В ранее выполненном исследовании была выявлена задержка рентгенологической тени сульфата бария, введенного в желудок крысам, при острой интоксикации циклофосфаном [1], что характерно для желудочнокишечного стаза (ЖКС). Это потенциально летальное осложнение нередко возникает при подготовке пациентов к пересадке стволовых кроветворных клеток — миелоабляционной цитостатической терапии [2]; у некоторых реципиентов рентгенологическая тень желудка распространяется на значительную часть не только брюшной, но и грудной полости [3]. Клиническая значимость ЖКС обусловлена его негативным влиянием на исход химиотерапии. Он препятствует питанию пациентов, лишает смысла пероральное назначение им медикаментозных средств; сопровождающий его избыточный рост кишечной микрофлоры ведет к реализации кворумэффекта [4], интенсификации образования ею токсичных веществ, формированию эндотоксемии и эндотоксикоза. ЖКС способствует повреждению энтерогематического барьера с поступлением в кровь липополисахаридов грамотрицательных бактерий, развитием системного воспаления [5] и сепсиса [6]. ЖКС вовлечен в патогенез поздней цитостатической рвоты; однако назначение таким пациентам противорвотных [7, 8], прокинетических или спазмолитических средств [7] не устраняет острый цитостатический желудочно-кишечный мукозит, защитной реакцией на первую стадию которого, предположительно, является ЖКС [9]. Более перспективным подходом к его профилактике при миелоабляционном кондиционировании представляется применение энтеропротекторов — медикаментозных средств, предупреждающих развитие острого желудочно-кишечного мукозита. При использовании для цитостатической терапии циклофосфана (ЦФ) энтеропротективный эффект, гипотетически, может быть достигнут ощелачиванием желудочно-кишечного химуса. С повышением рН биосред замедляется спонтанный гидролиз образовавшегося в печени активного метаболита ЦФ, альдофосфамида, тормозится накопление более токсичных метаболитов: акролеина и фосфорамидного иприта [10], повышается активность ключевого фермента, обеспечивающего детоксификацию ЦФ — альдегиддегидрогеназы, оптимум рН которой лежит в щелочном интервале значений [11]. Более высокие в норме в сравнении с опухолевыми клетками значения рН цитоплазмы способствуют избирательности противоопухолевого действия ЦФ [12]. Закисление химуса введением в желудок слабых растворов кислот [13] или лактулозы [14] отягощало острую интоксикацию циклофосфаном у крыс. При введении в желудок ЦФ вызывал у них более выраженный ЖКС, чем при внутрибрюшинном введении в той же дозе, что может быть отчасти обусловлено его более интенсивной токсификацией в кислой среде [1]. Целью исследования была проверка гипотезы о том, что ощелачивающий агент NaHCO₃, вводимый в желудок при моделировании на крысах миелоабляционной цитостатической терапии циклофосфаном, проявит профилактическую активность в отношении ЖКС.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследовании использовали 140 самцов крыс линии Вистар (161–190 г), приобретенных в питомнике ФГУП «ПЛЖ „Рапполово“». При работе с животными соблюдали «Правила лабораторной практики», утвержденные Приказом Минздравсоцразвития России № 708н от 23 августа 2010 г. Рацион состоял из стандартного корма для крыс и питьевой воды ad libitum. Животных методом простой случайной выборки распределяли по экспериментальным группам. Для лишения корма их на заданное время помещали в клетки с решетчатым полом (исключавшим копрофагию и поедание элементов подстилки) при доступе только к воде. Миелоабляционную цитостатическую терапию моделировали однократным введением в латеральную вену хвоста в объеме 10 мл/кг свежеприготовленного водного раствора препарата «Эндоксан» (Baxter Oncology GmbH; Германия) в дозе 390 мг/кг (≈ 1,7 ЛД_{99/30 сут}), что для человека эквивалентно суточной дозе 60 мг/кг, в которой его включают в схемы миелоабляционного кондиционирования [15]. Лапаротомию, извлечение органов проводили под масочным фторотановым наркозом. Выраженность ЖКС оценивали по относительной массе желудочного и слепокишечного химусов, которую рассчитывали как разность масс заполненного химусом и пустого органа (gaster, caecum) в граммах, отнесенную к массе тела в килограммах.

На первом этапе работы изучали динамику формирования ЖКС после миелоабляционного воздействия. Для этого животных распределяли в семь групп, из которых первая была представлена интактными крысами (n = 10), имевшими неограниченный доступ к корму, три другие — лишенными доступа к корму через 4, 24 или 48 ч после введения ЦФ, и три оставшиеся — лишенными доступа к корму в те же сроки, но не получавшими ЦФ (в каждой группе n = 10). Через 72 ч после введения ЦФ всех животных лапаротомировали и определяли у них выраженность ЖКС.

На втором этапе работы оценивали влияние NaHCO₃ на выраженность ЖКС и на интенсивность роста желудочнокишечной микрофлоры. Для этого использовали крыс, лишенных доступа к корму с 24 по 72 ч после введения ЦФ. Животных распределяли в пять групп, из которых первая была представлена интактными особями (n = 10), а остальные — получившими ЦФ (в каждой группе n = 10). Крысам второй группы вводили только ЦФ; крысам третьей группы в желудок вводили 4%-й раствор NaHCO₃ (pH = 8,34) в объеме 15 мл/кг за 30 мин до введения ЦФ. В четвертой группе введение NaHCO₃ за 30 мин до ЦФ дополняли повторным введением NaHCO₃ в той же дозе тотчас после введения ЦФ; в пятой группе NaHCO₃ вводили в желудок четырежды: за 30 мин до, тотчас после, через 60 и 120 мин после введения ЦФ. Через 48 ч после введения ЦФ всех крыс помещали в метаболические камеры для сбора мочи; в мочеприемники вносили по 50 мкл 10%-го раствора трихлоруксусной кислоты в качестве консерванта. Через 72 ч после введения ЦФ оценивали выраженность ЖКС. Для оценки избирательности протективного действия NaHCO₃ параллельно с относительной массой химуса gaster и caecum определяли относительную массу селезенки в качестве показателя цитостатического поражения кроветворной системы. В качестве показателя интенсивности роста желудочнокишечной микрофлоры использовали экскрецию индикана с мочой [16]. Объем собранной за сутки мочи измеряли и в ней количественно определяли показатель кишечного эндотоксикоза — индикан [17], экскрецию которого с мочой выражали в микрограммах на килограмм массы тела в час.

На третьем этапе работы изучали морфологические изменения в тонкой кишке при моделировании указанным выше способом миелоабляционной цитостатической терапии и влияние на эти изменения двукратного (за 30 мин до и тотчас после ЦФ) введения в желудок NaHCO₃. Отрезки тонкой кишки длиною по 10 см (duodenum — проксимальнее pylorus; jejunum — 10 см дистальнее flexura duodenojejunalis; ileum — проксимальнее caecum) фиксировали в 10%-м формалине и заливали в парафин. Кольцевые срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали на сканирующем цифровом микроскопе 3DHISTECH Pannoramic MIDI (Carl Zeiss AG; Германия). Подсчитывали число, измеряли длину кишечных ворсинок на 58–73 срезах каждого органа от трех животных; результаты обрабатывали с помощью программы Case Viewer (3DHISTECH Ltd.; Венгрия).

Результаты представляли в виде среднего значения и его ошибки (M ± m). Влияние вводимых веществ на исследуемые количественные показатели оценивали с помощью дисперсионного анализа. В случаях значимости полученных моделей межгрупповое сравнение средних величин выполняли с помощью теста честной значимой разницы Тьюки [18]. Связь между признаками выражали с помощью рангового коэффициента корреляции Спирмена r_s. Критический уровень значимости α приняли равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Через трое суток после введения ЦФ у крыс, лишенных корма в течение 48 ч до лапаротомии, расширенный и заполненный химусом желудок занимал бóльшую часть объема брюшной полости; у интактных животных он выглядел пустым. Объем слепой кишки на фоне введения ЦФ был увеличен в меньшей степени (рис. 1). Корм, съеденный в ближайшие 24 ч после введения ЦФ, оставался в желудке в течение последующих 48 ч, что вело к увеличению относительной массы желудочного химуса в 7–13 раз. Избыточное накопление химуса в caecum было представлено в виде тенденции (p = 0,075 для лишенных корма в течение 4 ч; рис. 2). У животных, получивших ЦФ, масса тела в день лапаротомии составляла меньшую долю от ее значения перед затравкой, чем в контроле: 78,9 ± 0,8% против 86,2 ± 0,5% (p < 0,05).

Введение в желудок NaHCO₃ за 30 мин до и тотчас после введения ЦФ частично предотвращало развитие ЖКС: относительная масса желудочного химуса была, в среднем, в 2,6 раза меньше, чем у незащищенных животных, хотя и оставалась втрое большей, чем у интактных. Снижение относительной массы слепокишечного химуса было представлено в виде тенденции (p = 0,084). Четырехкратное введение NaHCO₃ не имело преимуществ перед двукратным, а однократное профилактическое введение NaHCO₃ было малоэффективным. Введение NaHCO₃ мало влияло на вызванную ЦФ гипотрофию селезенки (рис. 3).

Экскреция индикана с мочой после изолированного воздействия ЦФ была в среднем в 1,9 раза выше, чем у интактных крыс; на фоне двукратного введения в желудок NaHCO₃ это превышение было 1,4-кратным, проявляясь лишь в виде тенденции (p = 0,067; рис. 4). У крыс, которым вводили ЦФ, этот показатель имел сильную отрицательную корреляцию (r = –0,77; p < 0,01) с массой тела в день лапаротомии, выраженной в процентах от массы тела до затравки. Экскреция индикана крысами, получившими только ЦФ, положительно коррелировала с относительной массой слепокишечного химуса (r = 0,66; p < 0,05); при введении, кроме ЦФ, NaHCO₃ эта корреляция была слабой (r = 0,15).

Через трое суток после введения ЦФ в тонкой кишке наблюдались изменения (полнокровие, воспаление, атрофия), тяжесть которых нарастала в направлении от двенадцатиперстной до подвздошной кишок. Существенно сокращалась средняя длина кишечных ворсинок, была отмечена и тенденция к уменьшению их числа на кольцевом срезе органа. В подвздошной кишке ворсинки были атрофированы. У крыс, которым кроме ЦФ вводили NaHCO₃, эти изменения не обнаружены (таблица; рис. 5).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Моделирование на крысах миелоабляционной цитостатической терапии сопровождалось глубоким торможением пропульсивной функции желудочнокишечного тракта (ЖКТ) с преобладанием гастростаза, формировавшегося в ближайшие часы после введения ЦФ. Транзит содержимого желудка превышал трое суток. У здорового человека он составляет 10–48 мин [19], поэтому можно предположить, что гастростаз сопровождает бóльшую часть курса миелоабляционного кондиционирования реципиентов стволовых кроветворных клеток, составляющего 3–5 сут. [15]. Не исключена вовлеченность гастростаза в ухудшение общего состояния организма при миелоабляционной цитостатической терапии, на что указывает потеря животными почти четверти от исходной массы тела за трое суток после введения ЦФ.

Введение в желудок NaHCO₃ в два приема в суммарной дозе, которая для человека эквивалентна 350 мл 4%-го раствора, позволило в существенной мере, хотя и не полностью, сохранить пропульсивную функцию желудка. Наиболее эффективным NaHCO₃ был в сроки, не превышавшие значения T_½ ЦФ после внутривенного (в. в.) введения крысам, а именно 0,5 ч [20]. Из этого следует, что в механизме профилактического действия NaHCO₃ преобладало торможение токсификации ЦФ. В связи со слабощелочной реакцией раствора NaHCO₃ и способности этой соли к резорбции слизистой оболочкой ЖКТ, в профилактический эффект было вовлечено торможение образования акролеина и фосфорамидного иприта в эпителиоцитах желудка и (или) тонкой кишки. На это же указывает неспособность NaHCO₃ предупреждать вызываемую циклофосфаном гипотрофию селезенки, что можно объяснить буферными свойствами крови, не позволявшими в сопоставимой мере повысить рН клеток стволового или пролиферативного пулов кроветворной системы. Таким образом, защитное действие NaHCO₃ на ЖКТ было избирательным, что благоприятствует его апробации при заболеваниях, требующих миелоабляционной цитостатической терапии.

Оптимум pH для ферментов, отвечающих за репарацию ДНК, лежит в интервале значений, близких к нейтральным (6,5–7,5), поэтому ацидоз, обусловленный сдвигом от окислительного к гликолитическому фосфорилированию и сопровождающий повреждение ипритами митохондрий [21], может нарушать репарацию ДНК. Ацидоз ведет и к другому эффекту, способствующему энтероцитопении: экспрессии проапоптотических белков, активирующих каспазы [22]. Это определяет возможность защитного эффекта NaHCO₃ при острой интоксикации не только ЦФ, но и другими цитостатическими агентами алкилирующего действия; данная гипотеза требует дальнейшей проверки.

Вызванный циклофосфаном гастростаз сопровождался повышением экскреции с мочой индикана (калиевой соли индоксилсерной кислоты) — конечного продукта метаболизма в печени индола (окисление в индоксил и его сульфирование), основным источником которого у крыс в условиях эксперимента была реакция, катализируемая триптофаназой кишечной микрофлоры. Это указывает на увеличение при ЖКС массы и (или) метаболической активности кишечной микрофлоры, продуцирующей индол, но не метаболизирующей его; в этом случае неизбежна интенсификация образования в ЖКТ не только индола, но и другого токсичного продукта триптофаназной реакции — аммиака. Вызванное ЦФ повышение экскреции индикана было меньшим, чем увеличение относительной массы желудочного химуса, что, вероятно, связано с низкой резорбирующей способностью желудка в сравнении с кишечником. На фоне введения NaHCO₃ различия в экскреции индикана между интактными и получившими ЦФ животными были незначительными, что характеризует уровень эндотоксемии у последних.

Моделирование миелоабляционной цитостатической терапии было сопряжено с повреждением тонкой кишки. Выраженность повреждения возрастала в дистальном направлении, что определяется на четыре

порядка более высоким содержанием бактерий в химусе ileum в сравнении с duodenum [23]. Это согласуется с гипотезой о том, что гастростаз является защитной реакцией организма, биологический смысл которой — предупреждение травматизации поврежденной цитостатиком тонкой кишки, которая является наиболее чувствительным к цитостатическим агентам отделом ЖКТ [24]. Применением NaHCO₃ были предупреждены дистрофические изменения во всех отделах тонкой кишки. Если для двенадцатиперстной и проксимальной части тощей кишок такой эффект можно объяснить локальным ощелачиванием, то механизм защитного действия NaHCO₃ в отношении подвздошной кишки требует дальнейшего изучения. Это связано с тем, что время ее достижения раствором NaHCO₃ (по нашим предварительным данным, полученным путем наблюдения за введенным в желудок крыс раствором метиленового синего, не менее 3 ч), существенно превышает T_½ ЦФ для крыс при в. в. введении [20].

Проблема лечения острого цитостатического желудочно-кишечного мукозита все еще далека от своего разрешения. В качестве возможных терапевтических средств рассматривают антиоксиданты, противовоспалительные средства и ингибиторы апоптоза [25]. Однако их доставка в наиболее чувствительный к цитостатическим агентам отдел ЖКТ — тонкую кишку — возможна лишь при отсутствии гастростаза. Поэтому медикаментозному лечению цитостатического мукозита должно предшествовать применение медикаментозных средств его экстренной профилактики. Результаты настоящей работы указывают на перспективность раннего перорального назначения с этой целью ощелачивающих агентов, в частности, гидрокарбоната натрия.

ВЫВОДЫ

1) Однократное в. в. введение крысам циклофосфана в дозе, эквивалентной применяемым при миелоабляционном кондиционировании, ведет к дистрофическим изменениям в слизистой оболочке тонкой кишки, развитию в течение суток желудочно-кишечного стаза с преобладанием гастростаза и избыточному росту желудочно-кишечной микрофлоры, продуцирующей индол. 2) Введение крысам в желудок гидрокарбоната натрия в дозе, эквивалентной 350 мл его 4%-го раствора для человека, за 30 мин до и тотчас после введения циклофосфана, в существенной мере предупреждает формирование острого цитостатического мукозита тонкой кишки, гастростаза и избыточный рост желудочно-кишечной микрофлоры. 3) Раннее пероральное назначение гидрокарбоната натрия — перспективный подход к экстренной профилактике гастростаза при миелоабляционной химиотерапии циклофосфаном, создающий необходимое условие для последующего перорального назначения пациентам медикаментозных средств лечения острого цитостатического мукозита тонкой кишки. 4) Представляет интерес апробация представленного выше подхода к экстренной профилактике гастростаза при миелоабляционной цитостатической терапии не только циклофосфаном, но и другими цитостатическими медикаментозными средствами алкилирующего действия.