В Уральском научно-практическом центре радиационной медицины Федерального медико-биологического агентства России более 60 лет обследуются люди, которые подверглись хроническому облучению в результате сброса жидких радиоактивных отходов ПО «Маяк» в реку Течу на Южном Урале. Длительное наблюдение за когортами облученных людей приводит исследователей к пониманию сложного взаимодействия факторов радиационной и нерадиационной природы и последующему их влиянию на здоровье человека. Изучение эффектов от воздействия хронического облучения на организм человека остается важной задачей для ученых и медиков, поскольку помогает выявить механизмы действия радиации и предотвратить неблагоприятные последствия облучения [1].

Большой пласт научных работ посвящен изучению механизмов формирования хромосомных мутаций и установлению их роли в эволюции видов, реализации программ онтогенеза, влиянии на состояние органов и тканей в организме человека [2, 3]. Воздействие ионизирующего излучения может быть причиной реализации разных биологических эффектов, к которым относятся также и хромосомные аберрации [4, 5]. Наиболее изученные хромосомные аберрации — транслокации (стабильные аберрации), а также кольцевые и дицентрические хромосомы (нестабильные аберрации). При наблюдении за когортой облученных лиц, подвергшихся сочетанному хроническому облучению (далее — облучению) на Южном Урале, даже через 70 лет после начала воздействия обнаруживают повышенный фон транслокаций и нестабильных хромосомных аберраций по отношению к фоновым значениям [6]. В настоящее время имеются единичные работы, которые указывают на прямую корреляцию между повышенной частотой хромосомных перестроек и наличием заболеваний у человека. В качестве эффекта в части работ рассматривают онкологические заболевания. Исследования показали, что до 70% опухолевых клеток содержат разные типы хромосомных перестроек [7].

В последние годы внимание исследователей направлено на изучение упаковки и поведения хроматина в ядре, так как расширился спектр методов для такого рода работ. На основе данных о частоте разных типов хромосомных перестроек и дифференцированном расположении хроматина внутри ядра клетки в 3D-формате ученые создают модели и прогнозируют влияние различных факторов и генетических мутаций на архитектуру хроматина [8].

Хроматин состоит из гетерохроматиновых и эухроматиновых участков, имеет сложную структуру и компактизацию. Известно, что хромосомные перестройки приводят к перераспределению этих структур по плечам хромосом или между разными хромосомами в ядре, либо к элиминации каких-то участков, что неминуемо сказывается на экспрессии онкогенов, генов-супрессоров и т. д. и на жизнедеятельности клеток.

Из стабильных хромосомных аберраций наименее изучены инверсии вследствие трудоемкости их выявления. Инверсии представляют собой хромосомные перестройки, при которых изменение структуры хромосомы вызвано поворотом на 180° одного из ее участков, и делятся на два класса: перицентрические и парацентрические. Перицентрические инверсии включают центромеру и изменяют структуру хромосом, что позволяет легко их верифицировать при кариотипировании. Парацентрические инверсии обнаружить труднее, так как они не меняют соотношение хромосомных плеч. В основе образования инверсий лежит механизм «разрыв-слияние ДНК» [9].

Биологическая роль инверсий существенна. По данным литературы, инверсии в хромосомах чаще отмечают в клетках опухолевой трансформации, при генетических синдромах у человека, связанных с задержкой развития, аутизмом и эпилепсией [10, 11]. Известно, что инверсии влияют на возникновение кроссинговера между сестринскими хроматидами и сегрегацию хромосом в дочерние клетки, что может приводить к анеуплоидии или гибели клеток [12].

Для выявления инверсий в хромосомах существуют различные методы. Среди цитогенетических подходов наиболее распространено и доступно дифференциальное G-окрашивание (метод GTG). Однако сложность и длительность анализа по времени не позволили широко использовать этот подход для оценки распространенности разных типов инверсий в клетках человека. Современный высокотехнологичный метод определения инверсий в хромосомах — это флуоресцентная in situ гибридизация, в частности, дифференциальное флуоресцентное многоцветное окрашивание хромосомных плеч MBand [13–15]. Метод надежный, но весьма дорогой, чтобы изучать популяционные частоты распространенности инверсий в клетках человека. Для этих целей мы опробовали метод FISH с локусспецифичными теломерными зондами [16]. В ходе анализа длины теломерных районов метафазных хромосом периодически внутри хромосомных плеч обнаруживали флуоресцентные сигналы теломер, что свидетельствует об инверсии хроматина с вовлечением концевых районов хромосом. Пилотные результаты исследования частоты инверсий с вовлечением теломерных районов были представлены нами в предыдущей работе [16], однако для уверенности в полученных данных необходимо было расширить выборку, а затем оценить зависимость показателей от факторов радиационной и нерадиационной природы.

Цель исследования — оценить частоту инверсий с вовлечением теломерных районов метафазных хромосом Т-лимфоцитов у лиц, подвергшихся хроническому сочетанному облучению на реке Теча. Для этого была поставлена задача оценить зависимость частоты инверсий от суммарной дозы от внешнего и внутреннего облучения, а также от возраста на момент обследования и пола.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Характеристика обследованных лиц

В настоящее исследование включали жителей Южного Урала до 1960 года рождения, большинство из которых подверглось облучению в суммарной дозе на ККМ (красный костный мозг) в диапазоне от 0,0001 до 4,7 Гр (рассчитаны по системе TRDS-2016). Эти люди входят в когорту реки Течи либо в когорту внутриутробно облученных лиц. Информация о выборке и состоянии здоровья облученных лиц была предоставлена отделом «База данных «Человек»», индивидуализированные суммарные дозы от внешнего и внутреннего облучения (далее — дозы облучения) на ККМ были рассчитаны по системе TRDS-2016 в биофизической лаборатории, данные о наличии онкопатологии в анамнезе обследуемых лиц были предоставлены эпидемиологической лабораторией ФГБУН УНПЦ РМ [1].

Особенность хронического облучения жителей прибрежных сел реки Течи заключалась в том, что облучение было сочетанным — внутреннее β-облучение и внешнее γ-облучение в широком диапазоне доз. В ходе выполнения исследования было обследовано 29 женщин и 7 мужчин. Критерии включения: возраст от 61 до 81 года. 10 доноров имели высокие дозы на ККМ (от 1 до 4,7 Гр), 12 человек имели дозы на ККМ в диапазоне от 0,3 до 0,9 Гр. Группа сравнения включала двух необлученных человек и 12 облученных с дозами на ККМ от 0,0001 до 0,01 Гр.

Критерии исключения: дата рождения после 1961 г.; наличие в анамнезе аутоиммунных, онкологических, хронических воспалительных заболеваний в фазе обострения; прием в анамнезе цитостатиков, антибиотиков. Характеристика обследованных групп представлена в табл. 1.

Получение препаратов метафазных хромосом Т-лимфоцитов периферической крови

Цитогенетическое исследование проводили на метафазах, стимулированных фитогемагглютинином (ФГА) Т-лимфоцитов периферической крови. Препараты хромосом получали согласно протоколу, который включает четыре последовательных этапа: культивирование клеток до стадии метафазы, гипотоническую обработку клеток, фиксацию метафазных пластинок и приготовление препаратов хромосом [17]. После раскапывания клеточной суспензии предметные стекла сушили при температуре 42 °С на термоплато, затем хранили в морозильной камере при температуре –20 °С до флуоресцентного окрашивания.

Окраска теломерных районов методом флуоресцентной in situ гибридизации с локусспецифичными зондами (FISH)

Инверсии хромосом с вовлечением теломерных районов были оценены с применением теломерных зондов

Telomere FISH Kit/Cy3 (Dako; Дания). Cy3-конъюгированная пептидная нуклеиновая кислота, использованная при изготовлении зонда, представляет собой синтетический аналог ДНК, способный связываться с ДНК хромосом по правилам спаривания оснований. В пептидной нуклеиновой кислоте сахарофосфатный остов заменен нейтральным пептидно-полиамидным остовом, при этом расстояние между основаниями остается точно таким же, как в ДНК. Важно отметить, что зонд этого комплекта не распознает субтеломерные последовательности хроматина и, следовательно, позволяет окрасить только теломерные районы хромосом [18]. Окрашивали хромосомы в соответствии с протоколом производителя зондов. Анализ флуоресцентно окрашенных препаратов проводили на микроскопе Axio Imager Z2 (Zeiss; Германия) с фильтрами DAPI и SpO (Spectrum Orange) с использованием ПО Isis. В анализ включали метафазы, содержащие 46 хромосом без наложений и артефактов. В каждой клетке на предмет поиска инверсий анализировали все хромосомы. Считали по 100 клеток на одного донора, в ходе исследования всего проанализировали 3600 клеток. Оценивали суммарный показатель инверсий по типам и в сумме в 100 клетках, а также среднюю величину по группе. Поскольку в предыдущей работе подробно представлены критерии деления инверсий на хроматидные и хромосомные [16], кратко напомним примеры механизма образования инверсий и их разные типы (рис. 1, рис. 2).

Статистический анализ

Анализ результатов проводили с использованием пакета программ STATISTICA 10 (StatSoft; США). Для статистической обработки результатов пользовались непараметрическим критерием Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Частота встречаемости хромосомных инверсий в диапазоне от 0 до 2 — у 9 человек, а хроматидные инверсии отмечали у всех обследованных в диапазоне от 3 до 26.

У необлученных лиц (таких было 2 человека) инверсии хроматидного типа были отмечены с частотой 6 и 19%, а хромосомные соответственно — 0 и 1%. Соотношение среднего показателя частот хроматидных и хромосомных инверсий соответственно 9:0,3 на 100 клеток (p < 0,001) (табл. 2).

Как видно из табл. 2, частота инверсий в исследуемых группах с ростом дозы облучения на ККМ статистически не отличалась. Низкие значения наблюдали у лиц с наиболее высокими дозами от 1 до 4,7 Гр. Максимальные показатели характерны для инверсий хроматидного типа (частота 9,2, 9,5 и 8,7 соответственно). Хромосомные инверсии встречались с частотой от 0,4 в первых двух дозовых подгруппах и 0,2 в подгруппе людей, подвергшихся облучению в высоких дозах. 

Зависимость частоты инверсий от возраста на момент обследования представлена на рис. 3.

Следовательно, зависимость частоты инверсий от возраста в исследуемом диапазоне от 60–80 лет не выявлена.

Не выявили также зависимости частоты инверсий от дозы облучения ККМ.

Поскольку мужчин в исследуемой выборке было мало, для оценки влияния пола на изучаемый показатель сформировали группу женщин, которых отобрали по типу «случай-контроль» для каждого обследованного мужчины с учетом дозы облучения на ККМ и возраста (табл. 3).

Таким образом, не было обнаружено зависимости частоты инверсий от пола обследуемых людей.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Представленное в настоящей статье исследование продолжает пилотный проект, который начался более 2-х лет назад в лаборатории радиационной генетики УНПЦ РМ в рамках гранта РФФИ. В ходе упомянутого проекта мы оценивали частоту инверсий метафазных хромосом в культивированных Т-клетках периферической крови у облученных жителей Южного Урала [16]. Для этих целей был предложен и апробирован метод флуоресцентной окраски теломерных районов хромосом. В представленной статье была расширена выборка обследуемых лиц и проведен анализ влияния радиационных и нерадиационных факторов на хромосомные перестройки — инверсии с вовлечением теломерных районов хромосом. Оказалось, что расширение выборки подтвердило полученные ранее частоты распространенности инверсий — наиболее часто встречались инверсии хроматидного типа, и их соотношение с хромосомными инверсиями было равно 9 : 0,3.

Очевидно, что хроматидная инверсия образуется в одной из сестринских хроматид после прохождения клеткой синтетической стадии деления клетки, а хромосомная — это результат возникновения инверсии до синтетической стадии, что в итоге приводит к удвоению инвертированной хроматиды в данной стадии. При этом концы плеч сестринских хроматид остаются лишенными теломерных районов, что служит маркером гибели данной клетки. Данный тезис подтверждают более низкие частоты хромосомных инверсий. Если бы клетки могли выживать с такими перестройками, то мы бы видели высокие показатели частот хромосомных инверсий или других перестроек хромосом (например, транслокаций ди- или более центричных хромосом, кольцевых хромосом), чего не было отмечено при анализе препаратов.

Анализ литературы дает основание полагать, что в клетке существуют механизмы элиминации поврежденных хромосом или клеток, что позволяет сохранять целостность хромосом в клетке и генома во всех клетках организма.

Согласно полученным в нашем исследовании данным, большое количество инверсий содержит теломерные повторы. Анализ литературы позволил найти работы, в которых отмечается, что теломерные последовательности встречаются внутри хромосомного хроматина у многих организмов, в том числе и у человека, и известны как «внутренние теломерные последовательности» (ITS) [19, 20]. Эти участки считаются результатом перестроек генома в эволюции кариотипов, что подчеркивает важность их изучения. Есть предположения, объясняющие механизмы встраивания теломерных участков при репарации. Считается, что короткие теломерные повторы могут либо быть вставлены системами репарации двунитевых разрывов, в которые вовлечена теломераза [21], либо появиться в результате репликации, индуцированной двунитевыми разрывами, и таргетного встраивания теломерных последовательностей [22], в основе которого лежит механизм альтернативного удлинения теломер с вовлечением некоторых компонентов гомологичной рекомбинации [23]. Петли, образованные теломерными последовательностями, составляют важную компоненту трехмерной укладки хроматина в ядре, которая, в свою очередь, представляет собой значимый аспект регуляции функционирования всех процессов в геноме [24]. Таким образом, ITL могут опосредовать теломерную регуляцию дистанцированных от теломер областей генома.

Учитывая, что механизм образования инверсий такой же, как и транслокаций — «разрыв-слияние ДНК», — можно предположить, что под действием регуляторных механизмов происходит делеция генов белков, обеспечивающих функцию стабилизации конца хромосомы (например, TRF2), в результате чего и возникает хромосомная перестройка. Вследствие этого хромосома может либо элиминироваться, либо стать кольцевой, либо «спастись» при помощи инверсии. Одноцепочечная теломерная последовательность, оказавшись внутри хромосомы, вероятно, достраивается теломеразой, которая начинает работать за счет взаимодействия РНК-матрицы с затравкой — одиночной цепью. Теломераза добавляет к затравке нуклеотиды в порядке, диктуемом структурой матрицы [25].

Ранее мы привели частоты хромосомных аберраций, которые оценили в группе лиц, подвергшихся облучению в высоких дозах на Южном Урале [16]. Так, в ходе анализа препаратов хромосом чаще всего отмечались хроматидные инверсии — 9%, простые транслокации — 5%, комплексные — 0,6%, и самыми редкими аберрациями были хромосомные инверсии — 0,3%. Учитывая, что в ядре каждая хромосома занимает строго определенное пространство и в норме не пересекается с хроматином других хромосом, становится объяснимым тот факт, что наиболее частые преобразования будут отмечаться в пределах одной хроматиды (хромосомы) [8]. Так, известно, что в клетке человека образуется до 55 000 однонитевых разрывов ДНК, которые в большинстве своем репарируются. Однако если есть нарушения структуры петли хроматина, то при репарации происходит хроматидная инверсия, что подтверждено нами. Понятно, что если речь идет об обмене участками разных хромосом, то более вероятно образование простых транслокаций, чем комплексных перестроек, предполагающих разрывы одновременно в разных хромосомах и их близое расположение для репарационных систем. Согласно полученным нами данным, такие перестройки будут встречаться в 10 раз реже, чем простые транслокации. Редкое обнаружение хромосомных инверсий косвенно подтверждает наше предположение, что эти аберрации летальны для клетки либо подобные хромосомы элиминируются в ходе деления. Данный тезис требует дальнейшего подтверждения.

Таким образом, считаем, что дальнейшее изучение структуры хроматина клеточного ядра, в частности, хромосомных инверсий, важно для понимания того, как гены взаимодействуют друг с другом и каковы биологические механизмы этого взаимодействия на хромосомном уровне.

ВЫВОДЫ

В выборке жителей Южного Урала, подвергшихся сочетанному хроническому облучению в диапазоне поглощенных доз на ККМ от 0,0001 до 4,7 Гр, частота инверсий с участием теломерных районов хромосом Т-лимфоцитов составила от 1 до 26 на 100 клеток. Частота инверсий хроматидного типа соотносится с инверсиями хромосомного типа как 9 : 0,3 на 100 клеток. Не выявлено зависимости частоты инверсий хроматидного и хромосомного типа от суммарной поглощенной дозы на ККМ. Не выявлено зависимости частоты инверсий хроматидного и хромосомного типа от возраста в диапазоне от 60 до 80 лет и пола.