На сегодняшний день достаточно хорошо оценен потенциал генетических факторов в прогнозировании рисков развития злокачественных новообразований (ЗНО). Так, для некоторых видов ЗНО установлены генетические маркеры с высокой степенью надежности, например, мутации в генах BRCA1 и BRCA2 для ЗНО молочной железы и яичников [1], в гене TP53 — для ЗНО молочной железы, легких, желудка и кишечника [2], или в гене ATM — для ЗНО поджелудочной и молочной желез [3]. Тем не менее их вклад в радиационно-индуцированный канцерогенез остается неопределенным из-за полигенной природы ЗНО. Дополнительным подходом к прогнозированию риска развития ЗНО могут быть эпигенетические показатели, один из которых — метилирование ДНК, способное модифицироваться факторами окружающей среды, в том числе ионизирующим излучением.

Эпигенетические модификации, включая метилирование, влияют на экспрессию генов, участвующих в канцерогенезе на разных стадиях: от инициации до прогрессии [4]. В опухолевых клетках регистрируется гиперметилирование как генов супрессоров, так и мобильных генетических элементов, а также онкогенов. Например, гиперметилирование генов супрессоров опухолевого роста было установлено для немелкоклеточного рака легких, колоректального рака, ЗНО молочной железы, предстательной железы и мочевого пузыря [5–7]. Гипометилирование мобильных генетических элементов, таких как Alu и LINE-1, а также отдельных областей генов регистрировали при ЗНО молочной железы, яичников, гепатоцеллюлярном раке и ЗНО желудочнокишечного тракта [8, 9].

Следует отметить, что эпигенетические метки отражают как врожденный генетический фон, так и воздействие факторов окружающей среды, что важно с точки зрения понимания механизмов влияния экзогенных факторов на канцерогенез [10].

Несомненно, метилирование ДНК тканеспецифично, в связи с чем паттерны метилирования, полученные из доступных тканей, например, кровь, не могут быть легко экстраполированы на ткани, в которых развивается рак [11]. Однако это возможно, поскольку соответствие между метилированием ДНК в разных тканях зависит от локуса и степени межтканевой корреляции, кроме того, метильные метки могут наследоваться или возникать на ранних этапах развития, вследствие чего будут определяться во многих тканях [12]. Изменение метилирования в генах, связанных со старением (эпигенетические часы), также может быть ассоциировано с риском развития различных патологий, в том числе рака [13–15].

В литературе имеется информация о разработке алгоритмов прогнозирования риска развития ЗНО на основе анализа метилирования ДНК в клетках крови. Было показано, что алгоритмы анализа фенотипического старения и оценки риска смертности, основанные на уровне метилирования CpG-динуклеотидов ДНК, связаны с возрастом, уровнем белка в плазме крови, курением, а также ключевыми факторами заболевания и могут быть использованы как для оценки общего риска развития ЗНО, так и риска развития различных типов ЗНО (рака легкого, предстательной железы, молочной железы, колоректального рака) [16–18]. В систематическом обзоре опубликованных исследований, посвященных изучению метилирования ДНК крови человека, установлена устойчивая тенденция связи глобального гипометилирования ДНК клеток крови и эпигенетического возраста с повышенным риском развития ЗНО молочной железы [19].

Однако, несмотря на представленные исследования, надежные доказательства предполагаемой связи между моделями метилирования ДНК и риском развития ЗНО все еще отсутствуют.

В связи с тем что остановка клеточного цикла и апоптоз — одни из барьеров на пути клетки к онкотрансформации, в настоящем исследовании была проведена оценка уровня метилирования промоторных регионов генов контроля клеточного цикла и апоптоза (BAX, MDM2, TP53, NFkB1) в крови лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию и впоследствии заболевших ЗНО.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Характеристика обследованных лиц

Исследование уровня метилирования CpG-динуклеотидов в промоторных регионах генов BAX, MDM2, TP53 и NFkB1 в клетках периферической крови проводили у лиц, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию вследствие сбросов жидких радиоактивных отходов в реку Течу производственным объединением «Маяк» в 1950–1960 гг. Для каждого обследованного человека были рассчитаны индивидуальные накопленные дозы облучения красного костного мозга (ККМ) в соответствии с дозиметрической системой TRDST 2016 [20]. Все обследованные люди были разделены на две группы: основная группа — 100 облученных лиц, у которых впоследствии были диагностированы злокачественные новообразования (забор крови у пациентов проводили проспективно в латентном периоде, за 5 лет до развития ЗНО) и группа сравнения — облученные лица без онкологических заболеваний. В настоящем исследовании выбор латентного периода (до 5 лет) был обусловлен тем, что уровень метилирования зависит от разных факторов окружающей среды и может меняться со временем, в результате чего увеличение времени наблюдения могло стать причиной слабой связи с риском развития рака или ее отсутствия. Так, в систематическом обзоре было показано, что в различные периоды наблюдения могут изменяться паттерны метилирования ДНК [19].

Критерии включения людей в обследованные группы: проживание в одном из 41 села, расположенного на побережье реки Течи, в период с 01.01.1950 по 31.12.1960 и наличие рассчитанных индивидуальных кумулятивных доз облучения красного костного мозга на основе дозиметрической системы Techa River Dosimetry System-2016 (TRDS-2016) [20]. Критерии исключения: наличие на момент забора крови аутоиммунных заболеваний, гемобластозов и злокачественных новообразований (в том числе на 2023 г. для группы сравнения).

В основной группе облученных лиц в период с 2002 по 2020 г. были диагностированы следующие виды ЗНО: злокачественные новообразования губы (код по МКБ 10: С00 — 3 случая), органов пищеварения (пищевода: С15 — 1 случай; желудка: С16 — 14 случаев; поперечноободочной кишки С18.4 — 5 случаев; ректосигмоидного соединения: С19 — 3 случая; поджелудочной железы: С25.9 — 8 случаев), органов дыхания и грудной клетки (трахеи, бронха, легкого: С34 — 19 случаев), молочной железы (С50 — 16 случаев), женских половых органов (шейки матки: С53 — 7 случаев; тела матки: С54 — 4 случая; яичника и придатков матки: С56 — 3 случая), мужских половых органов (предстательной железы: С61 — 8 случаев); мочевых путей (мочевого пузыря: С67 — 6 случаев; почек: С64 — 3 случая).

Характеристика исследуемых групп представлена в табл. 1.

Средний возраст обследованных лиц с ЗНО составил 68,3 ± 0,7 лет (от 51 до 86 лет). В группе преобладали женщины (54%). Средняя накопленная доза облучения ККМ в группе лиц с ЗНО составила 731,5 ± 68,3 мГр (диапазон доз: 10,1–3507 мГр).

Количество обследованных лиц в группе сравнения по каждому гену различалось, однако основная группа и группы сравнения были сопоставимы по возрасту на время проведения обследования, половому составу и дозе облучения ККМ (табл. 1).

Методы исследования

Выделенную из образцов замороженной крови геномную ДНК денатурировали и подвергали бисульфитной конверсии с использованием набора реагентов EpiJET Bisulfite Conversion Kit (Thermo Scientific; США) в соответствии с протоколом фирмы-производителя. После обработки ДНК бисульфитом проводили амплификацию с праймерами, специфичными для метилированных участков ДНК. Последовательности праймеров для ПЦР фрагментов промоторных регионов генов BAX, MDM2, TP53, NFkB1 были сконструированы с использованием программы Methyl Primer Express Software V.1.0 (Applied Biosystems; США). Выбор генов был основан на результатах ранее проведенных исследований транскрипционной активности генов и уровня метилирования промоторных участков генов у облученных лиц [21, 22]. 

Олигонуклеотиды были синтезированы фирмой ДНКСинтез (Россия). В табл. 2 представлены последовательности олигонуклеотидов, специфичных для метилированной последовательности ДНК.

Определение статуса метилирования промоторов генов было осуществлено с использованием метода ПЦР в реальном времени с применением анализа кривых плавления высокого разрешения (HRM-анализ). Реакцию проводили в объеме 20 мкл, включающем в себя 5х реакционную смесь qPCRmix-HS («Евроген»; Россия), состоящую из высокопроцессивной Taq-ДНК полимеразы со специфичными моноклональными антителами, красителя SYBR Green I, смеси дНТФ, Mg₂⁺ и ПЦР буфера. ПЦР-РВ проводили с использованием амплификатора StepOnePlus Real-Time PCR System (Thermo Scientific; США). Температурный и временной режимы ПЦР-РВ: первая денатурация (95°, 5 мин), денатурация (95°, 30 с), отжиг (температура отжига для каждого гена представлена в табл. 2, 30 сек.) и элонгация (72°, 30 с) — 50 циклов; построение кривой плавления (95°, 10 с; 60°, 1 мин; 95°, 15 с; 60°, 15 с).

В качестве контролей для оценки метилирования исследуемых CpG-островков промоторных регионов генов использовали подвергнутые бисульфитной конверсии образцы коммерческой, полностью метилированной ДНК CpG Methylated Human Genomic DNA (Thermo Fisher Scientific; США) и неметилированной ДНК Human Genomic DNA: Male (Promega; США). Контроли смешивали в следующем соотношении: 0/100, 5/95, 10/90, 25/75, 50/50, 75/25 и 100/0 соответственно. Уровни метилирования для каждого контрольного образца составили: 0%, 5%, 10%, 25%, 50%, 75% и 100%. Анализ был проведен в программе HRM-Software (Applied Biosystems; США) и основан на сравнении профилей кривых плавления экспериментальных образцов ДНК со стандартами (образцы ДНК с известным уровнем метилирования). На основе стандартов выделяли следующие диапазоны уровня метилирования: 0%; 0–5%; 5–10%; 10–25%; 25–50%; 50– 75%; 75–100%, в которые попадали экспериментальные образцы.

Статистический анализ данных

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием программного комплекса SPSS Statistics 17.0. Для сравнения распределений обследованных лиц по уровню метилирования использовали Хи-квадрат c поправкой Йетса (статистически значимыми считали различия при р ≤ 0,01). Сравнение групп обследованных лиц по уровню метилирования от 0 до 10% и более 10% проводили с использованием точного критерия Фишера. Статистически значимыми считали различия при р ≤ 0,05. Корреляционный анализ с целью оценки влияния дозы облучения ККМ и возраста на уровень метилирования проводили путем расчета коэффициентов ранговой корреляции (R) по Спирмену, статистически значимыми считали корреляции при доверительной вероятности ≤ 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Распределение облученных лиц в латентном периоде развития ЗНО по уровню метилирования промоторных регионов генов BAX, MDM2 и NFkB1 статистически значимо отличалось от группы сравнения (рисунок). Стоит отметить, что у подавляющего большинства обследованных лиц, которые впоследствии заболели ЗНО, уровень метилирования промоторных участков генов BAX, MDM2, TP53 и NFkB1 не превышал 10%, и основные различия в распределении с группой сравнения были характерны для этого диапазона.

Так, доля облученных лиц в латентном периоде развития ЗНО, имеющих уровень метилирования промоторного региона гена NFKB1 от 0 до 10%, составила 100% против 87% в группе сравнения. При этом количество лиц с гипометилированным промотором гена NFKB1 (уровень метилирования 0%) и уровнем метилирования до 5% в группе облученных пациентов, впоследствии заболевших ЗНО, было примерно равным и составило 50% и 49% соответственно, в то время как в группе сравнения 63% имели гипометилированный промотор и только 23% — уровень метилирования от 0 до 5%. Для гена MDM2 различия также находились в диапазоне от 0 до 5%, в основной группе облученных лиц 29% имели гипометилированные промоторы, а у 62% уровень метилирования составил от 0 до 5%, в то время как в группе сравнения распределение было примерно равным, 55% и 41% соответственно. Для гена BAX наблюдали сходную тенденцию, у 98% облученных лиц, находящихся в латентном периоде развития ЗНО, уровень метилирования не превышал 10%, а для 2% было отмечено гиперметилирование промотора гена BAX (уровень метилирования — от 50 до 75%). При этом обращает на себя внимание тот факт, что в группе сравнения регистрировались все диапазоны метилирования промотора гена BAX.

Учитывая небольшое количество случаев в разных диапазонах уровней метилирования, на следующем этапе работы все обследованные лица были разделены на две группы: 1) уровень метилирования до 10%; 2) уровень метилирования более 10% (табл. 3).

Согласно полученным результатам, статистически значимые различия наблюдались только для проапоптотического гена BAX. В группе облученных лиц, которые впоследствии заболели ЗНО, количество человек с уровнем метилирования до 10% было статистически значимо больше по сравнению с контрольной группой (р < 0,00001).

Метилирование — динамический процесс, который может зависеть от ряда факторов, в том числе от возраста и дозы облучения. В связи с этим в обследованных группах был проведен корреляционный анализ связи уровня метилирования с дозой облучения ККМ и возрастом на время обследования. В результате анализа в группе облученных лиц с ЗНО в латентном периоде не было выявлено зависимости изменения паттерна метилирования от дозы облучения ККМ и возраста на момент обследования, при этом в группе сравнения наблюдали слабую отрицательную корреляционную связь уровня метилирования промоторов гена BAX и TP53 и возраста обследованных лиц (R = –0,35; р = 0,002 и R = –0,28; р = 0,02 соответственно) (табл. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В проведенном нами исследовании были изучены гены регуляции клеточного цикла (MDM2, TP53) и апоптоза (BAX, NFkB1). Распределение по уровню метилирования промоторных регионов генов BAX, MDM2 и NFkB1 у облученных лиц в латентном периоде развития ЗНО статистически значимо отличалось от группы сравнения. Однако при анализе частоты встречаемости обследованных лиц с уровнем метилирования промоторов изученных генов до 10% и более 10% статистически значимые различия наблюдали только для гена BAX. Доля лиц с уровнем метилирования от 0 до 10% в группе облученных пациентов, впоследствии заболевших ЗНО, составила 98%, в то время как в группе сравнения доля таких людей не превышала 73%.

Продукт гена BAX — член семейства белков bcl2, участвует в индукции апоптоза и считается потенциальным супрессором опухолей [23]. В норме в ответ на генотоксическое повреждение белок р53 изменяет уровень экспрессии генов, участвующих в митохондриальноопосредованном апоптозе, в том числе активируя ген BAX [24]. В то же время в опухолевых клетках наблюдается подавление проапоптотических генов, что способствует выживанию и метастазированию опухоли. Важно отменить, что снижение концентрации белка bax связано с мутациями в гене Tp53 [25]. По результатам проведенных нами исследований, у облученных людей в латентном периоде развития ЗНО наблюдается гипометилирование промотора гена BAX в клетках крови, что, вероятно, может отражаться на транскрипционной активности этого гена.  Интересно отметить, что в ранее проведенных исследованиях экспрессии мРНК апоптотических генов у лиц, облученных на реке Тече с накопленными дозами облучения ККМ, превышающими 522 мГр, было обнаружено статистически значимое увеличение транскрипционной активности гена BAX. [21]. Кроме того, по результатам исследования гибели лимфоцитов периферической крови, у жителей прибрежных сел реки Течи наблюдали повышение частоты апоптоза лимфоцитов у облученных лиц с облигатными формами предраковых заболеваний по сравнению с облученными людьми без предраков [26].

В литературе встречается достаточно много работ, посвященных изучению профиля метилирования ДНК в раковых клетках, при этом наиболее часто рассматривают рак толстой кишки, молочной железы и легких [27]. При этом ретроспективных работ, посвященных изучению метилирования ДНК нормальной ткани (например, крови) до возникновения заболевания, с целью поиска предикторов риска развития рака, существенно меньше и в большинстве из них рассматривают гены, связанные с изменением хронологического возраста (эпигенетические часы) [13, 15, 17]. Однако есть единичные исследования протоонкогенов и генов-супрессоров опухолей. Так, в результате анализа паттерна метилирования 17-ти геновкандидатов предрасположенности к раку молочной железы, включая гены регуляции клеточного цикла, было выявлено гиперметилирование внутригенного повторяющегося элемента гена ATM в крови женщин c раком молочной железы по сравнению с контрольной группой [28].

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты демонстрируют потенциальную возможность использования эпигенетических модификаций (уровень метилирования) в ДНК периферической крови в качестве маркера радиационно-индуцированного канцерогенеза. Кроме того, выявление эпигенетических изменений в тканях и клетках, не вовлеченных в патологический процесс, позволяет прояснить причинно-следственную связь возникновения патологических состояний. Однако для установления эпигенетических маркеров канцерогенных эффектов облучения требуется проведение дополнительных исследований на расширенной выборке пациентов, с учетом анализа уровня метилирования генов в опухолевой ткани.

ВЫВОДЫ

Распределение по уровню метилирования промоторных регионов генов BAX, MDM2 и NFkB1 у облученных лиц, подвергшихся аварийному хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию в диапазоне доз облучения ККМ от 10,1 до 3507 мГр и находящихся в латентном периоде до манифестации ЗНО, статистически значимо отличалось от группы сравнения. Доля лиц с уровнем метилирования промоторного региона гена BAX от 0 до 10% была статистически значимо больше и составила 98% относительно группы сравнения, в которой доля таких людей не превышала 73%. Не выявлено зависимости уровня метилирования промоторных регионов изученных генов от дозы облучения ККМ.