В клинической диагностике используют простые, дешевые и хорошо освоенные тесты на свертываемость крови — активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое время (ПВ) и тромбиновое время (ТВ) [1–3]. Эти тесты предназначены для определения эффективности гемостаза в плазме крови пациентов. АЧТВ позволяет оценить работу внутреннего пути активации коагуляции, с помощью измерения ПВ определяют коагуляцию при активации внешнего пути, а ТВ показывает эффективность активации тромбином фибриногена и полимеризации фибрина. В исследовательской работе по поиску новых антикоагулянтов возникает необходимость быстрого и недорогого тестирования веществ-кандидатов in vitro. При этом приходится работать с различными сложными смесями белков, экстрактами и другим подобным материалом. На начальном этапе необходимы простые и дешевые способы первичного скрининга.

В нашей лаборатории была разработана и используется методика для определения влияния на свертываемость крови потенциальных белков-антикоагулянтов медицинской пиявки (Hirudo medicinalis). Мы приводим используемые нами протоколы измерений и иллюстрируем их работоспособность на примере трех веществ, ингибирующих свертывание крови. Первый из них — цистеин-богатый антикоагулянт медицинской пиявки (CRA) представляет собой недавно обнаруженный нами [4] белокантикоагулянт, родственный антистазину [5]. Вторым из объектов исследования является рекомбинантный белок гирудин, наиболее известный антикоагулянт медицинской пиявки [6]. Третий использованный антикоагулянт — это гепарин, олигосахарид, очень широко используемый в клинической практике [2, 7].

Целью работы было показать работоспособность протокола тестирования антикоагуляционной активности растворов с помощью модифицированных стандартных клинических тестов на измерение АЧТВ, ПВ и ТВ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Оборудование

Анализатор показателей гемостаза АПГ4-03-Пх («ЭМКО»; Россия). Кюветы измерительные одноразовые с шариками для коагулометров («ЭМКО»; Россия). Измерения проводили с использованием оптического канала анализатора (режим «оптика»).

Реактивы

Набор реагентов для определения АЧТВ в плазме крови клоттинговым методом (АЧТВ-тест) ПГ-7/1 (НПО «РЕНАМ»; Россия).

Набор реагентов для определения ТВ «Тромбинреагент» ПГ-9А (НПО «РЕНАМ»; Россия). Реактив для определения ПВ «МЛТ-тромбопластин» («ЭМКО»; Россия).

Контрольная плазма (Плазма-Н) КМ-1 (НПО «РЕНАМ»; Россия).

Антикоагулянты

В качестве антикоагулянтов использовали полученные в нашей лаборатории рекомбинантный цистеинбогатый антикоагулянт (CRA) медицинской пиявки [4] и рекомбинантный гирудин (Hir) медицинской пиявки [4], а также раствор среднемолекулярного нефракционированного гепарина натрия (Hep) в ампулах промышленного производства («Синтез»; Россия). Для проведения тестов готовили серию разведений антикоагулянтов. Разведение осуществляли раствором 10 мМ TrisCl, pH 7,5.

Клоттинговые тесты

При работе с антикоагулянтами каждый образец измеряли в четырех повторах параллельно, используя четыре измерительные ячейки коагулометра. Для полученных значений вычисляли среднее арифметическое и стандартное отклонение. На основе полученных значений строили графики времени образования сгустка от концентрации антикоагулянта (рисунок). При определении влияния различных растворов на результаты измерений каждый образец измеряли в двух повторах параллельно, используя две измерительных ячейки коагулометра одной пары.  Для полученных значений вычисляли среднее арифметическое и заносили в таблицу (см. таблица).

Активированное частичное тромбопластиновое время

Для измерения АЧТВ готовили 2^Х АЧТВ-реагент. Для этого во флакон с лиофилизированным АЧТВ-реагентом вносили 2 мл воды, что составляет половину от рекомендованного объема при проведении клинического АЧТВ-теста. Во флакон с лиофилизированной контрольной плазмой крови вносили 1 мл воды, как рекомендовано производителем. Флаконы выдерживали 30 мин при комнатной температуре и периодическом перемешивании для полного растворения осадка. Раствор хлорида кальция помещали в термостатируемую ячейку коагулометра для прогрева до 37 °С. В коагулометрическую кювету вносили 50 мкл контрольной плазмы, 25 мкл исследуемого раствора и 25 мкл 2^Х АЧТВ-реагента и перемешивали содержимое кюветы трехкратным пипетированием. В кювету помещали магнитный шарик и переносили в термостатируемую ячейку-таймер коагулометра на 3 мин. После окончания инкубирования перемещали кюветы в измерительные ячейки коагулометра и добавляли 50 мкл прогретого хлорида кальция в режиме «автостарт». Фиксировали время образования сгустка.

Тромбиновое время

Для определения ТВ использовали тромбин-реагент с концентрацией 6 ед./мл. Для его приготовления во флакон с лиофилизированным тромбином вносили 2,7 мл воды и 0,3 мл концентрированного растворителя (буферного раствора из состава набора). Во флакон с лиофилизированной контрольной плазмой крови вносили 1 мл воды, как рекомендовано производителем. Флаконы выдерживали 30 мин при комнатной температуре и периодическом перемешивании для полного растворения осадка. Раствор тромбин-реагента помещали в термостатируемую ячейку коагулометра для прогрева до 37 °С. В коагулометрическую кювету вносили 100 мкл контрольной плазмы и 50 мкл исследуемого раствора, перемешивали содержимое кюветы трехкратным пипетированием. Далее, в кювету помещали магнитный шарик и переносили в термостатируемую ячейку-таймер коагулометра на 3 мин. После окончания инкубирования перемещали кюветы в измерительные ячейки коагулометра и добавляли 50 мкл прогретого тромбин-реагента в режиме «автостарт». Фиксировали время образования сгустка.

Протромбиновое время

Для определения ПВ использовали 2^X раствор тромбопластина. Для его приготовления во флакон с лиофилизированной тромбопластин-кальциевой смесью вносили 3 мл воды, что составляет половину от рекомендованного объема при проведении клинического ПВ-теста. Во флакон с лиофилизированной контрольной плазмой крови вносили 1 мл воды, как рекомендовано производителем. Флаконы выдерживали 30 мин при комнатной температуре и периодическом перемешивании для полного растворения осадка. Раствор тромбопластина помещали в термостатируемую ячейку коагулометра для прогрева до 37 °С. В коагулометрическую кювету вносили 50 мкл контрольной плазмы и 50 мкл исследуемого раствора, перемешивали содержимое кюветы трехкратным пипетированием. Далее, в кювету помещали магнитный шарик и переносили в термостатируемую ячейку-таймер коагулометра на 3 мин. После окончания инкубирования перемещали кюветы в измерительные ячейки коагулометра и добавляли 50 мкл прогретого раствора тромбопластина в режиме «автостарт». Фиксировали время образования сгустка.

Статистический анализ

Для проведения статистического анализа при сравнении образцов, содержащих исследуемые белки с контрольной плазмой, применяли непараметрический критерий Манна– Уитни с использованием языка программирования Python (версия 3.12) (Python Software Foundation; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты определения АЧТВ представлены на рисунок А–В. Для всех трех антикоагулянтов наблюдается четкое увеличение времени образования сгустка с увеличением концентрации действующего вещества.

Результаты измерения ПВ представлены на рисунокГ–Е. Как и в случае измерения АЧТВ, для CRA (рисунокГ) и Hep (рисунокД) наблюдается увеличение времени застывания реакционной смеси с увеличением концентрации.  Гепарин, имевший высокую активность в тесте АЧТВ, при измерении ТВ активности не проявляет (рисунокЕ).

Результаты измерения ТВ представлены на рисунокЖ–И. Все три антикоагулянта показывают дозозависимое увеличение времени образования сгустка.

Для определения совместимости описываемых методик с компонентами часто применяемых в биохимических исследованиях буферных растворов было проведено определение их влияния на время формирования сгустка для трех описываемых тестов. Результаты приведены в таблица. В большинстве случаев влияние отсутствовало или было незначительно. Однако 1% β-меркаптоэтанол приводил к отсутствию коагуляции при измерении АЧТВ и ПВ, а раствор 1М NaCl вызывал кратное увеличение значений во всех трех тестах.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для любого метода ключевым параметром являются граничные условия его применимости. В процессе постановки экспериментов, помимо автоматической фиксации времени формирования сгустка прибором, мы проводили визуальное наблюдение состояния реакционной смеси. При больших концентрациях антикоагулянтов в измерительных кюветах наблюдалась явная неравномерность застывания, отдельные комки и жгуты вокруг магнитных шариков, а также подвижность шариков после срабатывания датчика коагулометра. В таких условиях результаты не могут считаться достоверными, поэтому верхний порог измерений следует ограничивать сотней секунд. Таким образом, во всех трех тестах концентрации антикоагулянтов следует подбирать так, чтобы при максимальной исследуемой концентрации время образования сгустка находилось в районе 100 с. Если в процессе измерения образование сгустка не происходит за это время, следует дополнительно разбавить измеряемый образец. Также следует учитывать, что реактивы и контрольная плазма из разных производственных партий дают при измерении АЧТВ, ТВ и ПВ несколько различающиеся результаты. Вследствие этого строго необходимо всю серию измерений каждого образца (или нескольких образцов при их сравнении) и контрольных образцов проводить с использованием реактивов из одной партии.

Для сравнения результатов, полученных в разное время и с использованием разных реактивов, можно применять различные методы нормализации. Например, в случае ПВ при клинической диагностике широко применяют международное нормализованное отношение (МНО, ISI) [1–3]. Для скрининговых тестов нам представляется возможным использование относительной величины (КО), полученной как частное от времени образования сгустка в исследуемом образце (t_О) к времени образования сгустка в контрольном образце (t_К): КО = t_O^/t_K.

Предлагая проводить для каждого исследуемого образца три разных теста, авторы исходят из того, что будет производиться поиск веществ с неизвестными характеристиками и механизмом действия, обязательной чертой которых является лишь способность ингибировать коагуляцию. В связи с этим мы считаем, что надо применять все три теста совместно. Естественно, в большинстве случаев определенные предположения о характеристиках искомого компонента имеются. В таком случае исследователи вполне могут предпочесть тот или иной вариант тестирования, исходя из своих соображений. Различия действия трех использованных в этой работе антикоагулянтов проявляются довольно наглядно.

В тесте АЧТВ для всех исследованных веществ наблюдается явный дозозависимый эффект. Однако CRA показывает время (рисунокА), соизмеримое с Hir (рисунокБ), при молярных концентрациях, меньших на порядок величины. Например, время образования сгустка примерно в 50 с достигается уже при концентрации CRA в пробе, равной 2,5 мкМ, а гирудина — только при концентрации 50 мкМ. Можно сделать вывод, что CRA значительно эффективнее ингибирует активацию внутреннего пути свертываемости крови по сравнению с Hir. Вполне ожидаемо, что Hep также эффективно ингибирует коагуляцию (рисунокВ), однако напрямую сравнить его удельную активность с активностью исследуемых белков невозможно, так как концентрация лекарственной формы Hep указана только в международных единицах активности (МЕ).

Несколько иная картина наблюдается при определении ПВ (рисунокГ–Е). В случае CRA (рисунокГ) и Hep (рисунокД) наблюдается увеличение времени застывания реакционной смеси с увеличением концентрации, как и при определении АЧТВ. В то же время гепарин, имевший высокую активность в тесте АЧТВ, при измерении ТВ не вызывает увеличения времени формирования сгустка (рисунокЕ). Это связано с тем, что он ингибирует факторы Xa и IIa, а также факторы внутреннего пути активации не напрямую, а при посредничестве антитромбина [7].

При определении ТВ (рисунокЖ–И) примечательно то, что в этом случае наблюдается ситуация, обратная по сравнению со случаем измерения АЧТВ: Hir (рисунокЗ) проявляет большую активность, чем CRA (рисунокЖ). Вероятно, это связано с тем, что Hir является специфичным ингибитором тромбина (фактор IIа) [6], а CRA, помимо тромбина, ингибирует и другие протеиназы каскада свертывания крови [4]. В результате, при измерении АЧТВ активность CRA проявляется более явно за счет накопительного эффекта. Рабочий диапазон измерения для Hep (рисунокИ) в данном случае сильно сужен. При добавлении в реакцию 0,07 МЕ Hep время застывания составляет 29,3 ± 2,5 с, а при добавлении 0,1 МЕ на реакцию полноценное образование сгустка уже не происходит.

При первичном поиске веществ, препятствующих свертыванию крови, исследователи часто имеют лишь общие соображения об их природе и механизме действия, так как для того, чтобы детально исследовать эти аспекты, необходимо сначала действующее вещество обнаружить и получить в относительно чистом виде. Особенно данная проблема проявляется при исследовании сложных смесей природного происхождения — слюны кровососущих животных, секретов, экстрактов и т. д. Исследователи могут видеть проявление биологической активности, но на этом этапе не иметь представления, за счет чего и как она реализуется. Именно поэтому нам кажется обоснованным использовать одновременно три разных теста, нацеленных на три разных части каскада свертывания крови — внутренний путь (АЧТВ), внешний путь (ПВ) и конечную стадию (ТВ). С использованием трех антикоагулянтов разной природы мы показали, что они по-разному проявляют себя в этих тестах.

При исследовании новых потенциальных антикоагулянтов они могут находиться в растворах, содержащих различные низкомолекулярные вещества. Например, при исследовании рекомбинантных белков-антикоагулянтов они после хроматографической очистки или рефолдинга оказываются растворенными в буферных растворах, состав которых зависит от конкретной методики выделения. В каждом конкретном случае строго необходимо выполнять контрольные измерения с буферным раствором, идентичным тому, в котором растворено исследуемое вещество. Однако некоторые растворы могут быть несовместимы с используемыми методами измерения. Мы проверили влияние на измерение АЧТВ, ТВ и ПВ некоторых распространенных компонентов буферных растворов, используемых в биохимических исследованиях. Результаты представлены в таблица. В большинстве случаев влияние исследуемых растворов на результаты тестов незначительны. Однако прямое использование растворов с высокой йонной силой (1М NaCl) невозможно во всех тестах, а сильных восстановителей (β-меркаптоэтанол) — при определении АЧТВ и ПВ. В то же время растворы, содержащие более слабые восстановители (ДТТ), умеренные количества детергентов (Тритон Х-100, додецилсульфат натрия (SDS)) или 0,1 М мочевину, могут быть использованы для проведения измерений.

ВЫВОДЫ

В работе представлены модификации методик определения АЧТВ, ПВ и ТВ с использованием широко распространенных реактивов и коагулометра отечественного производства. Модификации заключаются в изменении объемов реагентов и времени инкубации и не требуют дополнительных реагентов или оборудования для проведения измерений. Описанные методики могут быть полезны при поиске новых антикоагулянтов и исследовании влияния разных веществ на процесс свертывания крови.