Достижения последних лет в разработке различных подходов клеточной терапии повреждений хрящевой ткани позволяют лечить некоторые патологии суставов, в том числе связанные с многофакторными поражениями хряща человека [1]. Имплантация аутологичных хондроцитов считается достаточно успешным и многообещающим методом лечения повреждений хрящевой ткани с минимальным риском нежелательных явлений [2]. Принцип этой процедуры заключается в масштабировании и культивировании хондроцитов, полученных из биоптата неповрежденного участка суставного хряща пациента, а затем — пересадке клеток непосредственно в дефект [2]. С момента первого описания имплантации аутологичных хондроцитов в поврежденный участок суставного хряща человека интерес исследователей к клеточной терапии только возрастал [3], и в течение десятилетия появлялись новые методы модификации и оптимизации данного подхода [1]. Использование биомедицинских клеточных продуктов (БМКП) на основе аутологичных хондроцитов демонстрировало преимущество в эффективности по отношению к более традиционным методам — артроскопической санации или микроповреждениям [4–7]. На сегодняшний день ряд БМКП проходит доклинические или клинические испытания разных фаз [1, 2, 6, 8, 9], и несколько продуктов одобрены к применению для терапии очаговых поражений хряща человека [11–14].

Большими преимуществами по сравнению с другими разновидностями БМКП для терапии дефектов суставного хряща обладают сфероиды, которые представляют собой трехмерные структуры, образованные в результате самоаггрегации клеток в определенных условиях культивирования [15]. Так, 3D-условия благоприятно сказываются на пролиферативной активности и фенотипической стабильности зрелых хондроцитов [9]. В отличие от суспензии аутологичных хондроцитов, которые становятся способными к выработке внеклеточного матрикса (ВКМ) только через определенное время после трансплантации, клетки в составе сфероидов способны к секреции компонентов ВКМ еще на этапе культивирования [16, 17]. Кроме того, аутологичные сфероиды не требуют использования посторонних биоматериалов, легко интегрируются в ткань в зоне повреждения, а после имплантации отсутствует необходимость в системной иммуносупрессии [15]. В совокупности перечисленные свойства сфероидных БМКП могут способствовать качественному заполнению дефекта хрящевой ткани. Таким образом, эффективность сфероидов на основе аутологичных хондроцитов была продемонстрирована на животных моделях [17], в клинических исследованиях [18, 19]. Сфероидные БМКП показали значительно больший терапевтический эффект с точки зрения структурного восстановления дефекта хряща по сравнению с процедурой микроповреждений [6, 7].

Один из одобренных на мировом рынке препаратов клеточной терапии восстановления дефектов суставного хряща человека — Spheroxтм (Co.don; Германия) — представляет собой сфероидный БМКП. На данный момент компания ОА «Генериум» по лицензии Co.don производит этот препарат и завершает III фазу клинических исследований в РФ [10]. В это же время аналогов подобных БМКП в Российской Федерации не представлено. Таким образом, единственный продукт, представляющий собой, по сути, трансфер технологии компании Co.don, в настоящее время проходит клинические исследования на территории РФ. Учитывая оптимистичные результаты исследований зарубежных партнеров в области клеточной терапии, развитие и внедрение подобных технологий в исследовательскую и медицинскую практику в РФ представляется очень актуальным.

Основная задача работ с БМКП заключается в поддержании эффективности и соответствии критическим параметрам качества для обеспечения безопасности и ожидаемого эффекта, что необходимо спрогнозировать еще до начала клинических исследований. Поэтому БМКП, как и другие лекарственные препараты, должны отвечать строгим требованиям для одобрения регулирующими органами с целью дальнейших исследований и реализации [8]. Для этого необходимы разработка и проведение соответствующих методов анализа для оценки клеточного продукта до и после имплантации в рамках доклинических испытаний [19, 20]. Так, перед началом доклинических исследований над животными требуется выявить основные факторы риска, такие как туморогенность, онкогенность и биораспределение [21].

Биораспределение — один из важных критериев безопасности, характеризующий миграционный потенциал клеток в составе БМКП после имплантации, способность к образованию эктопической ткани и персистенции в/вне зоне(ы) введения [9, 22–24]. Оценку биораспределения обычно проводят на животных моделях с иммунодефицитом, при этом предпочтительна подкожная имплантация ввиду ее меньшей инвазивности [24]. Поскольку тестируемый продукт по своим свойствам должен быть максимально приближен к финальному варианту БМКП или даже идентичен ему, для оценки биораспределения также желательно избегать применения флуоресцентных меток или каких-либо других подходов, потенциально вносящих изменения в структуру и свойства продукта [8].

Целью настоящего исследования было изучение биораспределения разработанного нами сфероидного БМКП «Хондросфера», предназначенного для терапии поражений суставного хряща у человека, после подкожной имплантации иммунодефицитным мышам линии Balb/c Nude.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Нормативное регулирование

Настоящая работа представляет собой доклиническое исследование нового БМКП и проводилась согласно требованиям действующих нормативных регуляторов [21, 25–27]. Исследование осуществляли согласно утвержденному письменному плану и в соответствии со Стандартными операционными процедурами. Персонал, участвующий в эксперименте, обучен правильному и гуманному обращению с лабораторными животными.

Сфероидные БМКП

Исследуемые БМКП представляли собой 3D-культуру сфероидов на основе хондроцитов человека и были получены с использованием планшета с микролунками Aggre Well 800 (STEMCELL Technologies; Канада) по протоколу производителя. Количество клеток, приходившееся на одну микролунку планшета, составляло 4–5 × 10³. Полученные сфероиды (клеточный или тканеинженерный продукт имеет название «Хондросфера») культивировали в минибиореакторах на орбитальном 3D-шейкере (Infors HT; Швейцария) при 37 °С и 5% СО₂ [28]. В качестве питательной среды использовали Advanced DMEM (Gibco, Thermo Fisher Scientific; США) с добавлением 10 нг/мл bFGF (STEMCELL Technologies; Канада), 100х GlutaMAX (Gibco, Thermo Fisher Scientific; США), 50x B27 (Gibco, Thermo Fisher Scientific; США), 1% инсулин-трансферрин-селенита (ИТС) («ПанЭко», Россия), 50 мкг/мл аскорбиновой кислоты (Sigma Aldrich; США),  50 мкМ β-меркаптоэтанола, 50 мкг/мл плазмоцина, гентамицина («ПанЭко»; Россия) и 10 мл/л 100х-раствора пенициллина/стрептомицина («ПанЭко»; Россия). Культивирование сфероидов проводили в течение 28 суток, смену среды осуществляли раз в 4 суток.

Дизайн эксперимента

В проведенном исследовании безопасности была выбрана инбредная линия мышей Balb/c Nude с иммунодефицитом. БМКП вводили животным (n = 12; 6 самок, 6 самцов) подкожно однократно в область головы в одной дозе в виде пяти сфероидов в физиологическом растворе (группы 1 и 2). Дополнительно 12 мышей (6 самцов и 6 самок) использовали в качестве контрольных животных, которым подкожно в голову вводили 50 мкл физиологического раствора (группы 3 и 4). В течение эксперимента регулярно проводили взвешивание животных, а также замеряли размер инокулята в зоне имплантации. Через 90 календарных дней после введения 12 самок и 12 самцов были подвергнуты эвтаназии декапитацией под ингаляционным наркозом. Затем были извлечены образцы следующих органов и тканей: лимфатические узлы, щитовидная железа, аорта, сердце, легкие, тимус, пищевод, желудок, поджелудочная железа, тонкий кишечник, толстый кишечник, печень, селезенка, почки, мочевой пузырь, надпочечники, головной мозг, семенники, яичники, место введения, кровь, опухоль.

Умерщвленное животное обрабатывали 96% этанолом, все последующие этапы изъятия органов проводили в ламинарном боксе в асептических условиях.

Гистологический анализ

Фиксацию материала проводили в 10% формалине Histosafe (BioVitrum; Россия) в течение 24 ч, затем отмывали от избытков фиксатора под проточной водой 20 мин и пятикратно обезвоживали с помощью модифицированного изопропилового спирта «Блик» («БликМедиклПродакшн»; Россия). Далее образцы заключали в парафин. Гистологические срезы толщиной 4–5 мкм изготавливали на микротоме Microm HM325 (Microm; Германия). Депарафинизацию проводили по схеме: ксилол № 1 — 2 мин, ксилол № 2 — 2 мин, этанол 96% № 1 — 2 мин, этанол 96% № 2 — 2 мин, этанол 70% — 2 мин, дистиллированная вода — 2 мин. Гистологические срезы окрашивали гематоксилин-эозином (Гематоксилин Майера, эозин 1% водный раствор (BioVitrum; Россия)). Полученные препараты исследовали с помощью микроскопа Levenhuk 625 («Левенгук»; Россия).

Выделение геномной ДНК

Для выделения геномной ДНК из органов мышей и капиллярной крови человека, которую использовали в качестве положительного контроля человеческой ДНК, применяли набор «М-СОРБ-ООМ» («Синтол»; Россия) согласно рекомендациям производителя. Для выделения использовали 10–20 мг фрагментов органов или 10–20 мкл капиллярной крови. В качестве отрицательного контроля использовали пробы без образцов органов и тканей. Элюцию геномной ДНК проводили в объеме 400 мкл элюирующего буферного раствора. Конечный объем раствора с выделенной геномной ДНК составил 400 мкл.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

ПЦР проводили на термоциклере для амплификации нуклеиновых кислот CFX96 Touch (Bio-Rad; США) с использованием готовой смеси для ПЦР 5X Screen Mix («Евроген»; Россия) согласно инструкции производителя. В реакции использовали праймеры, специфичные к генам цитохром С оксидазы 1 (CO1), для обнаружения ДНК человека и бета-актина, специфичного для мыши (mActb), для определения мышиной ДНК (табл. 1).

Амплификацию проводили по следующему протоколу:

1. 95 °С — 5 мин;
2. 95 °С — 15 с;
3. 58 °С — 15 с;
4. 72 °С — 30 с.

Этапы 2, 3 и 4 повторяли 40 циклов.

Электрофорез в агарозном геле

Электрофорез ДНК проводили в 1%-м агарозном геле в буфере Tris-Acetate-EDTA (ТАЕ) в камере для горизонтального электрофореза (Biorad; США). Для визуального детектирования продуктов амплификации применяли 0,5 мкг/мл бромистого этидия. Напряжение было выставлено на 120 В, время проведения электрофореза составляло 20 мин. Детекцию продуктов амплификации проводили в ультрафиолете с применением трансиллюминатора (Vilber; Германия).

Статистический анализ

Полученные результаты измерения массы испытуемых животных обрабатывали с помощью пакетов прикладных программ Microsoft Excel (Microsoft; США) и SPSS Statistics 17.0 (IBM; США). Для проверки нормального распределения признака применяли тест Шапиро– Уилка. В качестве метода сравнения использован U-тест Манна–Уитни. При множественных сравнениях применяли поправку Бонферрони. Различия между группами считали статистически достоверными при уровне значимости р < 0,05. Для построения графиков использовали программное обеспечение GraphPad Prism (Dotmatics; США).

Действия с остатками БМКП

Незадействованные в эксперименте БМКП подвергали предварительному автоклавированию и утилизировали как отходы класса Б.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Морфометрический анализ

При регулярном взвешивании в течение 90 суток статистически значимых различий по весу животных не выявлено при сравнении групп, получавших БМКП, и контрольных групп (рис. 1). 

Общеклиническое состояние животных опытных и контрольных групп не отличалось. Животные сохраняли активность и нормальное пищевое поведение.

Гистологический анализ

В результате гистологического окрашивания образцов ткани из зоны имплантации БМКП наблюдали стабильную хрящевую ткань с большим количеством хондроцитов и образованием лакун (рис. 2). Миграция клеток из зоны имплантации была минимальной. 

Детекция ДНК человека в тканях и органах мыши

При анализе образцов цельной крови, образцов тканей и органов мышей ДНК человека была обнаружена только в области закола хондросфер (табл. 2). В остальных тканях и органах самцов и самок мышей следов анализируемого БМКП не было обнаружено (LOQ < 0,001 нг ДНК). Таким образом, характер биораспределения БМКП оптимален для рекомендованного пути введения.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Получение трехмерных сфероидных БМКП на основе аутологичных хондроцитов человека с помощью органоидной технологии представляется достаточно перспективным направлением в создании продуктов для клеточной терапии объемных очаговых дефектов гиалинового хряща [28]. Несмотря на то что разрабатываемый нами продукт аналогичен по составу продукту компании АО «Генериум», его получают по модифицированной технологии, что требует тестирования безопасности. Согласно существующим нормативам, исследование фармакокинетики БМКП включает анализ биораспределения, которое характеризует миграционный потенциал клеток в составе конструкта [27]. Ранее исследователи продукта Spheroxтм в рамках регистрационных мероприятий после консультации с регулятором проводили исследование биораспределения своей разработки при имплантации иммунодефицитным животным [8]. Проведенный с помощью ПЦР анализ показал отсутствие человеческой ДНК в тканях и органах, удаленных от зоны подкожной имплантации. Таким образом, в рамках тестирования безопасности проведение исследования биораспределения БМКП, предназначенного для имплантации человеку, представляется целесообразным с помощью указанного подхода.

Цель нашего исследования состояла в изучении биораспределения разработанного сфероидного БМКП для терапии поражений суставного хряща человека на иммунодефицитных мышах. Насколько нам известно, это первое масштабное доклиническое исследование БМКП на основе аутологичных хондроцитов в РФ.

При изучении биораспределения использовали мышей линии Balb/c Nude. Данная линия иммунодефицитных мышей широко используется в исследованиях ксенотрансплантатов, в том числе на основе хондроцитов человека [29–30]. Мы прибегали к подкожной имплантации сфероидов, поскольку эта процедура менее инвазивна, масштабируема и более проста в реализации, например, по сравнению с имплантацией в сустав мелкого грызуна. Дозу однократного введения БМКП рассчитывали, исходя из предполагаемой терапевтической дозы для человека согласно размеру дефектов хрящевой ткани — 10–70 сфероидов на 1 см2 поврежденной ткани [8]. Для мыши эта доза составила пять сфероидов на одно животное.

Для оценки формирования стабильной хрящевой ткани в месте введения БМКП места закола были исследованы с помощью гистологического анализа. Мы наблюдали образование хрящевой ткани через 90 суток после имплантации, что говорит об успешной интеграции сфероидов в тканях мыши. Морфометрические данные не показали значительных изменений массы тела у опытных групп, что говорит об отсутствии системного патологичного действия. Кроме того, не наблюдали аномального роста ткани, связанного с онкогенными (на 3-й месяц наблюдения) или туморогенными процессами.

Для проверки распределения биоптаты органов и тканей мыши по прошествии 90 суток после имплантации были качественно оценены путем анализа на наличие экспрессии видоспецифичной для человека последовательности гена, кодирующего цитохром С оксидазу 1 (COI). Согласно полученным нами результатам, при однократном подкожном введении БМКП опытным мышам человеческая ДНК детектируется исключительно в месте введения, но не в остальных проанализированных тканях и органах. Таким образом, ДНК человека относится только к клеткам в составе самих имплантированных сфероидов. Тем не менее, в дальнейшем планируется исследование биораспределения и онкогенности БМКП в организме мыши при более длительном сроке после имплантации для оценки возможных отсроченных эффектов. Полученные на данном этапе результаты свидетельствуют об отсутствии процессов клеточной миграции, что позволяет судить о безопасности разработанного продукта по части биораспределения.

ВЫВОДЫ

В настоящей работе мы провели исследование биораспределения БМКП в виде хондросфер на основе хондроцитов человека путем подкожной имплантации мышам линии Balb/c Nude. В ходе исследования наблюдали образование стабильной, морфологически зрелой хрящевой ткани без признаков аномальной пролиферации, а также отсутствие клеточной миграции за пределы области имплантации. Данные результаты позволяют сделать вывод о том, что разработанный БМКП характеризуется нормальным биораспределением в пределах зоны введения и хорошо интегрируется в окружающие ткани. Таким образом, данный продукт клеточной инженерии — «Хондросфера» — может быть рекомендован для дальнейших исследований.