Более 70 лет назад на ПО «Маяк» произошло несколько аварийных ситуаций, в ходе которых более 100 000 жителей Южного Урала подверглись хроническому облучению. На протяжении нескольких десятилетий специалисты ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА РФ проводят наблюдения за состоянием здоровья, изучают эффекты от воздействия ионизирующего излучения на органы и ткани облученных людей, а также оказывают медицинскую и психологическую помощь пострадавшим и их потомкам. Особенность облучения жителей прибрежных сел реки Теча заключалась в том, что воздействие было сочетанным. Внутреннее облучение действовало при поступлении радионуклидов с пищей и водой (в основном ^89,90Sr), внешнее — γ-облучение воздействовало от поверхности речной воды, куда осуществляли сбросы жидких радиоактивных отходов с ПО «Маяк». Важно отметить, что стронций, являясь аналогом кальция, заменяет его в костной ткани, и подвергает клетки костного мозга β-облучению, оказывая влияние на гемопоэз и иммунитет облученного человека. Этот тезис подтверждают результаты иммунологических, клинических, цитогенетических, эпидемиологических исследований населения прибрежных сел реки Теча, изложенные в научной литературе [1]. 

В последние десятилетия происходит естественное старение когорты жителей прибрежных сел реки Теча, что делает возможным начать исследование вопроса о влиянии хронического облучения на старение человека. Изучение механизмов старения — современная научная проблема для ученых и медицинских работников всего мира. Перед специалистами стоит задача сохранить качество жизни пожилого человека, а при увеличении продолжительности жизни, которую можно наблюдать сегодня в развитых странах, сделать возможным полноценное участие старшего поколения в жизни общества [2].

Помимо изучения естественных механизмов старения организма на всех уровнях (клеточном, тканевом, органном и т. д.) важно исследовать влияние неблагоприятных факторов, которые могут ускорять процессы, приводящие к старению, или запускать его механизмы раньше по времени. В этом случае можно говорить о преждевременном (неестественном) старении изучаемых систем или организма в целом [3]. Отсюда актуальным научным вопросом является изучение способности ионизирующей радиации влиять на преждевременное старение биологических систем, поскольку этот фактор присутствует в современной цивилизации.

Обменные хромосомные аберрации (дицентрические и кольцевые хромосомы) являются общепринятым маркером клеточного старения и характеризуют процессы, связанные с нестабильностью генома человека [4, 5]. Обмены между разными хромосомами образуются в результате двухцепочечных разрывов ДНК (реже в результате одноцепочечных разрывов) и вследствие их неправильной репарации. В клетке в среднем за сутки происходит около 8,8 двухцепочечных и 55 000 одноцепочечных разрывов ДНК [2]. С возрастом эффективность репарации таких разрывов и/или элиминации клеток с нерепарированными повреждениями ДНК снижается, что приводит к увеличению частоты хромосомных аберраций.

В биодозиметрических исследованиях повышенная частота дицентриков и колец в клетках является маркером воздействия ионизирующей радиации. Хорошо изучены зависимости доза–эффект для рентгеновского, гамма- и других видов облучения, что позволяет на основе частоты нестабильных хромосомных аберрраций (НХА) оценить дозу облучения человека, если после инцидента прошло несколько месяцев. В отдаленные сроки повышенная частота НХА служит биомаркером действия ионизирующей радиации [6].

Цитогенетическое исследование стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) Т-лимфоцитов периферической крови у облученных жителей Южного Урала началось более 40 лет назад [7, 8]. За весь период наблюдения у лиц, подвергшихся хроническому облучению, отмечали достоверно повышенные уровни НХА по сравнению с лицами, не подвергавшимися аварийному облучению. Однако при исследовании динамики частоты НХА было отмечено снижение частоты аберраций в два раза (через 25 лет и 50 лет с начала облучения) [9]. Подобные результаты объясняются элиминацией клеток с нестабильными аберрациями в ходе митоза из-за нарушения сегрегации хромосом в дочерние клетки. Наличие нестабильных перестроек свидетельствует о том, что клетка с аберрацией вступила в первый митоз в культуре в условиях in vitro, либо она является дочерней от клетки-предшественницы. Так, было показано, что во втором митозе частота клеток с дицентриками снижалась на 50%, а в третьем митозе, несмотря на снижение на 70%, клетки с такими аберрациями все-таки присутствовали [10]. Примечательно, что высокие шансы проходить клеточный цикл имели дицентрики с близкорасположенными двумя центромерами.

В ходе многочисленных радиобиологических исследований выяснилось, что частота обменных аберраций хромосом коррелирует с возрастом человека. У новорожденных детей дицентрических хромосом в ФГА стимулированных Т-клетках не выявлено, а затем с возрастом у обследованных количество клеток с подобными нарушениями возрастало [11]. Отмечен рост частоты НХА при разбиении возраста обследованных лиц на 10-летние интервалы [12]. Таким образом, повышенная частота НХА является маркером воздействия ионизирующей радиации и маркером клеточного старения [13]. Исходя из вышесказанного можно предположить, что при облучении человека действие ионизирующей радиацией будет приводить к образованию дополнительных хромосомных аберраций в клетках. Следовательно, увеличение частоты хромосомных повреждений у облученных лиц по сравнению с необлученными людьми того же возраста будет свидетельствовать о преждевременном старении клеток в условиях действия радиации.

Цель представленного исследования состояла в изучении влияния ионизирующей радиации на преждевременное старение Т-лимфоцитов периферической крови человека, на основе частоты НХА, в условиях, когда критической системой при хроническом облучении был красный костный мозг.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Дизайн исследования

На основе базы данных УНПЦ РМ, включающей цитогенетические результаты на 800 облученных лиц (дозы на ККМ от 0,001 Гр до 4,1 Гр, возраст от 40 лет до 89 лет) и 100 человек, аварийному облучению не подвергавшихся, сформировать одинаковые разновозрастные подгруппы среди облученных и необлученных лиц, проанализировать частоту хромосомных аберраций в каждой возрастной подгруппе и сравнить показатели между собой. Оценить возрастную динамику хромосомных аберраций в возрастных подгруппах у облученных и необлученных лиц. На основании полученных результатов сделать вывод о влиянии хронического облучения, которому подверглись жители Южного Урала, на преждевременное клеточное старение Т-клеток в отдаленные сроки от начала воздействия.

Характеристика обследованных людей

Комбинированное облучение жителей прибрежных сел реки Теча началось в результате загрязнения речной системы радиоактивными сбросами с ПО «Маяк» в 1950 гг. Источниками внешнего γ-облучения являлись загрязненные радионуклидами донные отложения и пойменные почвы. Источниками внутреннего β-облучения являлись радионуклиды, поступавшие в организм с речной водой и продуктами питания местного производства. Дозы внутреннего облучения оценивали на основе данных измерений содержания радионуклидов 89,90Sr в теле облученных лиц, дозы внешнего облучения были рассчитаны на основе учета режимов поведения возрастных групп населения на загрязненных территориях. В работе были использованы дозы облучения на красный костный мозг (ККМ), рассчитанные специалистами биофизической лаборатории ФГБУН УНПЦ РМ ФМБА России на основе системы TRDS-2016 [14].

Цитогенетическое исследование жителей, подвергшихся хроническому облучению, продолжается в настоящее время и база цитогенетических данных пополняется регулярно. Критерии включения: жители Южного Урала (облученные и не облученные); отсутствие в анамнезе аутоиммунных, онкологических, хронических воспалительных заболеваний в фазе обострения; для облученного человека обязательно наличие рассчитанной кумулятивной дозы облучения (индивидуальной от внутреннего β-облучения и индивидуализированной от внешнего γ–облучения) [14]. Критерии исключения: наличие в анамнезе рентгенологического обследования менее чем за 6 месяцев до момента забора образцов крови. Люди, проживавшие на чистых территориях и включенные в группу сравнения, также должны были соответствовать вышеперечисленным критериям.

Поскольку рассчитанные дозы облучения имеют существенную неопределенность (30–60%), для исследования было решено сформировать выборку из облученных людей, имеющих дозы на ККМ от 0,5 до 2,5 Гр. Возраст обследованных людей располагался в ряду от 40 до 79 лет включительно. Таким образом, итоговая выборка лиц, подвергшихся облучению состояла из 343 человек (138 мужчин и 205 женщин), и 83 человек, не подвергавшихся аварийному облучению. Внутри каждой группы (облученные и необлученные) были сформированы три возрастные подгруппы — 40–59 лет, 60–69 лет и старшая подгруппа — 70–79 лет. Принципиально важно подчеркнуть, что дозы на ККМ у облученных лиц в возрастных подгруппах достоверно не различались. Распределение доноров по разновозрастным группам представлено в табл. 1.

Среди облученных лиц 38 человек проходили цитогенетическое обследование несколько раз. Когда мы провели их распределение по трем возрастным подгруппам, то обнаружили только 15 человек, для кого можно было оценивать показатели в динамике в разных возрастных подгруппах (остальные 23 человека обследовались несколько раз в одной и той же возрастной подгруппе). При этом семь человек в разных возрастных периодах имели нулевые значения частоты хромосомных аберраций, мы не включили их в анализ динамики показателей. Таким образом, динамику частоты НХА возможно было представить только для восьми человек. И поскольку всех их обследовали в разных возрастных подгруппах, в табл. 2 указан не конкретный возрастной период, а использованы обобщенные названия — «ранний» и «поздний» возрастные периоды.

Приготовление и анализ препаратов хромосом

Цитогенетические препараты из ФГА стимулированных Т-лимфоцитов периферической крови доноров получали согласно протоколу, принятому в лаборатории радиационной генетики ФГБУН УНПЦ РМ, который включает в себя четыре последовательных этапа: культивирование клеток до стадии метафазы (52 ч, за 3 ч вводили колцемид в итоговой концентрации 0,1 мг/мл), гипотоническую обработку метафазных клеток (за 1 ч до фиксации), фиксацию метафазных пластинок (свежеприготовленный фиксатор: 3 части этанола и 1 часть ледяной уксусной кислоты) и приготовление препаратов хромосом. Метафазные хромосомы окрашивали 2%-м раствором Гимза в течение 10 мин, затем краску смывали и стекла сушили при комнатной температуре [7, 8].

Анализ препаратов осуществляли при световой микроскопии, без кариотипирования на микроскопах AxioImager A2, Z2. В анализ включали клетки с 46 хромосомами с 1–2 наложениями, отмечали дицентрические и кольцевые хромосомы, ацентрические кольца. У каждого обследуемого человека анализировали 100–500 клеток.

Статистические методы

Для обработки полученных результатов использовали методы вариационной статистики с вычислением медианы и 25-го и 75-го процентилей, а также среднего на 100 клеток (если значения процентилей были равны 0, то их в таблице данных не отражали). Проверку нормальности распределения проводили с помощью критерия Колмогорова–Смирнова. Поскольку полученные нами данные чаще имели ненормальное распределение, сравнение значений в группах осуществляли с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Индивидуальные показатели обменных аберраций в динамике оценивали по критерию χ². Статистическую обработку полученных результатов проводили при помощи пакета прикладных программ STATISTICA, версия 10.0 (StatSoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При сравнении показателей между всеми облученными и всеми необлученными лицами выявили достоверное превышение клеток с обменными НХА у облученных лиц (р = 0,04). Однако линейной корреляционной зависимости исследуемых показателей от дозы облучения ККМ в объединенной группе облученных лиц выявлено не было (R = 0,125; p = 0,005).

Результаты исследования зависимости частоты хромосомных аберраций в разновозрастных подгруппах представлены в табл. 1.

Необходимо отметить, что НХА обменного типа относятся к редким событиям. Во всех без исключения подгруппах медиана была равна нулю. Именно по этой причине в табл. 1 представлена средняя величина. Отсутствие диапазона 25 и 75 процентилей также обозначает нулевые показатели. В группе сравнения с увеличением возраста происходит рост исследуемого показателя (0, 0,18 и 0,30 на 100 клеток). Частота хромосомных аберраций у необлученных лиц в обеих старших возрастных подгруппах достоверно увеличена при сравнении с подгруппой «40–59 лет» (р¹ = 0,06, р² = 0,02). Несмотря на рост частоты обменов в старшей подгруппе «70–79 лет», различия с подгруппой «60–69 лет» были недостоверны.

Что касается частоты хромосомных аберраций в разновозрастных подгруппах у облученных лиц, то с возрастом увеличения исследуемого показателя не отметили. Напротив, показатели были одинаковыми во всех трех возрастных подгруппах (р¹ = 0,69, р² = 0,37), что подтвердило и отсутствие линейной корреляции частоты хромосомных аберраций с возрастом (R = 0,002, p = 0,76).

При сравнении частот обменных аберраций между необлученными и облученными лицами в возрастных подгруппах было выявлено достоверное увеличение показателя у облученных лиц в возрасте 40–59 лет (р = 0,038). У облученных лиц в возрасте 60–69 лет клетки с хромосомными аберрациями были отмечены чаще, но различия не достоверны. У самых старших доноров различий в цитогенетических показателях между облученными и необлученными лицами не отмечено.

Анализ изучения динамики индивидуальных показателей частоты нестабильных обменов для восьми облученных человек представлен в табл. 2.

У пяти из восьми обследованных с возрастом увеличилась частота клеток с хромосомными аберрациями, но различия были недостоверны. Однако обращает на себя внимание тот факт, что медиана частоты НХА увеличивалась с возрастом в группе «ранний» показатель от 0,375 до 0,775 в группе «поздний» показатель, при этом доза облучения на ККМ у человека существенно не менялась (вторая цифра после запятой).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изучение механизмов старения человека — актуальная научная проблема в связи с изменением на планете возрастного баланса в сторону увеличения численности пожилых людей (к 2050 г. лиц старше 65 лет будет около 1,6 млрд человек) [15]. В понимании основ программы старения организма играет роль изучение механизмов этого процесса с учетом влияния факторов окружающей среды. Для этого необходимо определить надежный набор инструментов — маркеров, методов, подходов, что в итоге сформирует методологию для подобных исследований. Поскольку живой организм — многоуровневая система, процессы и эффекты старения изучают на нескольких уровнях — субклеточном, клеточном, тканевом, органном, организменном [16].

Для исследования вопроса о возможном влиянии ионизирующей радиации на преждевременное старение клеток человека мы выбрали цитогенетический метод, который позволяет оценить состояние хромосомной ДНК. Предметом исследования служили нестабильные обменные хромосомные аберрации в ФГА стимулированных Т-лимфоцитах периферической крови. Выбор объекта исследований был неслучайным, так как предшественники Т-клеток помимо γ-облучения подвергались еще облучению остеотропными радионуклидами ^89,90Sr в костном мозге. В настоящее время самым младшим облученным лицам исполнилось 60 лет. Известно, что после 25 лет у человека начинается инволюция тимуса, но высока вероятность сохранения НХА в клетках, не вступивших в митоз в организме либо прошедших 1–2 митоза с аберрацией. До сих пор внутреннему облучению подвергаются циркулирующие лимфоциты [17].

В результате нашего исследования в группе необлученных лиц, было выявлено увеличение частоты клеток с нестабильными обменными аберрациями с возрастом. Более того, этот показатель достоверно был выше в обеих старших возрастных подгруппах при сравнении с подгруппой «40–59 лет». Обнаруженные нами закономерности подтверждают данные литературы, где также отмечали зависимость дицентрических и кольцевых хромосом от возраста [11, 12]. Однако подобных зависимостей не было отмечено при анализе данных, полученных при исследовании хромосомных препаратов в группе облученных лиц. С увеличением возраста в трех возрастных подгруппах не отметили ожидаемого увеличения частоты хромосомных аберраций. Все показатели (табл. 1) были одинаковыми и максимальными для данного исследования.

Влияние хронического облучения на частоту хромосомных аберраций было выявлено только у лиц в возрасте 40–59 лет. Вопреки ожиданиям, в самой старшей возрастной группе (70–79 лет) у облученных лиц показатели сравнялись с рассчитанными для необлученных доноров. Таким образом, влияние хронического облучения на преждевременное клеточное старение у жителей прибрежных сел реки Теча отмечено только для лиц в возрастном диапазоне 40–59 лет. При обследовании облученных лиц в старшем возрасте различия с контролем не обнаружили.

Для объяснения полученных на первый взгляд «противоречивых» данных есть следующее объяснение. Оно касается особенностей критериев отбора доноров для цитогенетического исследования, которые могут смещать выбор наиболее радиоустойчивых доноров в группе облученных лиц. Так, согласно критериям отбора, в исследование включают лиц без онкологических, аутоиммунных заболеваний, без сахарного диабета в анамнезе. Соблюдают такие ограничения для того, чтобы избежать влияния диагностических и лечебных мероприятий на увеличение частоты цитогенетических показателей. Учитывая, что вышеперечисленные заболевания чаще начинают манифестироваться в старшем и пожилом возрасте, вполне возможно, что среди облученных людей радиочувствительные лица имели больше шансов реализовать эффекты от воздействия облучения и, следовательно, при формировании групп доноров они попали под критерии исключения. Косвенным подтверждением этому предположению могут быть результаты исследования, где отмечалось, что лица с повышенным уровнем частоты хромосомных аберраций имели большую вероятность в будущем заболеть онкологическими заболеваниями [18]. Учитывая все вышеперечисленное, можно предположить, что если в более молодом возрасте в выборку для цитогенетического исследования попали люди с разнообразным «генетическим потенциалом» по реакции воздействия на них ионизирующего облучения, то в группы доноров старше 60 лет среди облученных лиц чаще могли быть включены так называемые «радиорезистентные лица».

Несмотря на некоторые противоречия, полученные в ходе анализа, результаты исследования позволяют нам сделать вывод о том, что хроническое облучение оказало опосредованное влияние на преждевременное старение Т-лимфоцитов. Подтверждением является, во-первых, достоверно повышенная частота НХА у облученных лиц в отдаленные сроки с момента начала воздействия. Вовторых, у облученных лиц в возрасте 40–59 лет достоверно чаще выявляли НХА по сравнению с людьми такого же возраста, но облучению не подвергавшимися.

Таким образом, в настоящей статье была предпринята попытка представить дизайн цитогенетического исследования для оценки влияния хронического ионизирующего излучения в условиях in vivo на преждевременное старение Т-лимфоцитов человека, а также были проанализированы результаты исследования в трех возрастных подгруппах. В результате мы не можем исключить, что критерии отбора возрастных доноров могут способствовать включению в группу наиболее радиорезистентных облученных лиц, что может приводить к «противоречивым» результатам. Тема эта дискуссионная и необходимо продолжение исследований за счет расширения выборки доноров для обеих сравниваемых групп и, что немаловажно, увеличения количества анализируемых метафазных пластинок.

ВЫВОДЫ

Влияние хронического облучения на преждевременное старение Т-клеток по цитогенетическому показателю выявили у жителей Южного Урала, которым на момент обследования было 40–59 лет.