Клинико-диагностические лаборатории (КДЛ) всего мира постепенно переходят к персонализированной медицине [1]. Она представляет собой современный подход к охране здоровья, который учитывает индивидуальные особенности каждого пациента, включая генетические маркеры и вариативные фенотипические признаки. Такой подход позволяет более точно диагностировать заболевания, подбирать оптимальные методы лечения и профилактики, а также снижать риск развития осложнений [2]. Внедрение персонализированной медицины и специализированных КДЛ позволит повысить качество оказания медицинской помощи, снизить затраты на здравоохранение и улучшить прогноз для пациентов [3].

Говоря о персонализированной медицине, нельзя обойти вниманием одно из заболеваний, которое называют неинфекционной пандемией 20–21 в. В 2022 г. в мире насчитывалось почти 9 млн человек, страдающих сахарным диабетом (СД) [4]. Причем отмечают рост числа не только лиц, страдающих СД 2-го типа, но и пациентов с СД 1-го типа [5]. Предупредить или облегчить течение СД 2-го типа и его осложнений возможно путем изменения образа жизни и питания, увеличения физической активности. А вот повлиять на развитие СД 1-го типа пока не удается. Особое внимание хочется уделить осложнениям СД. Основной причиной смертности у пациентов с СД 1-го и 2-го типа становятся сердечнососудистые заболевания, риск которых увеличивается в 2–4 раза при появлении диабетической нефропатии (ДН) [6, 7]. ДН — грозное осложнение СД, потому что клинические симптомы проявляются только на самых поздних стадиях. Согласно исследованиям, на ранних стадиях хроническую болезнь почек (ХБП) пропускают у 20% пациентов [8]. ДН у пациентов с СД 1-го типа в среднем появляется через 10 лет от манифестации заболевания. В случае декомпенсации СД эта медиана сдвигается, и ХБП прогрессирует на более ранних сроках [9]. У пациентов с СД 2-го типа рекомендовано проводить оценку тяжести ДН сразу при постановке диагноза СД. Связано это с тем, что из-за мягкой манифестации СД 2-го типа пациенты могут длительно находиться в состоянии гипергликемии, что и оказывает негативное влияние на функцию почек. Отсутствие возможности использования современных нефропротективных препаратов (блокаторов натрий-глюкозного котранспортера 2-го типа; агонистов глюкагоноподобного пептида-1, тиазолидиндионов), которые замедляют прогрессирование ХБП, — важная проблема у пациентов с СД 1-го типа. Использование данных препаратов у пациентов с СД 1-го типа недостаточно изучено и на данный момент противопоказано [10]. Для лиц с СД 2-го типа, наоборот, использование нефропротективных препаратов оказывает положительный эффект на течение ДН, поддерживая скорость клубочковой фильтрации (СКФ) и снижая альбуминурию [11]. В клинической лабораторной диагностике есть методы оценки тяжести диабетических осложнений, в частности, ДН. Однако все они (определение фильтрационной функции почек с помощью креатинина расчетными методами, альбумин/ креатининового коэффициента в разовой порции мочи, микро/макроальбуминурии в суточной моче, цистатина С и др.) эффективны при уже наступившей ХБП. Нет четких маркеров, предупреждающих врачей о вероятности тяжелого течения диабета и его осложнений, в частности, ДН. На наш взгляд, информировать врача о риске осложнений и о тяжести течения диабета могут молекулярно-генетические маркеры. Среди всего множества генов важно выбрать те, которые с высокой чувствительностью и специфичностью будут влиять на течение ДН. Ведущие диабетологи нашей страны описали важность поиска полигеномных ассоциаций, а не индивидуальных генов, и в качестве одних из генов-кандидатов выделили гены, ответственные за антиоксидантную защиту [12]. Введение в клиниколабораторную диагностику точечных генетических ассоциаций позволит врачу определять степень риска тяжелого течения диабета и его осложнений, своевременно проводить профилактику данных осложнений, интенсифицировать сахароснижающую терапию, увеличивать количество профилактических осмотров пациентов, делая упор на профилактику и выявление того осложнения, которое генетически определено. А это представляет собой базовое звено персонализированной медицины в целом и персонализированной клиниколабораторной диагностики в частности.

При поиске возможных генов-кандидатов, участвующих в патогенезе ДН, мы заинтересовались ролью гена GSTP1 (I105V). Данный ген кодирует фермент глутатионS-трансферазу (GST) — один из основных участников процесса биотрансформации ксенобиотиков. В норме GST содействует взаимодействию глутамата с электрофильными атомами азота (N), углерода (C), серы (S) и кислорода (O) и обеспечивает конъюгацию сульфидгидрильной группы с молекулами ксенобиотиков. Процесс детоксикации, осуществляемый GST, служит ключевым в защите клеток от пероксидации липидов и алкилирования белков, что повышает устойчивость к гипоксическим состояниям [13]. Полиморфизм I105V (A>G) гена GSTP1 связан с заменой нуклеотида аденина (А) на гуанин (G), что приводит к замене аминокислоты в пептидной цепи фермента, вызывая снижение его активности и, соответственно, увеличение накопления свободных радикалов в организме. У носителей генотипа G/G наблюдают повышенный риск развития различных форм рака легких и ротовой полости [14]. Полиморфизм также связан с предрасположенностью к лейкемии и болезни Паркинсона. Известны делеционные полиморфизмы (GSTM (del), GSTT1), которые определяют функционально неактивные нулевые аллели. Предполагают, что у индивидуумов с гомозиготным состоянием этих делеций снижена способность детоксикации химических веществ. Чаще всего эти полиморфизмы обнаруживают у женщин с эндометриозом и у людей с аллергическими заболеваниями [15]. В последнее время стало известно об исследованиях, в которых ген GSTP1 (I105V) вместе с генами транспортера гликопротеина P (MDR1), органических катионов (OCT1) и органических анионов (OATP-C, OAT1, OAT3) оказывает влияние на фармакокинетику лекарственных препаратов [16].

Цель данной работы — выявление молекулярногенетических маркеров, определяющих тяжесть течения диабетической нефропатии у пациентов с СД 1-го и 2-го типа на основании изучения гена GSTP1 (I105V).

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Исследование было проведено на базе кафедры эндокринологии факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов ФГБОУ ВО «Кубанский Государственный медицинский университет МЗ КК». Набор пациентов осуществляли на базе Краевой клинической больницы скорой медицинской помощи г. Краснодара. В это открытое проспективное когортное исследование был включен 51 человек с СД 2-го типа и 49 человек с СД 1-го типа. Критерии включения в исследование: возраст пациентов — от 20 до 60 лет; длительность течения СД 1-го и 2-го типа от — 10 до 15 лет; уровень гликированного гемоглобина — 7,0–9,5%; уровень скорости клубочковой фильтрации более 45 мл/мин/1,73м², вне зависимости от уровня суточной альбуминурии; использование в качестве сахароснижающей терапии препаратов без нефропротективного эффекта (бигуаниды; препараты сульфонилмочевины; ингибиторы дипептидилпептидазы 4-го типа; инсулин); отсутствие тяжелых сопутствующих заболеваний на момент исследования.  Лица, не соответствующие данным критериям, были исключены из исследования. Была также сформирована контрольная группа из 20 условно здоровых доноров (13 женщин и 7 мужчин), не являющихся родственниками пациентов основной группы и не имеющих в анамнезе СД и патологии почек.

Клинико-лабораторные исследования проводили на основе образцов сыворотки крови, полученных при центрифугировании пробирок с полной венозной кровью со скоростью 3 тыс. об./мин в течение 5 мин при комнатной температуре. Уровни глюкозы натощак и постпрандиальной гликемии, а также общий анализ крови, биохимический анализ крови оценивали на анализаторе Konelab (Thermo Fisher Scientific; Финляндия), общий и суточный анализ мочи оценивали у пациентов на биохимическом анализаторе SYNCHRON СХ9 PRO (Beckman Coulter; США) иммунотурбидиметрическим методом. Расчетным методом по формуле CKD-EPI оценивали уровень СКФ (мл/мин/1,73 м²).

Состояние баланса в системе про-/антиоксидантов организма наблюдаемых пациентов и контрольной группы оценивали по активности ферментов системы антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы (СОД) [17], каталазы (КАТ) [18], глутатионтрансферазы (GSТ) [19], уровень малонового диальдегида (МДА) [20]). Определение активности СОД осуществляли по способности ингибировать реакцию аутоокисления адреналина в щелочной среде. Измерение скорости реакции оценивали спектрофотометрическим методом, исходя из полученной оптической плотности высвобождающихся продуктов аутоокисления адреналина в исследуемом образце и в сравнении полученных данных при его отсутствии в исследуемом образце крови.  Измерение КАТ в гемолизате осуществляли фотометрически, и оно было основано на способности разрушать Н₂О₂. Суть метода определения GSТ заключалась в способности восстановленного глутатиона (который присутствует в субстрате — 1%-м гемолизате эритроцитов пациента) связываться с 1-хлор-2,4динитробензолом, образуя стойкий хромогенный конъюгат в щелочной среде. Качественную реакцию по уровню оценки МДА в гемолизате и измерение его концентрации производили посредством добавления тиобарбитуровой кислоты в присутствии хлоруксусной кислоты.

Молекулярно-генетическое исследование гена GSTP1 (I105V) происходило в лаборатории молекулярногенетических исследований ФГБОУ КубГМУ МЗ КК, г. Краснодар. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) из лейкоцитарной фракции в режиме реального времени — real time (ПЦР-РВ) — на амплификаторе RotorGene (QIAGEN; Германия) выполняли генотипирование локуса I105V гена GSTP1. С образцом выделенной ДНК параллельно проводили две реакции амплификации — с двумя парами аллель-специфичных праймеров. Прибором автоматически осуществляли детекцию продуктов амплификации в каждом цикле амплификации. По полученным данным управляющая программа строила кривые накопления флуоресцентного сигнала по заданному для образцов каналу. Результаты анализа позволяли дать три типа заключений: гомозигота по аллели 1; гетерозигота; гомозигота по аллели 2.

Статистический анализ

Достоверность различий в распределении частот генотипов между группами пациентов с СД и здоровых лиц оценивали по тесту χ², количественные показатели в клинических характеристиках пациентов — по критерию Стьюдента. Расчеты выполнены с помощью программы BIOSTAT. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05. Для определения соответствия распределению Харди–Вайнберга были рассчитаны частоты для каждого варианта аллелей и соответствующий им уровень χ². Критическое значение χ² превышало рассчитанные значения по каждой группе, что говорит о том, что равновесие Харди–Вайнберга сохранялось.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

У пациентов с СД 2-го типа были обнаружены следующие процентные соотношения носителей полиморфизмов гена GSTP1 (I105V): 25,5% гетерозиготных носителей (ILE/VAL), 62,7% гомозиготных носителей по аллелю 1 (ILE/ILE) и 11,8% гомозиготных носителей по аллелю 2 (VAL/VAL). У пациентов с СД 1-го типа доля пациентов с гетерозиготным (ILE/VAL) вариантом гена составила 34,7%, гомозиготным по аллелю 1 (ILE/ILE) — 65,3%, а гомозиготных по аллелю 2 выявлено не было. Эти данные существенно отличаются от контрольной группы, где 65% были гетерозиготными носителями (ILE/VAL), 35% — гомозиготными носителями (ILE/ILE) и не было обнаружено носителей гомозиготы по аллелю 2 (VAL/VAL) (табл. 1).

Далее мы приступили к изучению зависимости функции почек от варианта генетического полиморфизма исследуемого гена. У пациентов с СД 2-го типа значимых различий в уровне СКФ и суточной альбуминурии между гетерозиготными носителями (ILE/VAL) и гомозиготными носителями по аллелю 1 (ILE/ILE) гена GSTP1 выявлено не было. Средний уровень СКФ в подгруппах гомозиготного и гетерозиготного полиморфизма у лиц с СД 2-го типа составил 64 мл/мин/1,73 м², а средний уровень белка в суточной моче — 0,18 г/л. Однако пациенты с СД 2-го типа — носители редкой гомозиготы по аллелю 2 (VAL/VAL) — имели значительно худшие показатели: средний уровень СКФ в этой подгруппе составил 48 мл/мин/1,73 м², средний уровень альбуминурии в суточной моче — 0,9 г/л. По остальным биохимическим показателям крови статистически значимых различий между аллельными вариантами исследуемого гена у лиц с СД 2-го типа выявлено не было.

При оценке аналогичных показателей у гомо- и гетерозиготных носителей полиморфизмов гена GSTP1 (Ile105Val) в группе пациентов с СД 1-го типа значимых различий в показателях функции почек (СКФ и уровень суточной альбуминурии) получено не было. Зато было выявлено статистически значимое повышение уровня триглицеридов в 1,6 раз и повышение уровня гликированного гемоглобина в 1,1 раз у гетерозиготных носителей (ILE/VAL) гена по сравнению с гомозиготными носителями (ILE/ILE) (р < 0,05) (табл. 2).

Сравнение показателей функции почек между пациентами с СД 1-го типа, 2-го типа и группой контроля не проводили, так как контрольная группа была представлена здоровыми лицами.

На следующем этапе мы приступили к изучению зависимости активности ферментов антиоксидантной защиты (АОЗ) и уровня МДА от варианта генетического полиморфизма исследуемого гена. Наиболее значимое повышение активности ферментов АОЗ (каталазы и супероксиддисмутазы) у пациентов с СД 2-го типа было отмечено у гомозиготных носителей по аллелю 1 по сравнению с гетерозиготными и гомозиготными по аллелю 2 носителями полиморфизмов гена GSTP1. Однако уровень средних конечных продуктов гликации — МДА — в подгруппе носителей редкой гомозиготы по аллелю 2 (VAL/VAL) был значительно выше (100,5 мкмоль/л), чем при других полиморфизмах (р < 0,001) [21].

У пациентов с СД 1-го типа носители гетерозиготного полиморфизма (ILE/VAL) гена GSTP1 имели более высокий уровень МДА, ГSТ и каталазы по сравнению с гомозиготными носителями полиморфизма данного гена (р < 0,001, р < 0,001, р < 0,05).

При сравнении полученных данных между пациентами с СД 1-го типа, 2-го типа и контрольной группой закономерно было выявлено статистически значимое преобладание активности ферментов АОЗ и уровня МДА у лиц с СД (табл. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исходя из проведенного исследования, можно сделать вывод, что процент встречаемости гетерозиготного полиморфизма (ILE/VAL) гена GSTP1 у лиц с СД 1-го и 2-го типа достоверно более высокий, чем у лиц из группы контроля. По обоим полиморфизмам распределение генотипов соответствовало равновесию Харди–Вайнберга и значительно не отличалось от данных SNP database [22]. Кроме того, у лиц с СД 2-го типа был выявлен редкий генотип Val/Val, чего не было отмечено ни у одного из исследуемых пациентов с СД 1-го типа и контрольной группы (χ²  = 6,572, р = 0,039).

Пациенты с СД 2-го типа — носители редкого гомозиготного по аллелю 2 (Val\Val) варианта полиморфизма гена GSTP1 — имели более высокие уровни МДА (маркера свободно-радикального окисления) и более высокую активность ферментов окислительного стресса. В одном из исследований была продемонстрирована четкая взаимосвязь данного варианта полиморфизма с развитием СД 2-го типа, однако его влияния на развитие такого осложнения, как диабетическая полинейропатия, доказано не было [23]. В нашей работе у пациентов c редкой гомозиготой по аллелю 2 было отмечено достоверно более тяжелое течение ДН (средняя СКФ — 48 мл/мин/1,73 м²; средний уровень альбуминурии в суточной моче — 0,9 г/л). Вероятно, это связано с тем, что именно данный генетический вариант приводит к сниженной активности вырабатываемого белка — GST, что не обеспечивает адекватную детоксикацию ксенобиотиков и приводит к повышению активности свободнорадикального окисления. Это проявляется повышением уровня маркера свободнорадикального окисления — МДА. Так формируются условия для активного протекания перекисного окисления липидов во всех клетках, но особенно в наиболее чувствительных к гипоксическому повреждению — нефронах. Многокомпонентное повреждение структуры нефронов приводит к снижению фильтрационной функции почек (повышение креатинина и снижение СКФ) и реабсорбционной функции почек (повышение суточной альбуминурии) в когорте пациентов с СД 2-го типа. Аналогичные данные были получены и в исследовании, в котором авторы подтвердили взаимосвязь между редким гомозиготным полиморфизмом (VAL/VAL) и терминальной стадией почечной недостаточности [24].

У гетерозиготных (ILE\VAL) носителей гена GSTP1 (I105V) с СД 1-го типа отмечен статистически значимо более высокий уровень активности ферментов АОЗ и уровень МДА по сравнению с гомозиготными полиморфизмами. GST, как антиоксидантный фермент, защищает ткани от окислительного повреждения, типичного для многих патологических состояний, особенно таких, как СД 1-го типа и его хронические осложнения. Вероятно, именно в гетерозиготном состоянии данный полиморфизм является более патогенным. Похожие результаты были получены и в работе, где была выявлена взаимосвязь между данным генетическим полиморфизмом и развитием диабетического осложнения — кардиальной автономной полинейропатии — у пациентов с СД 1-го типа [25]. У пациентов с СД 1-го типа и гетерозиготным вариантом полиморфизма также наблюдают статистически значимое повышение уровня триглицеридов в 1,6 раз. Судя по этим данным, можно предположить, что у гетерозиготных носителей снижена активность триацилглицероллипазы, что приводит к замедлению процесса распада триглицеридов. Это обусловлено влиянием окислительного стресса и некоторых гормонов, таких как норадреналин, адреналин, глюкагон и др. Отмечено, что активность данного фермента может изменяться под воздействием указанных факторов [26]. Кроме того, у данной подгруппы пациентов также статистически значимо определяли более высокий уровень гликированного гемоглобина, что также коррелировало с повышением уровня МДА и повышением активности КАТ и GST.

ВЫВОДЫ

В основе персонализированной медицины лежит индивидуальный подход к особенностям каждого пациента. Введение в клинико-лабораторную диагностику молекулярно-генетического исследования гена GSTP1 (Ile/Val) позволит выявлять пациентов с СД 1-го и 2-го типа с высоким уровнем окислительного стресса и повышенным риском тяжелого течения ДН. В клинической лабораторной диагностике при СД 1-го типа рекомендовано определять гетерозиготный (ILE\VAL) вариант гена GSTP1 (I105V), который сочетается с повышением уровня свободнорадикального окисления и активностью ферментов АОЗ, а также может приводить к статистически значимо более высокому уровню гликированного гемоглобина и триглицеридов. А для пациентов с СД 2-го типа рекомендовано определять редкий гомозиготный по аллелю 2 (VAL\VAL) вариант гена GSTP1 (I105V), который сочетается с повышением уровня свободнорадикального окисления и повышением активности ферментов окислительного стресса, а также со снижением функции почек (увеличением суточной альбуминурии и снижением СКФ). Данные исследования также могут лечь в основу создания генетической панели, в составе которой будут определены полигенные последовательности, увеличивающие достоверность и более точно прогнозирующие тяжесть течения и сроки наступления диабетических осложнений. Однако для этого необходимо расширять исследования в данной сфере.