Интерлейкины выполняют важную регуляторную роль в противоопухолевом иммунитете, они обеспечивают медиаторное взаимодействие клеток иммунной системы, а также регулируют такие процессы, как активация иммунокомпетентных клеток, апоптоз, клеточный цикл и дифференцировка иммунокомпетентных клеток. Например, IL1 усиливает пролиферацию CD4⁺-клеток и связывание натуральных киллеров (NK-клетки) с опухолевыми клетками, а также индуцирует продукцию IL2, который в свою очередь способствует пролиферации дендритных клеток, при этом инфильтрация опухоли дендритными клетками коррелирует с эффективностью противоопухолевого иммунитета [1]. Кроме того, противоопухолевый ответ, регулируемый Th1 посредством секреции провоспалительных цитокинов IL2, ФНОα, ИФНγ, способствует не только премированию и активации цитотоксических Т-клеток, но и противоопухолевой активности макрофагов и NK-клеток [2]. IL4 играет важную роль в развитии провоспалительных реакций, способствует пролиферации NK-клеток и активированных Т-клеток, усиливая их противоопухолевое действие, регулирует активированные противовоспалительные макрофаги, которые способствуют элиминации раковых клеток [3]. Считается также, что он непосредственно способен подавлять рост опухоли за счет блокады клеточного цикла [1]. В то же время сами макрофаги могут секретировать IL10, что способствует иммунносупрессии, путем нарушения активности эффекторных Т-клеток и ингибирования созревания дендритных клеток [2]. Сильным провоспалительным свойством, а также способностью к подавлению опухолевого роста обладает IL6, однако в некоторых случаях его могут продуцировать опухолевые клетки и он способствует росту миелом и некоторых типов опухолевых клеток [4]. Относительно противоопухолевой активности IL8 данных мало, однако известно, что он способен привлекать и функционально модулировать нейтрофилы и макрофаги в опухолевые очаги, при этом высокие уровни IL8 наоборот способствуют прогрессированию рака и метастазированию посредством различных механизмов, включая проангиогенез и поддержание условий для развития раковых стволовых клеток [5].

Провоспалительные факторы, в том числе секретируемые провоспалительные цитокины способствуют подавлению опухоли, однако в случае длительного хронического воспаления могут приводить к активации онкогенеза [6].

Известно, что воспаление играет важную роль в развитии рака на разных стадиях канцерогенеза, оно способствует геномной нестабильности, эпигенетическим модификациям, индукции пролиферации раковых клеток, усилению антиапоптотических сигналов, стимуляции ангиогенеза [7]. С хроническим воспалением связано не менее 25% случаев рака [2, 8].

Причинами хронического воспаления могут быть микробная инфекция, аутоиммунные нарушения, ожирение, иммунная дисфункция, а также факторы внешней среды. В ряде исследований показано, что радиационное облучение в отдаленном периоде способствует развитию хронического воспаления [9]. В частности, острое облучение, которому подверглись люди, пережившие бомбардировки в Хиросиме и Нагасаки, в отдаленном периоде способствовало развитию хронического воспаления за счет дисбаланса Th1/Th2 [10]. Кроме того, у облученных в Японии людей с увеличением дозы облучения  регистрировали повышение уровня таких провоспалительных маркеров, как С-реактивный белок, IL6, ИНФγ, ФНОα и IL10 [11, 12]. У ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС в отдаленном периоде наблюдали изменения в цитокиновом профиле: увеличивался уровень ИНФγ и ФНОα [13]. Пролонгированное радиационное воздействие в диапазоне малых и средних доз тоже может вызывать хроническое воспаление. В частности, у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в результате загрязнения реки Течи радиоактивными отходами, спустя 65–70 лет обнаруживают изменения в количественных и функциональных показателях системного иммунитета [14], а также провоспалительные изменения в цитокиновом профиле [15].

Полиморфные варианты, располагающиеся в кодирующих,  регуляторных и не кодирующих областях генов, а также в межгенных регионах, могут влиять на экспрессию гена, стабильность мРНК, структуру и активность белкового продукта, что в свою очередь отражается на функциональном состоянии клетки и организма в целом [16]. В ряде исследований установлена связь полиморфных участков в генах интерлейкинов с риском развития различных онкологических заболеваний. Показано, что полиморфизм rs2069762 (-330T>G) в промоторной области гена IL2 связан с предрасположенностью к нескольким видам рака, таким как рак мочевого пузыря [17], карцинома носоглотки [18] и неходжкинская лимфома [19]. По результатам метаанализа установлено, что полиморфизм rs2070874 (-33T>C) в гене IL4 ассоциирован с риском развития лейкоза и раком полости рта [20]. Показано, что полиморфизм rs1800795 в гене IL6 играет важную роль в патогенезе нескольких типов рака, таких как рак шейки матки, колоректальный рак и рак молочной железы [21]. Для полиморфизма rs4073 (-251A>T) в гене противовоспалительного цитокина IL8 также показана связь с повышенным риском развития рака желудка [22]. Все эти данные указывают на наличие модифицирующего эффекта полиморфных локусов в генах интерлейкинов в процессе онкотрансформации клетки. Однако, несмотря на имеющуюся связь с патологическим состоянием, достаточно сложно установить функциональную значимость выявленного полиморфизма для развития заболевания, особенно в случае такой мультифакторной патологии, как рак. Одним из возможных механизмов влияния полиморфизма на развитие патологии может быть изменение экспрессионной активности гена, что отражается на концентрации конечного продукта. В связи с этим цель работы — поиск связи полиморфных вариантов генов интерлейкинов IL1b (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) с риском развития онкологических заболеваний, а также анализ влияния полиморфных локусов  на концентрацию сывороточных интерлейкинов у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Характеристика обследуемых лиц

Поиск ассоциации полиморфных аллелей и генотипов IL1b (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) с риском развития солидных злокачественных новообразований (ЗНО), а также их влияния на концентрацию сывороточных интерлейкинов проводили у лиц, подвергшихся низкоинтенсивному хроническому радиационному воздействию в период с 1949 по 1960 г. в результате сброса жидких радиоактивных отходов ПО «Маяк» в реку Течу (Южный Урал, Россия) [23]. Облученные лица, вошедшие в исследование, на протяжении многих лет наблюдаются в клиническом отделении ФГБУН «Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России» (УНПЦ РМ). При формировании обследованных групп были использованы следующие критерии включения: проживание в период с 1 января 1950 г. по 31 декабря 1960 г. в одном из сел, расположенных на побережье р. Течи; наличие рассчитанных индивидуальных доз облучения красного костного мозга (ККМ), тимуса и периферических лимфоидных органов. Критерии исключения: отсутствие информации об истории проживания на радиационно загрязненных территориях. Для группы лиц без ЗНО, у которых проводили анализ сывороточных интерлейкинов, были сформированы дополнительные критерии исключения: наличие диагностируемых на момент обследования аутоиммунных, острых или хронических (период обострения) воспалительных заболеваний, гемобластоза, почечной или печеночной недостаточности, острого нарушения мозгового кровообращения в течение последних трех месяцев, онкозаболеваний; прием антибиотиков, глюкокортикоидов, цитостатиков. В биофизической лаборатории УНПЦ РМ для всех лиц, включенных в исследование, был проведен расчет индивидуальных поглощенных доз облучения ККМ и мягких тканей с использованием дозиметрической системы «Techa River Dosimetry System» (TRDS 2016) [24].

Всего в исследование были включены 585 человек, подвергшихся хроническому радиационному воздействию. Из числа обследованных были сформированы две группы: 207 человек, имеющие в анамнезе злокачественные новообразования (ЗНО) различных локализаций, вошли в группу «Облученные с ЗНО», и 378 практически здоровых человека вошли в группу сравнения «Облученные без ЗНО». Подробная характеристика исследуемых лиц представлена в табл. 1.

Среди диагностированных форм солидных ЗНО были следующие: органов пищеварительной системы — 70 человек (код по МКБ-10 С00.2, C02.1, C04.9, С06.9, C15.9, C16.9, С18.4, С19, C22.9, C25.9, Q15.9); органов женской репродуктивной системы — 66 человек (код по МКБ-10 С50, С53.9, С54.9, С57.4); органов дыхательной системы — 25 человек (код по МКБ-10 Z85.22, C32.9, С33, С34); мочевыделительной системы — 16 человек (код по МКБ-10 C67.9, C68.9); органов эндокринной системы — 10 человек (код по МКБ-10 С73); органов мужской репродуктивной системы — 9 человек (код по МКБ-10 С61); органов покровной системы — 9 человек (код по МКБ-10 С43.9, С44.90), зрительной системы — 2 человека (C69.90).

Выделение ДНК и генотипирование

Геномную ДНК (гДНК) выделяли из цельной крови колоночным методом с использованием коммерческого набора ExtractDNA Blood & Cells («Евроген»; Россия) по стандартному протоколу, основанному на рекомендациях производителя. Чистоту препарата гДНК оценивали по значению соотношения длин волн 260 и 280 нм (А260/280) спектрофотометрическим методом на анализаторе NanoDrop 2000 (Thermo Scientific; США).

Амплификацию проводили методом ПЦР «в реальном времени» на приборе StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems; США) с использованием набора для генотипирования полиморфных маркеров IL1B (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) («ТестГен»; Россия). Реакционная смесь объемом 10 мкл содержала 4 мкл смеси для ПЦР, 3 мкл деионизированной воды, 2 мкл Taq-полимеразы и 1 мкл исследуемого образца гДНК. Анализ данных генотипирования проводили с помощью программы StepOne Software v2.1 (Applied Biosystems; США).

Оценка концентрации сывороточных интерлейкинов

Концентрацию сывороточных интерлейкинов (IL1β, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10) определяли методом иммуноферментного анализа, используя автоматический анализатор «Lazurite» (DYNEX Technologies; США) и соответствующие тестсистемы («Вектор-Бест»; Россия). Забор крови у пациентов проводили натощак после пункции локтевой вены в вакуумную пробирку с активатором свертывания (SiO₂) в количестве 9 мл. Сыворотку отделяли после инкубации крови при температуре 20–25 °С в течение 45–60 мин и последующего центрифугирования при 1500 об./мин в течение 10 мин. До проведения анализа сыворотка однократно замораживалась при температуре –20 °С. Концентрацию цитокинов в сыворотке выражали в пг/мл.

Статистическая обработка данных 

Статистическую обработку осуществляли с использованием программного комплекса STATISTICA v.12.0 (IBM; США), а также онлайн-калькуляторов medstatistics (https:// medstatistic.ru/) и GeneCalc (https://gene-calc.pl/hardyweinberg-page). Статистическую значимость различий частот распределения аллелей и генотипов в исследуемых группах оценивали с использованием критерия χ² с поправкой Йетса на множественные сравнения. Оценку межгрупповых различий по показателю концентрации сывороточных интерлейкинов проводили при помощи непараметрического критерия Манна–Уитни (U-test). Поиск ассоциаций исследуемых полиморфизмов с риском развития ЗНО проводили в рамках двух генетических моделей: доминантной (объединенное сравнение гетерозиготного и вариантного гомозиготного генотипов с референтным гомозиготным гентотипом) и рецессивной (объединенное сравнение гетерозиготного и референтного гомозиготного генотипов с вариантным гомозиготным генотипом). Для оценки связи полиморфных участков генов с риском развития ЗНО рассчитывали показатель отношения шансов (ОШ) и 95%-го доверительного интервала (95% ДИ) согласно формуле, предложенной в литературе [25]. Ассоциации со значениями p < 0,05 считали статистически значимыми.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты распределения генотипов полиморфных локусов rs1143634, rs2069762, rs2070874, rs1800795, rs4073, rs1800871 представлены в табл. 2. Для всех изученных полиморфных локусов наблюдалось соответствие равновесию Харди–Вайнберга.

С целью установления возможного влияния полиморфных участков IL1B (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) на концентрацию интерлейкинов в группе облученных лиц без ЗНО было проведено исследование концентрации соответствующих сывороточных интерлейкинов у носителей разных генотипов (табл. 3). В результате исследования у носителей минорного аллеля rs2070874*T (генотипы C/T и T/T) было выявлено статистически значимое снижение содержания IL4 в сыворотке крови по сравнению с носителями доминантного генотипа C/C по полиморфному участку rs2070874 в гене IL4 (р = 0,02). На уровне тенденции с 90%-й значимостью у носителей минорного аллеля rs1143634*Т (генотипы C/T и T/T) гена IL1 обнаружено снижение концентрации сывороточного IL1 по сравнению с носителями генотипа С/С (р = 0,054). Для остальных полиморфных локусов статистически значимых изменений в концентрации сывороточных интерлейкинов у носителей разных генотипов не зарегистрировано.

Несмотря на то что в данной работе мы не выявили влияния остальных полиморфных участков генов интерлейкинов на концентрации сывороточных интерлейкинов, следует заметить, что в ранее проведенных нами исследованиях у облученных лиц была установлена связь rs2069762 в гене IL2 с количеством Т-лимфоцитов и Т-NK-клеток (фенотип CD3⁺CD16⁺56⁺) и rs1800795 в гене IL6 с количеством Т-хелперов [26]. В связи с этим нами было проведено исследование связи изученных полиморфных локусов с риском развития онкологических заболеваний у облученных лиц. Исследование проводили в соответствии с двумя генетическими моделями (рецессивная и доминантная). Однако ни для одного из изученных полиморфных локусов не была обнаружена связь с онкологическими заболеваниями (табл. 2).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Одним из механизмов, объясняющих связь конкретного полиморфного участка с риском развития заболевания, может быть влияние этого полиморфизма на структуру белка (в случае нахождения в кодирующей области гена) или изменение его концентрации (в случае расположения в интронной и промоторных областях гена). Так, например, полиморфизм rs2069762 располагается в сайте связывания транскрипционного фактора с промоторным регионом гена IL2 и влияет на экспрессию IL2 [27].

В приведенных нами исследованиях у лиц, подвергшихся низкоинтенсивному хроническому радиационному воздействию в диапазоне доз на ККМ от 1,17 до 3507 мГр (среднее значение — 566 мГр), выявлено статистически значимое снижение содержания IL4 в сыворотке крови у носителей генотипов C/T и T/T по сравнению с носителями доминантного генотипа C/C по полиморфному участку rs2070874.

Полиморфный участок rs2070874 находится в 5'-нетранслируемой области (5'UTR) гена IL4. Область 5'UTR связана с контролем эффективности трансляции белка, поскольку отвечает за связывания транскрипционного фактора, РНК-полимеразы и образования инициирующего рибосомного комплекса [28, 29]. Вероятно, замена в данной области может влиять на эффективность процесса трансляции и конечную концентрацию IL4.

Кроме того, с 90%-й значимостью у носителей минорного аллеля rs1143634*Т (генотипы C/T и T/T) гена IL1 обнаружено снижение концентрации сывороточного IL1 по сравнению с носителями генотипа С/С. Полиморфный участок rs1143634 является синонимичным вариантом и может вызывать нарушение сплайсинга мРНК, что, вероятно, проявляется в изменении концентрации белкового продукта [30]. Влияние выявленных полиморфных участков на концентрацию сывороточных продуктов в доступной литературе найдено не было.

Согласно литературным данным, в ряде исследований обнаружена связь полиморфных локусов IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073) с риском развития ЗНО различных локализаций. Так, rs2069762 связан с предрасположенностью к развитию рака мочевого пузыря [17], карциномы носоглотки [18] и неходжкинской лимфомы [19]; rs2070874  ассоциирован с риском развития лейкоза и рака полости рта [20]; rs1800795 — с раком шейки матки, колоректальным раком и раком молочной железы [21]; rs4073 — с повышенным риском развития рака желудка [22]. Кроме того, зарегистрировано совместное модифицирующее действие полиморфизма и онкогенного фактора, например при стаже курения менее 35 лет дополнительным фактором риска развития плоскоклеточного рака легкого у мужчин было наличие аллеля rs1800795*G в гене IL6 [16]. Однако в наших исследованиях не установлена связь локусов IL1B (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874, IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) с риском развития ЗНО у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию. Вероятно, это обусловлено гетерогенностью представленных в исследовании ЗНО. Важно учитывать, что канцерогенез является многостадийным процессом, в который вовлечены различные сигнальные пути и защитные системы организма, регулируемые большим количеством генов и генных сетей, в связи с чем требуются дальнейшее исследование по поиску генетических маркеров развития ЗНО.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования выявлена связь полиморфного участка IL4 (rs2070874) с концентрацией сывороточного IL4. Содержание сывороточного IL4, у носителей генотипов C/T и T/T в соответствии с доминантой моделью было статистически значимо ниже относительно носителей генотипа C/C. При этом у лиц с ЗНО, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в диапазоне доз на ККМ от 0,70 до 3393 мГр (среднее значение — 700 мГр), не выявлено связи полиморфных локусов  IL1b (rs1143634), IL2 (rs2069762), IL4 (rs2070874), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871) с риском развития ЗНО. Однако, как показано нами, наличие полиморфных участков в генах интерлейкинов может влиять на отдельные показатели иммунной системы и тем самым модифицировать ответ на радиационное воздействие.