Инсульт — одна из ведущих причин смертности в мире и ведущая причина стойкой инвалидизации, которая ложится тяжелым экономическим бременем на все общество. Развитие ишемии сопровождается стремительной гибелью миллионов нейронов в течение нескольких секунд. К сожалению, в настоящее время все еще отсутствуют эффективные средства нейропротекции, способные нивелировать этот процесс [1].

Одним из основных механизмов такого повреждения служит оксидативный (окислительный) стресс (ОС), сопровождающийся выделением активных форм кислорода (АФК). Головной мозг особенно чувствителен к оксидативному повреждению, поскольку содержит большое количество полиненасыщенных жирных кислот, представляющих собой одну из предпочтительных целей для АФК. Через 24 ч после перманентной окклюзии среднемозговой артерии (СМА) в эксперименте на грызунах в очаге ишемического инсульта (ИИ) отмечают высокие показатели перекисного окисления липидов (ПОЛ), конечные продукты которого активируют фосфолипазу А2, расщепляющую фосфолипиды клеточных мембран с выделением провоспалительных медиаторов. В этот же период времени отмечают низкий уровень антиоксидантов с последующим его нарастанием [2, 3]. Основания ДНК также в значительной степени восприимчивы к повреждению оксидантами. Вследствие этого возникают мутации и делеции как в первичной, так и во вторичной структурах не только ядерной, но и митохондриальной ДНК, причем вторая более уязвима, поскольку располагается ближе к первоисточнику АФК и обладает меньшей репарационной способностью по сравнению с ядерной ДНК. Продукты ПОЛ также могут действовать как триггеры сигнального пути р53, вызывая изменения в строении мембран и утрату функций митохондриальной ДНК [4]. При нарушении редокс-гомеостаза повреждается и иммунная система, вследствие чего могут развиваться аутоиммунные и нейродегенеративные заболевания. С точки зрения оценки интенсивности ОС особый интерес представляют такие показатели, как один из биомаркеров ОС — малоновый диальдегид (МДА), эндогенный антиоксидант супероксиддисмутаза (СОД) и глутатионпероксидаза (ГПО), катализирующая окисление восстановленного глутатиона.

Вклад тиреоидных гормонов (ТГ) в поддержание редокс-статуса неоднозначен. Есть литературные данные, указывающие на то, что гипертиреоз приводит к увеличению продукции АФК, а гипотиреоз — к ее уменьшению, снижая при этом антиоксидантную активность [5, 6]. Митохондрии нейронов — одна из мишеней как для ТГ, так и для их производных (в частности, тиронаминов), причем при дефиците ТГ наблюдают морфофункциональные нарушения в работе этих органоидов. В культуре астроцитов было продемонстрировано усиление экспрессии генов бета-окисления пальмитата в митохондриях под влиянием трийодтиронина (Т₃), что приводило к увеличению содержания в клетках аденозинтрифосфата (АТФ), необходимого для нормальной работы ионных насосов [7, 8]. Учитывая ведущую роль астроцитов в защите нейронов при ишемическом повреждении головного мозга, авторы пришли к выводу, что при экспериментальной транзиторной ишемии снижение размеров очага поражения обусловлено именно нормализацией энергообмена в астроглии, которую обеспечивает Т3.

Однако это только один из предполагаемых механизмов нейропротекции, осуществляемой ТГ. Описание роли их производных — тиронаминов — в защите нейронов обычно ограничивалось гипотермическим эффектом, описанным в литературе. Мы предположили, что тиронамины, в частности, Т0АМ, также могут вносить свой вклад в антиоксидантную защиту нервной ткани. Целью исследования было изучить концентрацию продуктов, активно реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-АП), СОД и ГПО в ткани головного мозга лабораторных крыс после экспериментальной острой ишемии на фоне введения синтетического аналога тиронамина Т0АМ (СА-Т0АМ) в качестве предполагаемого нейропротектора.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Синтез СА-Т0АМ — гидрохлорида 4-[4-(2-аминоэтокси) бензил]анилина — был осуществлен авторами по описанной в литературе методике [9]. Структура полученного соединения подтверждена методом ЯМР (¹Н и ¹³С) спектроскопии.

Для эксперимента было отобрано 40 животных из собственного вивария ФГБУ «ИНВХ имени В. К. Гусака» Минздрава России, обоих полов, массой 190–210 г. В качестве модели острой ишемии головного мозга была выбрана перманентная перевязка правой общей сонной артерии (ОСА) у белых нелинейных лабораторных крыс. Согласно опубликованным исследованиям, данная модель вызывает формирование небольших по размерам инфарктов коры головного мозга [10]. Операцию проводили под общей анестезией («Калипсол», 100 мг/кг массы тела крысы). В качестве растворителя для СА-Т0АМ использовали диметилсульфоксид (DMSO). В исследовании по изучению биологических эффектов различных растворителей интраперитонеальное введение DMSO крысам в дозе 5 мл/кг в течение месяца расценено как относительно безопасное [11]. Животные были разделены на две экспериментальные группы по 20 особей в каждой. В первой группе («Контроль») проводили операцию по перевязке правой ОСА, через 10 мин после наложения лигатуры вводили внутрибрюшинно 0,5 мл раствора DMSO + 0,5 мл раствора NaCl 0,9%. Во второй группе («Эксперимент») животным вводили после операции 0,5 мл раствора DMSO + 0,5 мл раствора NaCl 0,9% + СА-Т0АМ в дозе 75 мг/кг массы тела крысы. Оптимальная доза 75 мг/кг была выбрана на основании максимально выраженной индукции гипотермии при нулевой летальности, исходя из исследования, описанного нами ранее [12]. С учетом максимальной активности ОС в течение первых минут после индукции ишемии [13], препарат вводили через 10 мин после перевязки ОСА. Через сутки после эксперимента животных подвергали декапитации с извлечением головного мозга. Ткань коры больших полушарий — отдельно интактного и ишемизированного — использовали для определения показателей ПОЛ.

Навеску свежей ткани коры больших полушарий головного мозга крыс гомогенизировали не менее 10 мин в стеклянном гомогенизаторе с буфером 50 мМ трис, содержащим 1 мМ ЭДТА и 0,25М сахарозы, рН 7,4, в соотношении 1:3. Готовый гомогенат замораживали при –70 °С минимум на сутки. После размораживания его центрифугировали в течение 30 мин при 4000 об/мин, после чего разводили центрифугат в 6 раз (50 мкл надосадочной жидкости + 250 мкл 5 мМ калий-фосфатного буфера, содержащего 1 × 10^–4 М ЭДТА рН 7,8).

Количество белка определяли по методу Лоури фотометрически при λ  = 750 нм в кювете 5 мм. Результаты данного метода необходимы для пересчета содержания СОД, ГПО и ТБК-АП в гомогенате головного мозга животного (на 1 мг белка). Метод определения активности СОД в гомогенате ткани мозга основан на способности фермента тормозить реакцию аутоокисления адреналина в адренохром при рН 10,2. Кинетику окисления измеряли спектрофотометрически при λ = 480 нм в кювете 10 мм на биохимическом анализаторе Eppendorf EPAC 6140 (Eppendorf AG; Германия). Содержание ТБК-АП определяли по реакции МДА с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) с образованием окрашенного «триметинового комплекса», содержание которого определяли фотометрически при λ = 532 нм в кювете 10 мм. Экстинкцию измеряли на биохимическом анализаторе Eppendorf EPAC 6140. Активность ГПО оценивали по изменению количества восстановленного глутатиона (GSH) до и после инкубации с модельным субстратом (гидропероксид трет-бутила) по реакции с реактивом Эллмана (5,5-дитиобис-2нитробензойная кислота). Измеряли оптическую плотность в кювете с ходом луча 10 мм при 412 нм на биохимическом анализаторе Eppendorf EPAC 6140.

Полученные данные статистически обрабатывали с использованием пакета программ для статистических вычислений R (R Core Team, 2018). Согласно результатам теста Шапиро–Вилка, показатели ТБК-АП (W = 0,79, p = 0,01), ГПО (W = 0,860, p = 0,016) и СОД (W = 0,89, p = 0,41) в ишемизированном полушарии не подчинялись нормальному закону распределения. Для выявления различий между выборками был использован непараметрический критерий Манна–Уитни.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты биохимических исследований, характеризующие активность антиоксидантных систем в ткани головного мозга лабораторных животных в модели острой церебральной ишемии, представлены в таблице (таблица) и на рисунке (рисунок).

При сравнении уровней ТБК-АП в интактном полушарии было выявлено, что у крыс, получавших СА-Т0АМ, этот показатель был в 3,4 раза выше, чем у животных контрольной группы (р < 0,001). Однако в ишемизированном полушарии у крыс, которым вводили исследуемый потенциальный нейропротектор, содержание ТБК-АП оказалось примерно в 2 раза ниже, чем у контрольных животных с ишемией без терапевтической коррекции (р = 0,022).

При сравнении активности ГПО у крыс контрольной и экспериментальной групп было выявлено, что введение СА-Т0АМ приводит к повышению активности данного фермента в 2,49 и 2,65 раза соответственно в ткани коры головного мозга как интактного (р = 0,040), так и ишемизированного (р = 0,021) полушарий.

Статистически значимых отличий в активности СОД в ткани коры интактных полушарий головного мозга крыс в контроле и в эксперименте выявлено не было (р = 0,750). Однако в ишемизированном полушарии животных, получавших СА-Т0АМ, активность СОД оказалась в 1,23 раза выше, чем у крыс контрольной группы (р = 0,042).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Изменение содержания МДА при острой ишемии

Увеличение количества ТБК-АП, которое наблюдали в гомогенатах полушарий головного мозга крыс, свидетельствует об активации процессов ОС при ишемии. МДА представляет собой стабильный и токсичный продукт ПОЛ. Повышение уровня МДА, основного компонента ТБК-АП, приводит к нарушению проницаемости и последующему разрушению клеточных мембран, выходу лизосомальных ферментов и активации процессов лизиса клеточных структур.

Исследователями было показано статистически значимое увеличение количества МДА в крови пациентов с ИИ без обнаружения корреляции с исходом заболевания, в то время как в другой работе выявили зависимость между сывороточным уровнем МДА и функциональным исходом заболевания через 3 месяца, в связи с чем даже предложили использовать МДА в качестве биопредиктора [2, 3]. Ряд авторов подтверждает наличие существенной положительной корреляции между уровнями МДА и функциональным исходом инсульта через неделю после поступления пациента в отделение, а в одном из исследований обнаружили, что по уровню МДА в день поступления и через 7 дней можно прогнозировать функциональную нетрудоспособность пациента спустя 6 месяцев по шкале mRS [14, 15]. Замечена и существенная связь между уровнем МДА и тяжестью инсульта по шкале NIHSS. Из-за недостаточного потребления кислорода в зоне пенумбры скапливается огромное количество свободных радикалов (о чем и свидетельствует накопление МДА). Степень повреждения зависит от активности механизмов антиоксидантной защиты. При тяжелом течении инсульта из-за большого объема поврежденных тканей антиоксиданты не справляются со связыванием свободных радикалов. Антиоксидантные ферменты являются индуцируемыми энзимами, потому для их транскрипции и синтеза требуется определенное время. Таким образом, в начальной фазе развития инсульта происходит усиление ПОЛ из-за недостаточной стимуляции антиоксидантных защитных механизмов, что отражает объем инсульта и, как следствие, тяжесть его течения, а МДА служит чувствительным маркером данного процесса. Снижение уровня ТБК-АП в гомогенатах ткани головного мозга крыс на фоне введения СА-Т0АМ указывает на уменьшение степени ОС в данной группе животных [16].

Изменение активности ГПО при острой ишемии

Считается, что ГПО обладает защитной функцией в отношении повреждений головного мозга. У мышей с нокаутированным геном глутатионпероксидазы 1 (ГПО1) в эксперименте по окклюзии СМА с последующей реперфузией наблюдают увеличение размеров инфаркта и усиление апоптоза [17, 18]. У этих животных наблюдали увеличение активности каспазы-3, которая повышается при ОС, что также свидетельствует в пользу того, что чувствительные к ГПО1 АФК играют важную роль в регуляции апоптоза. Данные подтверждают, что ГПО1 способна эффективно взаимодействовать не только с главными сигнальными путями нейрональной смерти, но также и с механизмами постишемического воспаления. Это позволяет ряду авторов рассматривать ГПО1 как многообещающий инструмент для терапевтического вмешательства в процессы, связанные с предотвращением или регулированием постишемического повреждения головного мозга [19].

Было показано защитное действие сверхэкспрессии ГПО в отношении нейронов головного мозга при фокальной ишемии у крыс. В эксперименте на 62 особях моделировали окклюзию СМА и стереотаксически вводили в полосатые ядра (очаг ишемии) вирусные векторы, экспрессирующие либо GPx1/lacZ (опытная группа), либо только lacZ (контроль). Было выявлено, что при введении векторов за 12 ч до операции выживаемость нейронов была на 36% выше в сравнении с показателями контрольной группы. При введении вектора через 2 и 5 ч после операции выживаемость нейронов была выше соответственно на 26% и 25% в сравнении с контролем. Морфологически было подтверждено, что в обеих группах тяжесть ишемии была одинаковой. С использованием иммунофлуоресцентного окрашивания авторы показали, что сверхэкспрессия ГПО предотвращает высвобождение цитохрома с из митохондрий нейронов и ограничивает опосредованное азотом повреждение этих органоидов, подавляет экспрессию Вах и каспазы-3 и активирует экспресиию Bcl-2, что указывает на участие ГПО в ингибировании эндогенного пути апоптоза. Эндогенная ГПО синтезируется в нейронах, и перенос гена с вектором усиливает ее продукцию. Астроциты защищают нейроны от ОС за счет содержащегося в них глутатиона, и сверхэкспрессия ГПО также способствует его превращению в окисленную форму после реакции с АФК. ГПО обладает способностью напрямую блокировать определенные этапы пути апоптоза без снижения общего уровня АФК. Например, повышение продукции Bcl-2 на фоне сверхэкспрессии ГПО способно блокировать высвобождение цитохрома с. Цитозольный цитохром формирует существенную часть апоптосомы у позвоночных, которая включает в себя также прокаспазу-9. Активация каспазы-9 индуцирует активацию каспазы-3, которая запускает биохимическое разрушение клеток. Данные указывают на то, что ГПО предотвращает апоптоз на уровне высвобождения цитохрома с, в пользу чего свидетельствуют повышение экспрессии Bcl-2 и снижение экспрессии Вах. Введение вектора с геном ГПО спустя 4–6 ч от развития ишемии может предотвращать вторую фазу активации каспазы и уменьшать за счет этого гибель нейронов в очаге ишемии. Исследователи устанавливают терапевтическое окно для этого способа доставки гена ГПО в очаг заболевания в 9–11 ч [20].

Таким образом, повышение активности ГПО — эндогенный защитный механизм, обеспечивающий выживаемость нейронов при инсульте, и введение СА-Т0АМ в значительной степени усиливает активность данного фермента.

Изменение активности СОД при острой ишемии

СОД относится к основным ферментам антиоксидантной защиты. Незначительная активация СОД в гомогенатах экспериментального полушария после окклюзии характерна для ишемизированных тканей и свидетельствует об адаптивной перестройке процессов антиоксидантной защиты в ответ на нарушение поступления кислорода в клетки. В целом, литературные данные по активности СОД на фоне ИИ противоречивы. Так, было показано значительное снижение уровня СОД в крови у лиц с ИИ крупных (но не мелких!) сосудов [21], такие же результаты получены при изучении СОД в сыворотке 41 пациента с острым ИИ [22]. Однако другие исследователи, напротив, указывают на резкое повышение уровня СОД в плазме больных, поступивших в отделение, и объясняют это значительным повышением содержания свободных радикалов в организме [23]. Таким образом, на сегодняшний день данные об изменении активности СОД при ишемии головного мозга противоречивы и требуют дальнейшего изучения.

На молекулярном уровне у животных с нокаутированным геном СОД2 наблюдали повышение уровня цитозольного цитохрома с и фрагментацию ДНК. У крыс со сверхэкспрессией СОД1, напротив, содержание цитохрома с в цитозоле низкое. Высвобождение цитохрома с приводит к усилению продукции АФК за счет ингибирования дыхательной цепи. Считается, что АФК также инициируют выход цитохрома с из митохондрий. Таким образом, формируется «порочный круг» высвобождения цитохрома с из митохондрий нейронов при ишемии, что в итоге приводит к активации апоптотического каскада [20].

Наши данные указывают на активацию СОД в ответ на введение СА-Т0АМ, что подтверждает влияние этого потенциального нейропротектора на усиление антиоксидантной защиты в ткани головного мозга при ишемии.

Влияние тиронаминов на показатели антиоксидантной защиты

Тиронамины Т1АМ и Т0АМ способны дозозависимо связываться с рецептором TAAR1 (Trace Amine-Associated Receptor 1), что сопровождается выработкой циклического аденозинмонофосфата (цАМФ), однако на сегодняшний день сложно достоверно утверждать, что TAAR1 — единственный эндогенный рецептор, благодаря которому данные биогенные амины реализуют свои эффекты. Так, усиление выработки цАМФ на клеточном уровне не согласуется с развитием гипотермии и снижением сердечной функции. Следовательно, либо активация TAAR1 не сопряжена с G-белками в отдельных тканях, либо тиронамины способны взаимодействовать и с другими формами TAAR [24]. Возможно, эффекты тиронаминов опосредованы взаимодействием также и с рецепторами, отличными от ТААR. Ряд авторов отмечает накопление T1AM внутри клеток, что позволяет предположить существование внутриклеточных мишеней для данного производного ТГ [25]. Интересно, что в некоторых случаях T0AM влияет на потребление O₂ в большей степени, чем T1AM, хотя данный тиронамин менее эффективен в индукции гипотермии in vivo [9].

Тиронамины — природные декарбоксилированные производные ТГ. Их введение in vivo зачастую вызывает эффекты, противоположные эффектам, вызываемым гормонами щитовидной железы, включая снижение температуры тела. Поскольку известно, что митохондриальный аппарат передачи энергии служит потенциальной мишенью ТГ и их производных, в 2012 г. было исследовано влияние T0AM и T1AM in vitro на скорость потребления О₂ и выделение Н₂О₂ митохондриями печени крысы. В работе использовали животных с гипотиреозом из-за низкого содержания в их организме эндогенных тиронаминов. Авторы обнаружили, что инкубация митохондриальных препаратов с тиронаминами вызывает снижение активности белкового комплекса III дыхательной цепи, а эндогенный T1AM способен существенно снижать потребление O₂, вероятно, замедляя скорость перемещения электронов по дыхательной цепи, и усиливать выработку АФК митохондриями печени у крыс с гипотиреозом. Кроме того, Т1АМ окисляется моноаминоксидазами внешней мембраны митохондрий за счет O₂, который затем восстанавливается до H₂O₂ [26, 27].

Влияние тиронамина на активность фермента ГПО в мозге мало изучено и требует дальнейшего исследования. Активация процессов свободнорадикального окисления, увеличение количества АФК, о чем косвенно свидетельствует повышение уровня ТБК-АП и активности СОД в нашем эксперименте, включает процессы редокссигнализации. Считается, что система Nrf2-Keap1-ARE является основной ответственной за включение адаптивных механизмов в клетках в условиях ОС. Ядерный фактор Nrf2 представляет собой фактор транскрипции, регулирующий ряд генов антиоксидантной защиты, которые действуют синергически, обеспечивая связывание АФК посредством каскада ферментативных реакций. Гены-мишени Nrf2 участвуют в нейтрализации свободных радикалов, детоксикации ксенобиотиков и поддержании редокспотенциала. Обычно Nrf2 локализован в цитоплазме и связан с белком Keap1. ОС модифицирует положение сульфгидрильных групп в комплексе Nrf2-Keap1, вызывая диссоциацию и перемещение Nrf2 в ядро клетки, где он связывается с антиоксидантным элементом (antioxidant response element, ARE), расположенным в промоторном участке целого ряда генов, кодирующих ферменты синтеза и обмена глутатиона (глутаматцистеинлигаза, глутатионS-трансфераза, ГПО, глутатионредуктаза) и других ферментов антиоксидантной защиты (СОД, каталаза) [28]. Таким способом запускается активация транскрипции этих генов, и данный механизм может пояснить, почему в интактном полушарии, в меньшей степени затронутом ОС, значения ТБК-АП выше, чем в ишемизированном. На животной модели было показано, что активация Nrf2 способна спасти ткань в зоне пенумбры, но не в ядре инсульта, а профилактическое лечение улучшает функциональный исход в течение месяца. При делециях гена Nrf2 животные становятся чувствительными к действию стрессорных факторов, а также более уязвимыми для ишемического повреждения головного мозга и прочих неврологических нарушений [29]. Увеличение активности ГПО в ответ на возрастание уровня ТБК-АП в гомогенатах ишемизированного полушария до введения СА-Т0АМ, и особенно после введения, может быть также вызвано активацией системы редокс-сигнальной Nrf2-Keap1-ARE [30].

Иными словами, влияние ТГ и их производных (в частности, тиронаминов) на редокс-статус организма и отдельных его тканей подтверждено рядом авторов, однако характер этого воздействия крайне противоречив и требует дальнейшего изучения.

ВЫВОДЫ

Согласно результатам нашего исследования, содержание ТБК-АП в ишемизированном полушарии белых крыс снижается в ответ на введение синтетического аналога тиронамина Т0АМ (75 мг/кг массы тела крысы интраперитонеально). В то же время наблюдают усиление активности СОД в ишемизированном полушарии и значительное повышение активности ГПО в ткани обоих полушарий головного мозга крыс экспериментальной группы. Это дает основания предполагать, что используемый нами в качестве нейропротектора СА-Т0АМ обладает значительным потенциалом в отношении активации механизмов антиоксидантной защиты в коре головного мозга белых лабораторных крыс в условиях острой полушарной ишемии.

В дальнейшем планируется продолжение поиска наиболее перспективных синтетических аналогов тиронаминов (более удобных для применения в клинике водорастворимых форм с более выраженным гипотермическим эффектом), определение их биологических свойств в модели фокальной церебральной ишемии, а также идентификация сигнальных путей, за счет которых реализуются их нейропротективные эффекты.