Золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus) — грамположительный микроорганизм, являющийся одним из основных патогенов человека и вызывающий широкий спектр клинических проявлений. Этот вид бактерий — основная причина бактериемии и инфекционного эндокардита, а также костно-суставных инфекций, поражений кожи и мягких тканей, плевропульмональных инфекций и инфекций, связанных с использованием медицинских изделий. Стафилококковые инфекции распространены как среди населения, так и в стационарах, а их лечение остается сложной задачей в связи с появлением и широким распространением штаммов с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Показано, что золотистый стафилококк занимает второе место после E. coli по количеству смертей, ассоциированных с антибиотикоустойчивыми штаммами [1].

Штаммы S. aureus реализуют различные механизмы устойчивости к антибиотикам. Среди них выделяют синтез ферментов бета-лактамаз и продукцию белка Pвр2А — альтернативной транспептидазы [2, 3]. Последняя обеспечивает устойчивость к природным и синтетическим бета-лактамам, что привело к появлению клинически важной группы устойчивых штаммов, названной MRSA (от англ. MRSA — methicillin resistant Staphylococcus aureus). Устойчивость к ванкомицину у S. aureus детерминирована образованием толстой клеточной стенки, препятствующей проникновению антибиотика внутрь клетки [4]. Наличие рРНК-метилтрансферазы и других ферментов, модифицирующих антибиотик, обеспечивает устойчивость к аминогликозидам. У штаммов, устойчивых к тетрациклину, часто обнаруживают защитные белки рибосом TetM и TetO [5]. S. aureus способен достигать устойчивости к линезолиду путем модификации мишени для антибиотика. Такая модификация возможна за счет появления и распространения мутантных вариантов гена 23S рРНК [6]. Важную роль в развитии антибиотикоустойчивости золотистого стафилококка играют эффлюксные помпы. Некоторые из них субстрат-специфичны, например, системы эффлюкса Tet(K) и Tet(L) [7]. Другие, напротив, способны распознавать и экспортировать широкий спектр препаратов. У S. aureus последние представлены мембранными белками, принадлежащими к нескольким семействам — ABC (от англ. ATP-binding cassette), MATE (от англ. multidrug and toxin extrusion), MFS (от англ. major facilitator superfamily), SMR (от англ. small multidrug resistance) и RND (от англ. resistance-nodulationcell division) [8]. Отдельно стоит отметить способность S. aureus образовывать устойчивые клеточные агрегаты — биопленки, препятствующие проникновению молекул антибиотика к клеткам. Биопленки также способствуют колонизации золотистым стафилококком различных поверхностей, что обеспечивает протекание инфекций, ассоциированных с медицинскими изделиями [9].

Для эффективного лечения инфекций, вызванных штаммами с МЛУ, в последние годы разрабатывают альтернативные терапевтические подходы, среди которых можно выделить фаготерапию (терапию на основе вирулентных бактериофагов). Бактериофаги (фаги) — вирусы, способные инфицировать бактериальные клетки. Использование фагов как терапевтических агентов имеет ряд преимуществ по сравнению с классической терапией антибиотиками [10]. Так, необходимо отметить высокую специфичность фагов, которая исключает их воздействие на нормофлору и способность к саморепликации, что с высокой вероятностью обеспечивает присутствие агента в очаге инфекции. Механизм действия бактериофагов, как правило, отличен от антибиотиков, что позволяет их применять против антибиотикоустойчивых штаммов. Немаловажным преимуществом считается относительная простота выделения бактериофагов и производства терапевтических препаратов на их основе [11].

Несмотря на потенциальную возможность замены классических антибиотиков бактериофагами, существует ряд сложностей, которые затрудняют массовое использование фаготерапии в клинической практике. Главные ограничения — сложность и высокая стоимость процедур регистрации препаратов на основе бактериофагов и отсутствие утвержденных схем их применения [12]. Следует также отметить возможность развития у бактерий устойчивости к действию фагов и узкий спектр действия бактериофагов или, другими словами, штаммовую специфичность [13].

В качестве одного из основных путей применения бактериофагов в терапии рассматривают их комбинированное использование с антибиотиками. В настоящее время многие эксперименты in vitro и клинические исследования показывают эффективность такого воздействия двух агентов [14, 15]. По мнению ряда специалистов, подобный подход должен существенно снизить нагрузку на процессы регистрации и патентования препаратов [16]. Более того, совместное применение двух разнонаправленных агентов актуально против штаммов с МЛУ [11].

Настоящая работа направлена на обзор актуальных результатов исследований, посвященных изучению терапии инфекций, вызванных S. aureus, с применением бактериофагов и их комбинаций с антибиотиками. Ниже будут рассмотрены исследования, посвященные изучению эффективности пар «фаг–антибиотик» как в лабораторных условиях in vitro, так и на животных моделях in vivo. Будут также продемонстрированы результаты работ по воздействию пары «фаг–антибиотик» на биопленки золотистого стафилококка и случаи комплексной терапии инфекций, вызванных S. aureus.

Результирующие эффекты комбинированного применения бактериофагов и антибиотиков и методы их оценки

Эффективность комбинации антибиотиков и литических бактериофагов впервые была показана в 1941 г. на примере совместного использования бактериофагов с сульфаниламидными препаратами против S. aureus и Escherichia coli [17]. Позже положительные эффекты совместного воздействия были продемонстрированы на животных моделях [18]. Аналогичные результаты были получены и с пенициллином [19]. В ходе комбинированной терапии были достигнуты успехи в лечении таких инфекционных заболеваний, как эндокардит, бактериемия, остеомиелит и перитонит [18, 20].

В свою очередь, сам термин «синергизм» («синергический эффект») был введен значительно позже, только в 2007 г. Было описано увеличение размера зон лизиса культуры E. coli под действием бактериофага в присутствии субингибирующих концентраций антибиотиков (азтреонам, цефотаксим, тикарциллин, пиперациллин, ампициллин, налидиксовая кислота, митомицин С) [21]. Основным объяснением наблюдаемого явления стало повышение продукции частиц бактериофага за счет аномального роста бактериальных клеток в присутствии антибиотиков. Со временем термин «синергизм» приобрел более широкий смысл. Так, под ним стали понимать случаи, когда эффективность комбинации фага и антибиотика в целом значительно превышает сумму индивидуальных эффектов [15, 16]. В некоторых публикациях стали вводить дополнительную терминологию, касаемую положительных эффектов комбинированного воздействия. Например, в одном из исследований такие эффекты подразделяют на аддитивный эффект (от англ. add — добавлять), синергизм и фасилитацию (от англ. facilitate — облегчать), где под аддитивным эффектом авторы понимают результат, при котором совместное применение двух агентов приводит к подавлению роста клеток, равному сумме эффектов каждого компонента по отдельности, под синергизмом — превышение аддитивного эффекта, а под фасилитацией — эффект, когда комбинированное действие дает более значимое подавление бактериального роста, чем наиболее эффективный агент при отдельном введении, но меньшему в сравнении с аддитивным эффектом [15]. Помимо положительного, авторы описывают нейтральный эффект комбинированной терапии, когда совместное использование агентов приводит к снижению количества бактерий, равному наилучшему действию одного препарата, а также антагонизм, при котором комбинированная терапия менее эффективна, чем индивидуальное использование агентов [15].

Развитие интереса к комбинированной терапии привело к разнообразию лабораторных методов оценки ее эффективности. В первых работах по тематике определяли изменения диаметра зоны лизиса, сформированной под действием фага в комбинации с субингибирующей концентрацией антибиотика [21], такой традиционный метод встречается и в современных работах [22]. Однако в настоящее время чаще используют методы, связанные с измерением оптической плотности клеток, зараженных антибактериальными агентами совместно или независимо [13, 15]. Оценку подавляющего эффекта проводят при помощи подсчета площадей под кривыми роста или при оценке оптической плотности культуры через 16–24 ч [13, 15]. Высокая частота применения этого метода обусловлена наглядностью и удобством проведения экспериментов. Менее распространены колориметрические измерения для оценки количества живых клеток после обработки антибактериальными агентами, в том числе и при воздействии на биопленку [23, 24]. Была разработана экспериментальная система непрерывного культивирования, которая позволила не только оценить эффективность комбинированной терапии, но и проследить фармакодинамику процесса [25]. Встречается также описание метода изотермической микрокалориметрии для оценки воздействия фагов и антибиотиков на бактериальную биопленку [26]. Для изучения комбинированной терапии в экспериментах in vivo на животных моделях проводят оценку выживаемости, бактериальной нагрузки, длительности процесса инфекции, измерение размера поражения (отека), гистопатологическое исследование и др. [27–29].

Таким образом, ввиду повышения интереса к совместному применению бактериофагов и антибиотиков, за последнее время были введены новые термины для описания результирующих эффектов и был адаптирован ряд методик для изучения комбинированного подхода.

Комбинированное применение бактериофагов и антибиотиков против S. aureus в экспериментах in vitro

Комбинированный подход с применением бактериофагов и антибиотиков для элиминации S. aureus был продемонстрирован в экспериментах in vitro практически со всеми коммерчески доступными антибиотиками: аминогликозидами (гентамицин), бета-лактамами (оксациллин), гликопептидами (ванкомицин), макролидами (кларитромицин), оксазолидинонами (линезолид), тетрациклинами (тетрациклин), цефалоспоринами (цефтаролин, цефазолин), циклическими пептидами (даптомицин) и др. (табл. 1). В рамках данного подхода, как правило, используют вирулентные бактериофаги семейств Herelleviridae (ранее Myoviridae) и Rountreeviridae (бывшие Podoviridae). При этом бактериофагам семейств Herelleviridae отдают предпочтение, что связано с их широким спектром литической активности (способны лизировать 80–95% штаммов) [30]. В некоторых работах по комбинированному воздействию исследователи используют и умеренные бактериофаги, но только в рамках in vitro экспериментов [31].

Как видно из табл. 1, в качестве антибиотиков в эксперименты включают бактерицидные и бактериостатические препараты различных классов, при этом в значительном количестве работ рассматривают влияние ванкомицина и оксациллина, что связано с их клинической значимостью. Например, было показано, что совместное применение фага Sb-1 (сем. Herelleviridae) с ванкомицином против штаммов VISA (от англ. vancomycin intermediate S. aureus) приводит к синергическому эффекту [33]. Авторы также установили, что использование сочетания двух антибиотиков различных классов (даптомицина либо ванкомицина с цефтаролином; даптомицина либо ванкомицина с цефазолином) с бактериофагом ведет к синергическому эффекту. При этом нужно отметить, что эффект от комбинации «фаг и два различных антибиотика» незначительно отличается от комбинации «фаг и антибиотик» при наличии синергизма в последнем случае. Повышение ингибирования бактериального роста наблюдали и при применении ванкомицина с умеренным бактериофагом Henu2 [31]. На выборке из 27 штаммов было показано, что совместное воздействие фага Sb-1 (сем. Herelleviridae) с различными концентрациями оксациллина в большинстве случаев приводило к положительным эффектам ингибирования бактериального роста, таким как синергизм, аддитивный эффект и фасилитация [15]. Исследователи отмечают, что негативные случаи так называемого антагонизма были крайне редки. Схожие результаты были показаны и для литического бактериофага vB_SauM-515A1: его комбинация с оксациллином в определенных концентрациях улучшала антибактериальный эффект, а антагонизма во всех рассмотренных случаях не наблюдали [14].

Точные механизмы, лежащие в основе синергического эффекта совместного применения фагов и антибиотиков против штаммов S. aureus, до сих пор остаются неясными. Для объяснения данного феномена предлагают различные гипотезы. Например, увеличение выработки фаговых частиц под действием сублетальных концентраций антибиотика, что было показано на примере тетрациклина, линезолида, телитромицина, кларитромицина, цефотаксима и ципрофлоксацина. Сублетальные концентрации этих антибиотиков способствовали увеличению зон фагового лизиса, что может свидетельствовать о повышенной продукции частиц бактериофага [31]. Было показано, что под действием сублетальных концентраций антибиотиков клетки S. aureus демонстрируют набухание, которое в ряде случаев сопровождалось увеличенной продукцией бактериофага SA11 (сем. Herelleviridae) [32]. По мнению авторов, такой синергизм — результат задержки лизиса, вызванной недостатком холина, который необходим для лизиса клетки и дальнейшего высвобождения дочерних вирусных частиц. Другим объяснением синергического эффекта стало преодоление устойчивости к фагам при воздействии антибиотиком. Так, комбинация бактериофага Sb-1 с ванкомицином/даптомицином предотвращала развитие устойчивости к бактериофагам [33]. Кроме того, в системе непрерывного культивирования было показано, что гентамицин индуцирует образование клеток с фенотипом, склонным к агрегации и образованию конгломератов, которые, в свою очередь, наиболее чувствительны к действию бактериофага [25].

В сравнении с синергическим эффектом, антагонизм был отмечен в значительно меньшем количестве публикаций [15, 22, 34]. В отдельных исследованиях антагонизм связывают с применением бактериостатических антибиотиков [22, 34]. Высказанная закономерность кажется вполне разумной, поскольку известно, что бактериостатические антибиотики направлены на ограничение размножения и жизнедеятельности бактериальных клеток без последующего уничтожения путем воздействия на системы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Не исключено, что ингибирующему воздействию в таком случае могут подвергаться и жизненно важные процессы бактериофага.

Дополнительно стоит отметить, что антибиотики в целом снижают плотность бактерий и тем самым — способность фага к репликации.

В то же время можно увидеть противоречия, возникающие при сравнении исследовательских работ разных авторов. С одной стороны, некоторые результаты экспериментов подтверждают идею о штаммо- и фагоспецифичности результирующего эффекта [15]. С другой стороны, разницу эффектов можно связать с концентрациями антибиотика. Так, при использовании бактериостатического антибиотика линезолида в концентрации 10 мкг/мл и фага PYOSa (сем. Herelleviridae) наблюдают антагонистический эффект [34], в то время как в других работах при применении более низких концентраций (1–2 мкг/мл) и фагов Henu2 (умеренный неклассифицируемый) [31] или vB_SauM-515A1 (сем. Herelleviridae) [14], наоборот, проявляется синергизм.

Таким образом, комбинированная терапия имеет весомый потенциал, и в большинстве случаев использование одновременно бактериофага и антибиотиков не снижает их результативности, а в некоторых случаях и повышает ее. В то же время очевидно, что комбинированное воздействие бактериофагов и антибиотиков многомерно и тип результирующего эффекта зависит от ряда параметров: концентраций выбранных агентов, типа антибиотика и штамма бактерии. Для более полного обобщения данных необходимо проведение дополнительных исследований, связанных с поиском корреляций между вышеперечисленными факторами, например, с учетом данных типирования штаммов.

Комбинированное воздействие бактериофагов и антибиотиков на биопленки, сформированные S. aureus

Многие штаммы S. aureus характеризуются способностью образовывать биопленки. Биопленки проявляют повышенную устойчивость к противомикробным средствам за счет наличия сложной пространственной структуры, механически препятствующей проникновению антибиотика, а также изменения фенотипа клеток (образование медленно растущих клеток и клетокперсистеров) [36]. Большинство клинических случаев инфекций S. aureus связаны с образованием биопленок, которые способны колонизировать поверхности органов и медицинских изделий [37–40].

Применение комбинированного подхода против биопленок S. aureus в настоящее время активно изучают (табл. 2).

Ключевой момент для эффективной обработки биопленок антимикробными агентами — это последовательность их введения. Наибольшая эффективность комбинированной терапии показана при последовательной обработке биопленки сначала бактериофагом, а затем антибиотиком. Такой результат предположительно связан со способностью фагов проникать в матрикс биопленки и разрушать его, что приводит к высвобождению планктонных клеток и их последующему уничтожению как антибиотиком, так и фагом [23]. Эти данные подтверждены во многих работах [16, 24]. Были продемонстрированы не только эффективность последовательной обработки биопленки сначала фагом (сем. Herelleviridae), а затем антибиотиком (ванкомицин, цефазолин), но и отсутствие эффекта действия антимикробных агентов при их одновременном использовании, и более того, в случае внесения фага после антибиотиков (ванкомицин, цефазолин, тетрацилин, линезолид) — антагонистический эффект [24]. Описаны также случаи антагонизма при одновременном введении агентов (ванкомицин или тетрациклин с бактериофагом PYO (сем. Herelleviridae)) и синергизма для большинства тестируемых препаратов при их введении после фага [16].

Эффективность поэтапного введения агентов была показана и при применении бактериофагов и антибиотиков против биопленок, образованных двумя видами бактерий (S. aureus и Pseudomonas aeruginosa). Так, введение гентамицина или ципрофлоксацина после бактериофага приводит к полному подавлению роста биопленки [44]. Авторы подчеркнули, что максимальный эффект достигается при введении антибиотиков в высоких концентрациях (8 МИК (минимальная ингибирующая концентрация)). Применение высоких концентраций антибиотиков в случае инфекций, ассоциированных с биопленкообразованием, характерно и для классической антибиотикотерапии. Необходимость использования высоких концентраций антибиотиков в сочетании с бактериофагом для достижения элиминации биопленки также продемонстрирована во многих работах [16, 22, 45]. Концентрации антибиотика в работах варьируют от 2 [16] до 250 МИК [43]. Кроме того, была показана зависимость эффекта элиминации биопленки от концентрации антибиотика, а именно: подавление развития биопленки было прямо пропорционально концентрациям линезолида и тетрациклина и обратно пропорционально концентрациям ванкомицина и цефазолина (до концентрации 128 мкг/мл); в случае других антибиотиков (диклоксациллина и тетрациклина) явной линейной зависимости не наблюдали [24].

Как упоминалось ранее, биопленки играют значимую роль в имплантат-ассоциированных инфекциях. Авторы работы, в которой был успешно применен комбинированный подход для борьбы с биопленками, ассоциированными с медицинскими изделиями, предложили проводить покрытие ортопедических проволок полимером гидроксипропилметилцеллюлозой, несущим смесь бактериофага MR-5 (сем. Herelleviridae) и линезолида. В результате наблюдали не только эрадикацию биопленок, но и снижение адгезии бактериальных клеток. Помимо этого, в данном исследовании было показано, что частота образования устойчивых к бактериофагу мутантов при совместном применении двух агентов снижалась [41].

Исходя из вышесказанного, последовательное введение бактериофага с антибиотиком в высоких концентрациях позволяет достичь элиминации биопленок, и более того, смесь двух агентов может быть применена совместно с полимерным покрытием медицинских изделий. Полученные результаты могут стать основой для создания новых подходов при использовании имплантатов и катетеров.

Исследования комбинированного применения бактериофагов и антибиотиков на моделях инфекций S. aureus и клинические случаи

Разработка новых терапевтических подходов требует подтверждения их эффективности на животных моделях. Оценку совместного использования бактериофагов и антибиотиков проводят как на позвоночных животных, так и беспозвоночных. В случае первых исследователи воссоздают модели различных инфекционных заболеваний, в том числе имплантат-ассоциированные инфекции, пневмонию, эндокардит и инфекции мягких тканей, индуцированных сахарным диабетом. В исследования включают наиболее актуальные на сегодняшний день антибиотики, такие как линезолид, тейкопланин, ванкомицин (табл. 3).

Результаты анализа представленных в таблице работ на животных моделях демонстрируют успешное применение комбинированного подхода для терапии инфекций, вызванных S. aureus. Было показано, что комбинация тейкопланина с литическим бактериофагом Sb-1 способна уничтожать биопленки на катетере, введенном внутривенно [46]. Перспективность комбинированного применения фаговой терапии с антибиотиками была продемонстрирована и в исследовании на крысиной модели эндокардита [29]. В публикации наибольший успех терапии показало сочетание флуоксациллина с фаговым коктейлем, содержащим представителей двух семейств — Herelleviridae и Rountreeviridae. Исследователи отмечают, что у животных, получающих бактериофаг совместно с антибиотиками, инфекционный процесс протекает значительно мягче и длится значительно меньше в сравнении с животными, получающими только антибиотик или бактериофаг [27]. Из представленных исследований исключением стала работа 2018 г., в которой не было обнаружено существенных различий между индивидуальным применением фага или антибиотика с совместным введением двух агентов в модели вентиляторассоциированной пневмонии [28].

В настоящее время все чаще сообщают о клинических случаях применения комбинированной терапии различных инфекций, вызванных золотистым стафилококком. В 2019 г. появилось первое сообщение об успехе комбинированной терапии фаговым коктейлем

AB-SA01 (сем. Herelleviridae) в сочетании с антибиотиками (флуоксациллин, ципрофлоксацин и рифампицин) в случае пациента с инфекционным эндокардитом искусственного клапана [47]. После начала внутривенного введения препарата бактериофагов исследователи наблюдали существенное подавление симптомов (лихорадки, тахикардии, гипотонии и сыпи) с последующим полным выздоровлением. Этот же препарат бактериофагов был успешно использован совместно с цефазолином и миноциклином в случае пациента с инфекционным эндокардитом, ассоциированным со вспомогательным устройством в левом желудочке [48]. Описан также случай успешной терапии инфекции суставного протеза с применением внутривенных инфузий фагового коктейля AB-SA01 и цефазолина в сочетании с хирургическим вмешательством [49]. Во всех вышеупомянутых исследованиях авторы отмечали безопасность использования бактериофагов и не сообщали о побочных эффектах.

Ввиду сообщений об успешном тестировании комбинированной терапии на животных моделях и положительных результатах в клинической практике можно сделать заключение, что совместное применение литических бактериофагов с антибиотиками — многообещающий подход для лечения инфекций золотистого стафилококка различной тяжести.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Применение литических бактериофагов в качестве дополнительного агента к классическим антибиотикам при терапии инфекций S. aureus с МЛУ в последние десятилетия стало актуальным направлением исследований.

Эксперименты in vitro и in vivo демонстрируют, что во многих случаях комбинированное введение фага и антибиотика приводит к значительному снижению роста численности бактерий, в то время как обратный антагонистический эффект встречается значительно реже. Важное преимущество такого подхода состоит, несомненно, в его эффективности в элиминации не только планктонных клеток, но и биопленок, активно формируемых многими штаммами золотистого стафилококка. Обработка бактериофагами и антибиотиками in vitro позволяет значительно повысить восприимчивость и ресенсибилизацию штаммов S. aureus с МЛУ к антибиотикам. В то же время результаты, полученные на сегодняшний день в экспериментах in vitro и in vivo, не являются исчерпывающими и содержат много противоречий, что делает актуальными дальнейшие исследования, направленные на накопление и обобщение данных. Кроме того, для эффективного использования представленного подхода необходим фундаментальный базис, объясняющий механизмы, задействованные в элиминации S. aureus при комбинированном влиянии бактериофага и конкретных антибиотиков. Таким образом, дальнейшие исследования должны включать изучение взаимодействия системы «фаг– антибиотик–бактерия» с привлечением методов системной биологии и омиксных технологий.

Отдельно следует подчеркнуть, что на сегодняшний день продемонстрированы многообещающие результаты применения комплексной терапии на пациентах. Несмотря на это, для ее массового использования необходимо оптимизировать подбираемые дозы двух агентов и проводить дальнейшие клинические исследования (в том числе и двойное слепое плацебо-контролируемое исследование), подтверждающие эффективность и безопасность использования препаратов бактериофагов, произведенных надлежащим образом. Данные работы должны стать основой для разработки рекомендаций по применению бактериофагов в клинической практике.