Механизмы формирования лимфопении различны, включая нарушение созревания и дифференцировки лимфоцитов, угнетение их выхода из лимфоидных тканей, усиление миграции в ткани, а также гибель лимфоцитов при повышении их чувствительности к комплементопосредованному цитолизу, активации апоптоза и некроза. Проживание в неблагоприятных условиях Севера связано с необходимостью адаптации к воздействию низких температур, что приводит к снижению резервных возможностей организма. Холод оказывает влияние на морфофункциональное состояние тимуса, это проявляется в его гипотрофии и снижении числа лимфоцитов, повышении активности апоптоза, что в дальнейшем регистрируют как лимфопению в периферической крови [1, 2]. Холодовой стресс приводит к истощению лимфоидной ткани слизистых оболочек и нарастанию в них дегенеративных процессов, таким образом снижается эффективность защиты «входных ворот» инфекции [3, 4]. Снижение активности клеточных и гуморальных реакций у северян проявляется в большей частоте острых и хронических инфекционных заболеваний, аллергий, аутоиммунных процессов и злокачественных новообразований [5–7]. При патологическом течении лимфопения сопровождается высоким уровнем провоспалительных цитокинов IL6 и TNFα, приводящих к активизации апоптоза лимфоцитов, формируя деструктивную петлю положительной обратной связи [8]. У людей, проживающих в экологически неблагоприятных регионах и экстремальных климатических условиях, часто выявляют бессимптомные лимфопении, на севере в периоды минимального светового дня частота регистрации лимфопений у взрослых людей трудоспособного возраста достигает 19,86% [9–11]. Комплекс неблагоприятных климатических факторов, оказывая стрессовое влияние на организм, нарушает нормальное функционирование иммунной системы. Длительное снижение числа функционально активных лимфоцитов, обеспечивающих формирование защитных иммунных реакций, значительно повышает риск тяжелого течения инфекционных заболеваний и перехода их в хроническую форму.  В ответ на холодовое воздействие наиболее быстро изменяется метаболическая активность с повышением биохимических показателей, в том числе концентрации свободных жирных кислот, С-реактивного белка, глюкозы и др. [12]. Факторы врожденного иммунитета наиболее устойчивы к влиянию общего охлаждения, в то время как для лимфоцитов глюкоза служит необходимым субстратом для повышения их энергообеспеченности и активного функционирования. Цель исследования — сравнить особенности реактивности иммунных показателей в ответ на общее охлаждение в зависимости от фонового уровня лимфоцитов.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Проведено изучение гематологических и иммунологических показателей у 203 волонтеров до и сразу после общего охлаждения в двух группах в зависимости от фонового уровня лимфоцитов периферической крови. В исследование были включены практически здоровые лица трудоспособного возраста, которые не имели на период исследования острых и обострения хронических заболеваний, а также ранее и в настоящее время не занимались закаливанием. Лица трудоспособного возраста, которые имели на период исследования острые хронические заболевания и их обострения, ранее и в настоящее время занимались закаливанием, были, соответственно, исключены. В исследовании волонтеры находились в течение 5 мин в холодовой камере (УШЗ-25Н; Россия) при –25 °С в хлопковой одежде под постоянным видеонаблюдением. Первая группа — с наличием фоновой лимфопении (n = 70, из них 59 женщин и 11 мужчин). Содержание лимфоцитов — 1,26 (1,09–1,37) × 10⁹ кл./л. Вторая группа — с содержанием лимфоцитов в периферической крови в пределах физиологической нормы (n = 133, из них 94 женщины и 39 мужчин). Уровень лимфоцитов — 2,08 (1,81–2,45) × 10⁹ кл./л (р^1-2 < 0,0001). У обследованных до и сразу после общего охлаждения проводили измерение температуры лба и тыльной стороны ладони, артериального давления и частоты сердечных сокращений. Забор крови проводили с помощью квалифицированного медперсонала до и сразу после нахождения в холодовой камере из локтевой вены в вакуумные пробирки Vaccuette с этилендиаминтетрауксусной кислотой для получения плазмы и проведения гематологических исследований; с активатором свертывания крови — для получения сыворотки. Сыворотку и плазму отделяли центрифугированием. Образцы однократно замораживали при температуре –20 °С. Лейкограмму и гемограмму определяли на гематологическом анализаторе XS-500i (Sysmex; Япония). Методом иммуноферментного анализа определяли содержание ферритина (ORGENTEC Diagnostika; Германия), лактоферрина (HycultBiotech; США), трансферрина (AssayPro; США), IL6, IL1β и TNFα (Bender MedSystems; Австрия), эритропоэтина («Вектор Бест»; Россия), ирисина (BioVendor; Чехия), оценку результатов проводили на иммуноферментном анализаторе Multiskan FC (Thermo Fisher Scientific; Финляндия). Уровень апоптоза и некроза лимфоцитов определяли на проточном цитофлуориметре Epics XL (Beckman Coulter; США) методом двойного окрашивания аннексином-V (AnV) и пропидиумом йодидом (PI), с учетом не менее 5000 клеток. Оценку результатов проводили по окрашиванию клеток: живые клетки — AnV-/PI-, апоптоз — AnV+/PI-, некроз — AnV-/PI+. Результаты исследования обработаны с использованием пакета прикладных программ

Statistica 6.0 (StatSoft; США). Для проверки данных на нормальность распределения использовали критерий нормальности Шапиро–Уилка. Для оценки полученных данных определяли средние значения (M), стандартное отклонение (SD). При распределении, близком к нормальному, для сравнения результатов вычисляли t-критерий Стьюдента, различия считали значимыми при p < 0,05. В случае, если распределение отличалось от нормального, для описания данных использовали медиану (Ме) и 25–75 перцентили. Статистическую значимость различий определяли с помощью непараметрического критерия Манна–Уитни. Критический уровень значимости (p) при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для обследованных лиц с лимфопенией характерно более низкое содержание нейтрофилов в периферической крови — 2,44 (1,93–2,93) × 10⁹ кл./л, частота нейтропении составляет 38,57 ± 2,29%. У лиц с физиологическим уровнем лимфоцитов концентрация нейтрофильных гранулоцитов выше — 3,02 (2,33–3,64) × 10⁹ кл./л (р < 0,001), нейтропения выявляется в 15,79 ± 1,88% случаев. Низкое содержание нейтрофильных гранулоцитов ассоциируется со снижением их фагоцитарной активности. Так, процент активных фагоцитов составил в первой группе 68,53%, в то время как у практически здоровых людей — 72,25%. При оценке фонового отношения нейтрофилов к лимфоцитам (NLR) было выявлено, что при лимфопении данный показатель выше и составил 2,11, во второй группе — 1,49. Показатель NLR — значимый биомаркер состояний, сопровождающихся системным воспалением. Известно, что повышение NLR связано с инфекциями, инсультом, инфарктом, онкологическими и аутоиммунными заболеваниями, повреждением тканей и более высоким риском заболеваемости [13–17]. В обеих группах NLR не превышает 3,0, что является нормой. Однако более высокое значение NLR в группе с лимфопенией отражает дисбаланс иммунных путей воспаления, и это можно рассматривать как критерий риска усиления системного воспаления.

Проведена оценка уровня апоптоза (AnV+/PI–) и некроза лимфоцитов (AnV–/PI+). Показано, что уровень некротизированных клеток в обеих группах значимо не различается: в 1-й группе процент лимфоцитов AnV–/PI+ составил 0,74%, во 2-й группе — 0,67%. Концентрация лимфоцитов, меченных к апоптозу, выше у лиц с нормальным их уровнем в периферической крови — 5,43%, при лимфопении процентное содержание лимфоцитов AnV+/PI– составило 3,68% (p < 0,01). Таким образом, лимфопения в данном случае не связана с повышением гибели клеток, а представляет собой вариант компенсаторной адаптационной реакции, и воздействие неблагоприятных факторов приводит к выходу показателей за пределы физиологической нормы. 

Особенность гемограммы при лимфопении — более низкая концентрация эритроцитов (соответственно 4,41 (4,08–4,73) и 4,68 (4,31–4,99) × 10⁶ кл./л, p < 0,001) и гемоглобина (соответственно 127,70 (118,00–138,00) и 137,19 (128,00–149) г/л, р < 0,0001) без достоверных различий средней концентрации гемоглобина в эритроцитах (340,33 (331,00–351,00) и 340,71 (332,00–349,00) г/л). Частота выявления концентрации гемоглобина менее 120 г/л в первой группе — 30,75 ± 2,15%, во второй — 16,67 ± 1,46%. Содержание эритроцитов менее 4 × 10⁶ кл./л фактически в 4 раза чаще выявляют при лимфопении (у 20,51% и 6,06% обследованных соответственно). Не установлено достоверных различий в концентрации эритропоэтина в обеих группах, при низком уровне лимфоцитов его содержание было 30,02 (13,25–35,48) мМе/мл, у лиц с содержанием лимфоцитов в пределах физиологической нормы — 29,68 (17,31–37,11) мМе/мл.

В регуляции эритропоэза, а также в адаптации к холоду важную роль играет железо, его усвоение и запас. Косвенный критерий запаса железа в организме — это ферритин. Увеличение транскрипции мРНК ферритина-Н и самого белка ферритина происходит во время холодовой акклиматизации [18]. Уровни данного железосодержащего белка при лимфопении находятся в пределах физиологической нормы, но имеется тенденция к более низким концентрациям, чем у лиц с нормальным содержанием лимфоцитов (таблица). Не установлено достоверных различий в концентрации лактоферрина в обеих изучаемых группах. Наличие лимфопении ассоциируется с более высоким, фактически в 2 раза, содержанием трансферрина в периферической крови. Факторами, повышающими транкрипцию гена трансферрина и, следовательно, концентрацию самого трансферрина в крови, служат гипоксия и холод. Высокое содержание трансферрина, с одной стороны, направлено на повышение снабжения тканей железом для компенсации дефицита кислорода, но с другой стороны, трансферрин способствует активации тромбина, что увеличивает риск гиперкоагуляции и, как следствие, тромбоэмболических и сердечно-сосудистых патологий [19, 20].

Концентрации цитокинов в периферической крови в обеих группах находятся в пределах физиологической нормы, достоверных различий не установлено. При наличии бессимптомной лимфопении концентрации IL6 составили 2,48 ± 0,41 пг/мл и во 2-й группе — 3,74 ± 0,35 пг/мл, IL1β — 5,01 ± 0,61 и 4,46 ± 0,67 пг/мл, соответственно, и TNFα — 6,32 ± 1,03 и 7,32 ± 0,91 пг/мл, соответственно.

После общего охлаждения в обеих группах регистрируют адаптивную реакцию со стороны сердечно-сосудистой системы с тенденцией к повышению артериального давления и снижению частоты сердечных сокращений (рисунок).

В обеих группах установлено достоверное снижение температуры лба (в первой группе (лимфопения) — с 36,6 ± 0,06 до 34,05 ± 0,45°С, p < 0,0001; во второй группе (норма) — с 36,4 ± 0,10 до 33,78 ± 0,32 °С, p < 0,0001) и тыльной стороны ладони (в первой группе (лимфопения) — с 33,2 ± 0,33 до 32,4 ± 0,24 °С, p < 0,05; во второй группе — (норма) с 33,61 ± 0,36 до 32,54 ± 0,23 °С, p < 0,05). Реакция на общее кратковременное охлаждение сопровождается повышением содержания лимфоцитов при лимфопении до 1,32 (1,13–1,48) × 10⁹ кл./л (p < 0,05), без достоверного изменения их уровня в группе сравнения — 2,02 (1,76–2,35) × 10⁹ кл./л. Со стороны нейтрофильных гранулоцитов регистрирована противоположная реакция. Так, при нормальном фоновом уровне лимфоцитов концентрация нейтрофилов увеличивается на 11% до 3,27 (2,57–4,01) × 10⁹ кл./л (p < 0,05), а при лимфопении изменений в их содержании не установлено. В обеих группах отмечено снижение уровня ирисина (при лимфопении — с 4,25 (1,81–6,70) до 3,52 (1,30–5,75) мкг/мл; в группе сравнения — с 2,99 (1,63–7,14) до 2,38 (1,65–5,66) мкг/мл, что может свидетельствовать о включении механизмов несократительного термогенеза.

Воздействие холодового фактора связано с увеличением концентрации ферритина при лимфопении до 57,67 (41,67–65,10) нг/мл (р < 0,01), при нормальном содержании лимфоцитов до 76,46 (25,29–98,29) нг/мл (р < 0,01); содержание лактоферрина повышается только в группе обследованных без лимфопении до 498,85 (124,68–485,97) (р < 0,0001); концентрация трансферрина не изменяется в обеих группах (соответственно, в первой группе — 558,60 (421,70–940,70) мг/дл и во второй — 423,30 (351,40–549,60) мг/дл).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Адаптационные возможности организма при реагировании на воздействие факторов окружающей среды определяются уровнями реактивности и резистентности, обеспечивая в ответ формирование стресс-реакции или реакции тренированности. Известно, что наличие лимфопении — плохой прогностический признак при различных патологических состояниях и сочетание ее с необходимостью адаптации к дефициту тепла приводит к напряжению регуляторных систем и срыву адаптации [21–23]. Наличие бессимптомной лимфопении, характерной для северных территорий, сопровождается нейтропенией и более низкой активностью фагоцитарной защиты. В этиологии нейтропении у северян играет роль перераспределение лейкоцитов, увеличенный переход нейтрофильных гранулоцитов в ткани под воздействием неблагоприятных климатических факторов [24, 25]. Низкое фоновое содержание лимфоцитов в периферической крови ассоциировано с тканевой гипоксией, которая может быть следствием нарушения морфофункционального состояния эритроцитов, вызванного воздействием низких температур и окислительного стресса [26–28]. Кроме того, для людей, проживающих на Севере, характерно изменение структуры мембраны эритроцитов с увеличением ее вязкости, и, как следствие, снижением скорости диффузии газов, поступления кислорода в ткани [29–31]. Показано, что при лимфопении показатель NLR выше, чем у лиц с нормальным уровнем лимфоцитов. Сочетание высокого NLR с недостаточностью обеспеченности кислородом — неблагоприятный признак при инфекционных воспалительных заболеваниях [32]. В ответ на холодовое воздействие в обеих группах, независимо от фонового содержания лимфоцитов, регистрируют схожие физиологические реакции со стороны сердечно-сосудистой системы, что проявляется в повышении артериального давления и снижении частоты сердечных сокращений. О включении механизмов терморегуляции у обследованных свидетельствует снижение уровня ирисина, белка, участвующего в метаболизме и терморегуляции организма [33, 34]. Ирисин повышает экспрессию разобщающего белка-1 (UCP1) и приводит к несократительному термогенезу и повышению выработки тепла [35].

Не установлено изменение концентрации лактоферрина у лиц с фоновой лимфопенией после кратковременного общего охлаждения. Повышение концентрации данного белка связано с дегрануляцией нейтрофилов и отражает уровень их активации. Таким образом, при лимфопении в сочетании с нейтропенией и снижением функциональной активности нейтрофильных гранулоцитов значительно повышается риск срыва адаптационных реакций, а систематическое воздействие холодового фактора увеличивает вероятность хронизации инфекционных процессов. Кроме того, высокий уровень трансферрина, концентрация которого сохраняется и после общего охлаждения, повышает риск гиперкоагуляции, тромбозов и сердечно-сосудистых катастроф. В обеих обследованных группах регистрируют фактически одинаковое повышение уровня ферритина (в первой группе — на 21,10% и во второй — на 19,96% соответственно), что может свидетельствовать о сохранении теплового гомеостаза, так как индукция экспрессии тяжелой цепи ферритина способствует выживанию на холоде за счет детоксикации форм железа, генерирующих активные формы кислорода [35].

ВЫВОДЫ

Фоновая бессимптомная лимфопения ассоциируется с недостаточностью кислородной обеспеченности и более высоким уровнем нейтропении. Вне зависимости от уровня лимфоцитов, в периферической крови регистрируют однотипные реакции на общее кратковременное охлаждение со стороны сердечно-сосудистой системы, уровня ирисина и ферритина, что свидетельствует о включении механизмов терморегуляции. При лимфопении в ответ на холод не установлено активизации неспецифической защиты, не происходит изменения уровня и функциональной активности циркулирующих нейтрофильных гранулоцитов, что повышает риск хронизации инфекционных процессов в данной группе. Полученные данные могут быть использованы в мониторинговых исследованиях в области экологической физиологии, разработке методов оценки риска развития дезадаптационных реакций на общее охлаждение, коррекции нарушений иммунитета у людей, проживающих на Севере.