглые лунки, в них вносили по 5 мкл сыворотки крови или препарата а2-МГ. Электрофорез в первом направлении проводили в течение 1 ч при 200 В. После этого гель разрезали на полосы шириной 10 мм, которые перемещали на край стеклянных пластин-подложек. Свободное пространство заливали 1%-м золем агарозы.

После образования геля вырезали карман шириной 0,5 см, отступив около 2 мм от границы с гелем первого направления электрофореза. Освобожденный от агарозы карман заполняли гелем с иммобилизованными на сорбенте эссенциальными, условно-эссенциальными и токсичными металлами из состава солей (табл. 1).

Для получения геля образец имминодиуксуснокислой (ИДК) агарозы (Sigma; США) помещали в хроматографическую колонку и последовательно промывали десятью объемами следующих препаратов: 1) 0,05 М динатриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты; 2) бидистилированной водой; 3) 0,05 М водного раствора тестируемого металла; 4) бидистилированной водой; 5) трис-трициновым буфером рН 8,6.

После заполнения кармана гелем с иммобилизованным металлом агарозный гель над ним обрезали на расстоянии 2 мм от края кармана и заполняли освободившееся пространство 1%-м золем агарозы, содержащей 5% соответствующей антисыворотки. Иммуноэлектрофорез во втором направлении проводили в течение 18 ч при 100 В. По завершении электрофореза пластины геля отмывали 24 ч 0,1 М раствором NaCl, высушивали и окрашивали кумаси бриллиантовым синим R-250.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Согласно полученным данным, при изучении образца сливной сыворотки здоровых доноров (рис. 1) белки крови связываются не только с эссенциальными, но и с токсичными металлами в составе промежуточного геля с соответствующим уменьшением площади преципитата на электрофореграмме.

В частности, активное связывание многих белков сыворотки крови отмечено при наличии не только ионов Zn²⁺ и Cu²⁺, а также Cd²⁺, но и Hg⁺ в составе промежуточного геля.

Умеренное связывание с белками сыворотки крови обнаружено в электрофореграммах, содержащих не только Sr²⁺ и Pb²⁺, но и Ba²⁺ в составе промежуточного геля. При этом Sr²⁺ активно связывался с гликопротеинами сыворотки крови.

Отмечен слабовыраженный аффинитет отдельных белков сыворотки крови не только к ионам Fe³⁺, Mn²⁺, но и к ионам Ag⁺. Продемонстрировано слабовыраженное связывание отдельных белков с ионами Ca²⁺ и Bi²⁺.

Выявлена низкая активность связывания ионов Mg²⁺ с гамма-глобулинами. Отдельные белки слабо взаимодействовали с ионами Co²⁺. При оценке взаимодействия с ионами Cr³⁺ реакция практически отсутствовала.

При изучении возможности связывания молекул а2-МГ в составе высокоочищенного монопрепарата с ионами металлов (рис. 2) выявлено, что данный металлопротеин, являющийся также гликопротеином, активно взаимодействует не только с Zn²⁺ в составе промежуточного геля, но и с ионами Cd²⁺ (зафиксировано уменьшение высоты пика более чем на 50% от исходного уровня). В случае включения не только ионов Fe³⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Mg²⁺, но и Pb²⁺, Sr²⁺, а также Ag⁺ в промежуточный гель, высота пика составляла 50–60% от высоты пика на электрофореграме в контрольном образце.

При включении иммобилизованных ионов Cu²⁺, а также Hg⁺, Ba²⁺, Bi²⁺, уменьшение высоты пика на электрофореграмме составляло 40% и более, что свидетельствует о достаточно активном взаимодействии данных металлов с молекулой а2-МГ в условиях in vitro.

При включении в промежуточный гель ионов Cr³⁺ и Co²⁺ связывание с а2-МГ было минимальным, уменьшение высоты пика составляло не более 10% в сравнении с контрольным образцом.

Полуколичественные данные по активности связывания белков крови и а2-МГ с ионами металлов в составе промежуточного геля представлены в табл. 2.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведенное исследование продемонстрировало, что белки сыворотки крови могут связываться с иммобилизованными металлами, даже если не являются металлопротеинами.

Принципиальная возможность связывания белков без образования металлхелатных связей известна, однако ранее методом сочетания гельфильтрационной хроматографии в сочетании с атомноэмиссионной спектрометрией с индуктивно связанной плазмой (АСП-МС) было идентифицировано только связывание с эссенциальными металлами — два белка взаимодействовали с цинком (альфа-2-макроглобулин и альбумин), два белка связывались с железом (ферритин и трансферрин) и четыре белка связывались с медью (церулоплазмин, альбумин, фактор V, транскупреин) [10]. По результатам других авторов, сочетание аффинной хроматографии (иммобилизованный металл в составе сорбента) и ЖХ-МС/МС позволило продемонстрировать, что С3 компонент комплемента, а2-МГ, отдельные изоформы альбумина, аполипопротеины, церулоплазмин, серотрансферрин, кератин, γ-глобулины могут взаимодействовать не только с эссенциальными Cu²⁺, Zn²⁺, но и с условно-эссенциальными Cd²⁺, Pb²⁺  [1, 11].

Согласно полученным нами данным, спектр белков крови, способных взаимодействовать с ионами металлов, еще шире и включает взаимодействие с макроэлементами (Ca²⁺, Mg²⁺) и токсичными микроэлементами (Ag⁺, Hg⁺, Ba²⁺, Bi²⁺).

Безусловно, результаты исследования in vitro требуют дополнительного подтверждения в условиях in vivo, однако можно предположить, что токсичность металлов может реализовываться и через конкурентные взаимодействия с эссенциальными металлами в составе белков, и через образование связей металл–металл, не отличающихся большой прочностью, но способных, как и в случае вытеснения эссенциального микроэлемента по конкурентному типу, негативно повлиять на конформационную структуру белка, его сродство к рецепторам и лигандам. Механизмы и биологические последствия подобных реакций при острой и хронической интоксикации металлами требуют дальнейшего изучения.

Согласно полученным результатам, высоким аффинитетом (на известном уровне допущений, с учетом выявленных взаимодействий и ныне известных свойств) к широкому спектру белков сыворотки обладают не только ионы эссенциальных микроэлементов (Cu²⁺, Zn²⁺), как подробно описано ранее при изучении белковой фракции γ-глобулинов человека и оппозитных эффектов меди и цинка [11] и относимого к условноэссенциальным Cd²⁺, но и ионы Hg⁺. Известно, что многие соединения кадмия токсичны. Важнейшими мишенями для Cd²⁺ являются тиоловые группы (–SH) цистеинов, присутствующих в белках, кадмий может подавлять активность многих митохондриальных ферментов [12]. Можно предположить, что при возникновении конкурентных или других взаимодействий ионов кадмия с регуляторными и транспортными металлопротеинами или ферментами, содержащими ионы Zn²⁺ и особенно менее реакционноспособные ионы Fe³⁺ Cu²⁺, Mg²⁺ в своей структуре, могут существенно изменять свойства белков, блокировать исходные функции и даже проявлять новые свойства (например, иммуногенность). Не зря при лечении отравлений кадмием в числе прочего рекомендовано введение альбумина, также являющегося цинк-содержащим металлопротеином.

Токсичность ртути общеизвестна. В числе прочего, она конкурирует за сайты связывания металлов (цинка, меди и других) в составе металлопротеинов, подавляя их активность, а также активно и высокоаффинно взаимодействует с тиоловыми, карбоксильными и другими ферментами (АТФазой, холинэстеразой, щелочной фосфатазой, глутатионпероксидазой, глутаминсинтетазой и др.) [5, 13]. Наши результаты демонстрируют, что ионы ртути способны взаимодействовать и с другими белками. Биологические последствия подобных взаимодействий требуют дальнейшего изучения.

Обращает также на себя внимание достаточно высокая реакционноспособность ионов бария и свинца по отношению к различным белкам сыворотки крови человека. Несмотря на то что свинец относят к условно-эссенциальным микроэлементам, значительная часть его соединений (особенно воднорастворимых) токсична. Известно, что механизм токсического действия свинца связан с блокированием тиоловых ферментов взаимодействием с карбоксильными и фосфатными группами биополимеров, инактивацией эстераз [14]. Полученные нами результаты наглядно продемонстрировали наличие подобных взаимодействий с белками крови человека.

Несмотря на то что медь является эссенциальным микроэлементом, избыток и депривация меди имеют крайне неблагоприятные последствия для организма, с нарушениями гомеостаза меди связан патогенез различных нейродегенеративных заболеваний [4]. Ранее продемонстрировано, что Cu²⁺ обладает свойствами редоксактивного металла, реализующего мощный окислительный потенциал в биологических системах. Хелатирование Cu²⁺ может вызывать частичное расщепление боковых аминокислотных радикалов, сахаров и сиаловых кислот на поверхности макромолекулы, а также деструктурирование пространственной упаковки поверхностного слоя, включая антигенные детерминанты [11]. Выявленный широкий спектр белков, взаимодействующих с ионами меди, обосновывает необходимость их дальнейшей идентификации для уточнения их возможной роли в патогенезе различных заболеваний.

В качестве «модельного» белка для сравнительной оценки возможности связывания с ионами металлов был выбран а2-МГ. В работе использовали нативную форму белка, полученную щадящими методами препаративной хроматографии низкого давления, что приближает полученные результаты к реальным процессам, происходящим в организме человека.

Наиболее активное взаимодействие можно наблюдать между а2-МГ с ионами Zn²⁺ и Cd²⁺. Этот результат совпадает с результатами об образовании взаимосвязей а2-МГ с Cd²⁺, Zn²⁺ и, в меньшей степени, с Ni²⁺ и Pb²⁺, полученными ранее другими методами [1]. Известно, что цинк является структурообразующим компонентом а2-МГ, каждая из четырех субъединиц а2-МГ включает в себя один ион цинка. Ранее установлено, что кадмий, взаимодействуя с цинком в составе а2-МГ, разрушает хелатную связь между полумолекулами, белок разделяется надвое и лишается большей части регуляторных функций. Поскольку а2-МГ задействован в регуляции цитокинового профиля, липидного обмена, ингибировании широкого спектра протеиназ, проведении сигнала по нервной системе, воспалительных и аутоиммунных реакциях организма [6], интоксикация кадмием может приводить к массированному срыву регуляторных процессов, осуществляемых данным белком, а наличие такого взаимодействия, в свою очередь, объясняет некоторые механизмы токсичности кадмия.

Более того, нарушения метаболизма цинка играют ключевую роль в механизмах старения, отдельные авторы рекомендуют использование цинка как добавки к пище для увеличения продолжительности жизни [15]. Очевидно, что конкурирующий за связывание с а2-МГ кадмий оказывает прямо противоположный эффект. В отличие от ионов цинка в составе белков, избыточная концентрация свободного цинка в крови оказывает нейротоксическое действие [4], что может быть одним из компонентов ускоренного старения организма при хронической интоксикации металлами, а также одним из компонентов патогенеза сенильной деменции.

Немаловажно и выявленное взаимодействие а2-МГ со свинцом. Ранее показано, что свинец способен взаимодействовать с активными центрами ряда ферментов (АТФазы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, щелочной фосфатазы и др.) [16]. Известно, что а2-МГ является универсальным ингибитором протеиназ, однако в данном случае мы наблюдаем не опосредованное, а прямое воздействие Pb²⁺ на данный ингибитор ферментов. Можно предположить, что при интоксикации свинцом в крови циркулируют не только фосфаты и альбуминаты свинца [14], но и его комплексы с а2-МГ. Учитывая гепатотоксичность свинца, негативное влияние на а2-МГ идет с двух сторон: гибель синтезирующих а2-МГ гепатоцитов и блокирование функций самого а2-МГ за счет взаимодействия с ионами свинца.

Выявленная способность а2-МГ взаимодействовать с ионами марганца также может негативно влиять на функции данного регуляторно-транспортного белка. Известно, что избыток марганца нарушает каталитические свойства ферментов, восстановленная форма (Мn³⁺) способствует развитию окислительного стресса [17]. В данном случае негативное воздействие этого эссенциального микроэлемента на а2-МГ может быть реализовано при помощи двух механизмов — как изменение функций самого белка за счет конкурентного взаимодействия, с вытеснением цинка, так и повреждение молекулы а2-МГ супероксидными радикалами. Известно, что у «окисленной» формы а2-МГ нарушена способность к утилизации (снижено сродство к рецепторам) [6] и она становится потенциально иммуногенной за счет изменения конформации.

О влиянии дисбаланса микроэлементов на физиологические и патологические процессы, реализуемые при участии регуляторно-транспортных белков, косвенно свидетельствует и описанное ранее усиление ингибирования в крови активированного протеина С (APC) с участием a2-MГ под воздействием ионов двухвалентных металлов (Zn, Mn, Cu) [18]. Согласно полученным результатам, причиной данного феномена может быть прямое воздействие эссенциальных микроэлементов на а2-МГ и его функции в организме.

Выявленная способность а2-МГ достаточно активно взаимодействовать с макроэлементами (магнием, кальцием, железом) требует дополнительного изучения влияния образования подобных связей на физиологические и патологические процессы.

Обращает на себя внимание тот факт, что значительная часть клинических проявлений при острой интоксикации металлами проявляется, пусть и в менее выраженной форме, у многих условно здоровых жителей крупных промышленных городов (нарушения проводимости и чувствительности конечностей, частые головные боли и хроническая слабость, повышение количества граждан с когнитивными расстройствами и признаками ранней деменции, расстройства функции печени и др.). Полученные результаты указывают на возможность влияния выявленных взаимодействий токсичных и эссенциальных металлов с регуляторными и транспортными белками в развитии функциональных расстройств и патологических процессов.

ВЫВОДЫ

Значительная часть белков сыворотки крови человека, в том числе не являющихся металлопротеинами, взаимодействует с ионами металлов в эксперименте in vitro. Высокая активность взаимодействия белков с условно-эссенциальным кадмием и токсичной ртутью свидетельствует о возможности реализации патогенетических механизмов интоксикации данными металлами через нарушение структуры и функции белков крови. Взаимодействие металлопротеина а2-МГ с условно-эссенциальными и токсичными металлами, выявленное in vitro, в условиях in vivo может проходить по типу конкурентного взаимодействия металл–металл и оказывать негативное влияние на структуру и функции данного регуляторно-транспортного белка. Механизмы взаимодействия и обратимость связывания белков с металлами в условиях in vivo требуют дополнительного изучения.