Одной из отличительных особенностей ткани скелетных мышц является пластичность — способность изменять свои морфофункциональные характеристики в ответ на изменение уровня сократительной активности. Изучение молекулярных механизмов, лежащих в основе пластичности, является фундаментальной задачей и имеет важное прикладное значение для оптимизации тренировочных программ в физической культуре и спорте, а также для профилактики негативного влияния различных заболеваний на скелетную мускулатуру. С одной стороны, высокоинтенсивная силовая нагрузка вызывает транзиторное увеличение mTORC1-зависимой скорости синтеза мышечных белков [1–3], благодаря чему регулярное применение таких нагрузок приводит к увеличению размеров мышечных волокон и мышцы и максимальной силы, развиваемой мышцей. С другой стороны, однократная силовая нагрузка [4–7] и регулярные силовые тренировки различной длительности [4, 6–11] изменяют профиль генной экспрессии в тренируемой скелетной мышце. При этом механизмы, регулирующие эти изменения (в частности, транскрипционные факторы, ассоциированные с изменением транскриптомного профиля), исследованы недостаточно.

Целью нашей работы был поиск транскрипционных факторов, ассоциированных с изменением транскриптома скелетной мышцы человека при однократном и регулярных силовых упражнениях. Для этого с помощью РНК секвенирования мы исследовали изменение транскриптомного профиля в биоптатах m. vastus lateralis у 10 молодых мужчин после 12-недельной силовой тренировки мышц-разгибателей ног в коленном суставе, а также через 8 ч и 24 ч после однократной силовой нагрузки (рис. 1).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Организация исследования

В исследовании участвовало десять молодых мужчин в возрасте 23 (20,8–25,9) года, с ИМТ 22 (20,9–25,1) кг/м². Критерии включения: полностью здоровые; отсутствие острых и хронических заболеваний; отсутствие опыта длительных силовых тренировок; отсутствие травм и операций в области спины и нижних конечностей. Критерии исключения: отказ от участия в тренировочных сессиях и тестовых манипуляциях; выявление нежелательных угрожающих здоровью и жизни состояний в ходе тренировок или манипуляций; нарушение рекомендованного режима питания или злоупотребление вредными привычками в ходе эксперимента. Участники в течение 12 недель тренировали мышцы-разгибатели ног в упражнении «жим платформы обеими ногами в положении сидя». До начала эксперимента был выполнен опрос участников, все испытуемые сообщили о разнообразном и регулярном питании с достаточным количеством потребляемых белков, жиров и углеводов, адекватным количеством потребляемой жидкости в течение дня. В ходе эксперимента всем участникам было рекомендовано придерживаться обычного для них пищевого режима. Все участники не курили ранее и на момент проведения эксперимента, а также не употребляли каких-либо биологически активных добавок за 3–4 месяца до и на протяжении исследования. Вегетарианцы и веганы в эксперименте участие не принимали. Увеличение мышечной массы при регулярных силовых тренировках зависит, прежде всего, от того, что каждое упражнение (подход) выполняется до выраженного утомления (до отказа), а не от величины используемой нагрузки [12]; при этом оптимальная для роста мышечной силы тренировочная программа состоит из 25 рабочих подходов за тренировку и не менее чем двух тренировок в неделю [13, 14]. Поэтому в нашем исследовании добровольцы тренировались 3 раза в неделю с чередованием нагрузок разной интенсивности: понедельник (65% максимальной произвольной силы, до отказа) — три подхода, среда (50% МПС, 25 повторов) — три подхода и пятница (75% МПС, до отказа) — четыре подхода; подходы разделяли четыре минуты отдыха. Помимо этого, каждая тренировочная сессия включала разминку (50% МПС, 12 повторов). Все участники эксперимента сообщили о средней продолжительности сна около 8 ч в сутки, в ходе эксперимента испытуемые не сообщали об изменениях в их режиме сна. Всем испытуемым рекомендовали умеренный и привычный для них режим физической активности на протяжении 24 ч после каждого тренировочного занятия и воздержание от употребления алкоголя на протяжении 24–48 ч восстановления после тренировок.

Перед тренировочным периодом проводили биопсию из m. vastus lateralis (рис. 1; Б1). Через 2 дня проводили ознакомительное занятие и еще через 2 дня определяли

МПС как наибольшую нагрузку, при которой доброволец мог выполнить полное разгибание обеих ног. МПС оценивали каждые 2–3 недели во время, а также после тренировочного периода (рис. 1; Т2). Отдельно определяли МПС той ноги, которая в дальнейшем работала во время тестового тренировочного занятия (ТТЗ); для снижения эффекта доминантной конечности ногу для ТТЗ выбирали в случайном порядке (рис. 1; Т1). Через 4 дня добровольцы выполняли ТТЗ с упражнением «жим платформы одной ногой в положении сидя» (рис. 1): разминка (50% МПС, 12 повторов) + (65% МПС, до отказа) — четыре подхода). Через 8 ч и 24 ч после окончания занятия брали пробы мышечной ткани при помощи биопсии из m. vastus lateralis работавшей и неработавшей ног. Изменение генного ответа через несколько часов после нагрузки может быть связано не только с мышечным сокращением, но и с действием системных факторов (циркадные осцилляции, питание и т. п.) [15, 16]. В нашей работе для исключения влияния системных факторов на генную экспрессию после однократной нагрузки мы оценивали различия транскриптомного профиля в пробах, полученных из работавшей мышцы и не работавшей (контрольной) мышцы контралатеральной конечности.

Весь биопсийный материал отбирали после 30 мин покоя в положении лежа из средней трети m. vastus lateralis под локальной анестезией (2 мл 2%-го лидокаина) с помощью 6 мм модифицированной иглы Бергстрома с аспирацией [17]. Каждый последующий биопсийный образец брали на 4 см проксимальнее предыдущего. Полученные образцы ткани быстро очищали от крови и соединительной ткани, замораживали в жидком азоте и хранили при –80 °С.

Транскриптомный анализ

Образцы мышечной ткани (~20 мг) гомогенизировали с помощью гомогенизатора TissueLyser II (Qiagen; ФРГ) в режиме два цикла по 1 мин при частоте 30 Гц, РНК выделяли с использованием набора RNeasy mini kit (Qiagen; ФРГ). Концентрацию РНК оценивали с помощью флуориметра Qubit 3.0 (Thermo Scientific; США), а целостность РНК — с помощью капиллярного электрофореза (Bioanalyzer 2100, Agilent; США). Очистку РНК от контаминации ДНК проводили с использованием набора Turbo DNA-free Kit (Thermo Scientific, США). Синтез двухцепочечной кДНК осуществляли с использованием набора Mint-2 («Евроген»; РФ). Очистку полученного ПЦР-продукта проводили методом SPRI на AMPure XP beads (Beckman-Coulter; США), фрагментацию дцкДНК — при помощи ультразвукового устройства ME220 (Covaris; США) в режиме получения дцДНК фрагментов размером 250 пн в стрипах по восемь пробирок в объеме 50 мкл (Peak Incident Power 75W, Duty Factor 20%, Cycles per Burst 1000, Treatment Time 75 s). Полученные фрагменты дцкДНК также очищали методом SPRI на AMPure XP beads (Beckman-Coulter; США).

Для подготовки библиотек для 10 нг фрагментов полученной дцКДНК использовали набор Universal DNA Library Prep Set (MGI-Tech; КНР). Протокол включал репарацию и фосфорилирование концов фрагментов, лигирование асимметричных адаптеров и 4–7 циклов амплификации продуктов лигирования для количественной наработки библиотек. Секвенирование РНК проводили на анализаторе DNBseq-G400 (MGI; КНР) в соответствии с инструкциями производителя с использованием набора реагентов DNBSEQ-G400RS High-throughput Sequencing Set PE100 с длиной прочтения 100 нуклеотидов и глубиной 50 млн пар прочтений на образец.

Биоинформатическая обработка данных РНК-секвенирования

Контроль качества данных секвенирования проводили при помощи программы FastQC v0.11.9 (Babraham Institute; Великобритания). Прочтения низкого качества и адаптерные последовательности удаляли из анализа с помощью программы Trimmomatic v0.39 (USADELLAB; США) при стандартных параметрах. Парные прочтения картировали на референсный геном человека версии GRCh38.p13 (gencode v37) с помощью программы STAR v2.7.4a (Cold Spring Harbor Laboratory, США) при стандартных параметрах. Количество уникальных прочтений для экзонов каждого гена определяли при помощи функции featureCounts пакета Rsubread (язык программирования R, Lucent Technologies, США) с использованием аннотации генома gencode v37.

Для поиска дифференциально экспрессируемых генов (ДЭГ) между группами сравнения использовали пакет DESeq2 языка программирования R (Lucent Technologies; США). Порог для определения ДЭГ составлял Padj < 0,1 (скорректированное p-значение с поправкой Бенджамини– Хохберга). Для анализа функционального обогащения ДЭГ использовали инструмент DAVID (Frederick National Laboratory for Cancer Research; США), используя базы данных биологических процессов и клеточных компартментов UniProt.

Для поиска транскрипционных факторов, потенциально регулирующих экспрессию генов в ответ на силовые упражнения, и соответствующих мотивов связывания были проанализированы промоторные области ДЭГ (области открытого хроматина вокруг старта инициации транскрипции, определенные для скелетной мышцы и опубликованные ранее [18]). Поиск мотивов (и ассоциированных с ними транскрипционных факторов) проводили с помощью платформы GeneXplain, используя базу данных позиционных весовых матриц TRANSFAC v2022.1, как описано ранее [18]. Максимальное обогащение (FEadj, скорректированное отношение шансов частот сайтов при доверительном интервале 99%) было определено для каждой позиционной весовой матрицы (PWM) относительно случайного набора 5000 промоторов. Скорректированная величина обогащения (FEadj) > 1,5 для сайтов связывания с транскрипционными факторами (биномиальный тест) и FDR < 0,05 были выбраны в качестве критериев значимости.

Статистическая обработка

Для оценки изменения МПС после тренировок использовали программу GraphPad Prizm 8 (GraphPad Software, Dotmatics; США), критерий Уилкоксона, пороговое значение p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Двенадцать недель силовых тренировок увеличили максимальную произвольную силу в 1,19 раз (р = 0,002), что сопоставимо с результатами работ с аналогичным дизайном тренировок [19, 20]. Это свидетельствует об эффективности используемой нами тренировочной программы.

Влияние регулярных силовых тренировок на изменения базального транскриптома

Тренировки привели к изменению базальной (утром натощак) экспрессии 209 генов, из которых 145 мРНК увеличили и 64 мРНК снизили содержание (сравнение Б2–Б1; рис. 1). Анализ функционального обогащения выявил значимое обогащение для функциональных терминов «внеклеточный матрикс», «секретируемые белки» и «базальная мембрана». Среди этих генов были различные коллагены, кальмодулин-подобные белки и молекулы адгезии (таблица). Такой результат, несмотря на небольшой объем изменений, хорошо согласуется с данными метаанализов изменений транскриптома в ответ на регулярные силовые тренировки [21, 22]. С одной стороны, вероятно, активация экспрессии генов белков внеклеточного матрикса является одним из механизмов, участвующих в адаптации тренируемой скелетной мышцы к регулярным силовым тренировкам. С другой стороны, в нашей и в других работах отмечено относительно слабое влияние длительных силовых тренировок на транскриптом скелетной мышцы, даже при длительности тренировок в 15 и более лет [23]. Это может быть связано с тем, что силовые упражнения активируют, прежде всего, трансляцию, а не транскрипцию.

Изменение транскриптома в ответ на однократное силовое упражнение

Через 8 ч и 24 ч после однократной силовой нагрузки изменилось содержание 396 и 584 мРНК соответственно, больше половины из них увеличили экспрессию: 239 мРНК и 304 мРНК соответственно. Наборы генов, изменивших экспрессию на 8 ч и 24 ч после однократной нагрузки, пересекались слабо (рис. 2). При анализе обогащения не выявлено функциональных категорий через 8 ч после нагрузки. Тем не менее, обнаружена активация экспрессии ряда генов, известных по предыдущим работам как маркеры раннего ответа на сократительную активность (в т. ч. при аэробных упражнениях): ATF3, DDIT3, JUND, MAFF, NR4A3, VDR, PRKAG2, PPARGC1A и др. [22, 24–26]. Гены, изменившие экспрессию через 24 ч после однократной нагрузки, были ассоциированы с термином «цитоскелет» (таблица). Более половины из них увеличили экспрессию и были представлены генами моторных белков (альфа- и бета-тубулина, актинов ACTA2 и ACTC1, компонентов кинезин-динеинового комплекса KIF9 и DYNLT1), шаперонов (CRYAB1, HSPB1) и др. Стоит отметить, что некоторые экспрессионные маркеры ответа на сократительную активность (ATF3, DDIT3, VDR, PRKAG2) оставались активированными вплоть до 24 ч восстановления после упражнения, что предполагает их важную роль в регуляции ответа на силовую физическую нагрузку. Интересно, что еще меньшее пересечение наблюдается между генным ответом на однократное тренировочное занятие и регулярные тренировки (рис. 2).

Так, после 12-недельного периода силовых тренировок обеих ног мы выявили изменение транскриптомного профиля m. vastus lateralis, сопоставимое с тем, что описано ранее в подобных исследованиях. Используя тестовую модель — упражнение одной ногой, и сопоставляя генную экспрессию в работающей и не работающей m. vastus lateralis, нам впервые удалось охарактеризовать специфичный для силовых упражнений (т. е. не зависящий от циркадианных и системных влияний) транскриптомный ответ в скелетной мышце человека (на 8-м и 24-м ч восстановления). Наборы генов, изменивших экспрессию, слабо пересекались между различными экспериментальными условиями, что можно объяснить наличием специфических механизмов регуляции генной экспрессии в каждом из них.

Анализ транскрипционных факторов, ассоциированных с изменением экспрессии генов

Результаты поиска транскрипционных факторов, ассоциированных с изменением генной экспрессии в каждом из исследуемых экспериментальных условий, представлены на рис. 3. При адаптации к регулярным силовым тренировкам изменение базальной экспрессии генов в m. vastus lateralis было ассоциировано с разнообразными семействами транскрипционных регуляторов; наиболее обогащенными из них оказались малоизученные факторы с доменами цинковых пальцев. Помимо этого, был выявлен ряд факторов, изменение активности которых после регулярных силовых тренировок было вполне ожидаемо. Так, активация экспрессии генов была ассоциирована с факторами, непосредственно связанными с сократительной активностью, например, NFATC — компонент Ca2⁺-зависимого кальциневрин– NFAT-сигнального пути [27]. Известно, что NFATC1 может контролировать рост мышц [28–30] и соотношение типов мышечных волокон у мышей, а также подавлять активность MyoD-зависимых промоторов [31].

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Регулярные физические упражнения приводят к активации экспрессии генов внеклеточного матрикса, в том числе генов, кодирующих белки — регуляторы ангиогенеза. Среди обнаруженных нами транскрипционных факторов потенциальными регуляторами ангиогенеза являются ERG и SOX18. Известно, что ERG регулирует ангиогенез, контролируя экспрессию E-кадгерина и сигнальный путь Wnt/β-catenin [27]. SOX18 экспрессируется преимущественно в эндотелиальных клетках и регулирует ангиогенез за счет активации их миграции и пролиферации, при этом паттерн экспрессии SOX18 в эндотелиальных клетках совпадает c VEGFA и его рецептором [32]. Среди факторов, ассоциированных с увеличением генной экспрессии, ожидаемо был найден регулятор миогенеза MEF2A, а также MSX2. Неожиданно, снижение экспрессии некоторых генов было ассоциировано с миогенными E-box-связывающими факторами (MYOG, MYF5, MSC), контролирующими дифференцировку миобластов на разных этапах. Можно предположить, что увеличение активности одних миогенных факторов и подавление других связано с изменением фенотипа мышцы после тренировки. Известно, что подобные программы силовых тренировок приводят к преимущественному увеличению размеров мышечных волокон типа II и оказывают слабое влияние на волокна типа I [1].

Функции других транскрипционных факторов, ассоциированных с изменением транскрипционного профиля при регулярных силовых тренировках, оценить сложно. Так, FOXP1 описан как репрессор транскрипции, его сверхэкспрессия вызывает атрофию и потерю мышечной массы у мышей [33]. Помимо этого, FOXP1 ингибирует активность MyoD [34]. RELA и STAT6 известны в качестве регуляторов воспаления, однако они также играют роль в регуляции миогенеза и атрофии [35, 36].

Через 8 ч после однократного упражнения регуляция экспрессии генов была связана, прежде всего, с факторами класса bZIP (семейства факторов раннего ответа JUN, FOS, MAF и др.). Известно, что некоторые из них (ATF4, AP-1 факторы (FOS, JUN), DDIT3, CEBP) активируются при нарушении протеостаза и ЭПР-стрессе [37, 38]. Активация этих факторов достаточно ожидаема, поскольку высокоинтенсивные силовые упражнения вызывают выраженный метаболический и механический стресс; примечательно, что активация этих факторов не обнаружена на более поздних этапах восстановления (24 ч) после однократного тренировочного занятия. Напротив, снижение экспрессии генов на 8-м ч восстановления было ассоциировано с факторами семейства FOXO, которые в мышце регулируют активность убиквитин-протеасомной системы [39–41].

Через 24 ч после упражнения изменение генной экспрессии было ассоциировано с небольшим количеством транскрипционных факторов: увеличение, главным образом, с факторами семейства CEBP, а подавление — с факторами, содержащими домены цинковых пальцев, в частности KRAB-домен содержащий репрессор RBAK.

Таким образом, мы показали, что наборы генов, изменивших экспрессию в ответ на 12-недельную силовую тренировку и на однократное тренировочное занятие, и ассоциированные с ними транскрипционные факторы достаточно уникальны. Это, по-видимому, связано с наличием множества сигнальных путей, регулирующих активацию различных наборов транскрипционных факторов и их генов-мишеней в базальном состоянии после периода регулярных аэробных тренировок и на разных этапах восстановления после однократного тренировочного занятия. Для некоторых транскрипционных факторов, предсказанных в нашей работе, в литературе описана их роль в регуляции миогенеза, что косвенно характеризует корректность используемого нами биоинформатического анализа. Роль других транскрипционных факторов в регуляции миогенеза не столь очевидна. Изучение роли этих факторов в адаптации скелетной мышцы к высокоинтенсивным упражнениям, стимулирующим рост мышечной массы, представляется перспективной задачей.

ВЫВОДЫ

Показаны выраженные изменения в транскриптоме скелетной мышцы в ответ на однократную силовую нагрузку и на 12-недельную силовую тренировку, сопровождаемую ростом силовых возможностей тренируемых мышц. Эти изменения хорошо сопоставимы с результатами других работ со схожими тренировками. Примечательно, что транскриптомные ответы и ассоциированные с ними транскрипционные факторы выраженно различались как через 8 ч и 24 ч после однократной нагрузки, так и после 12-недельного периода регулярных тренировок. Согласно полученным результатам, регуляция экспрессии генов при адаптации к силовым нагрузкам имеет сложный характер, что, по-видимому, обусловлено большим количеством процессов, вовлеченных в регуляцию роста мышечной массы.