Тропическая малярия (ТМ) представляет серьезную проблему для тропического и субтропического регионов, несмотря на усилия мирового сообщества, направленные на снижение заболеваемости и прекращение передачи возбудителей этой инфекции Plasmodium falciparum (Welch, 1897) их переносчиками комарами рода Anopheles (Meigen, 1818). Коварство заболевания зачастую связано с постепенным началом, а затем стремительным злокачественным развитием, моментально переходящим в фазу непоправимых фатальных осложнений даже на фоне приема противомалярийных препаратов. Малярийная кома, алгид, острая почечная недостаточность, инфекционнотоксический шок (ИТШ) и гемоглобинурийная лихорадка могут приводить к гибели неиммунных лиц, заразившихся ТМ при посещении эндемичных регионов [1].

В основе патогенеза тяжелых форм ТМ лежат процессы розеттинга (формирование конгломератов инфицированных эритроцитов с непораженными) и адгезии инфицированных эритроцитов к эндотелию капилляров [2]. Это приводит к тромбозу мелких сосудов и секвестрации тканей жизненно важных органов, особенно головного мозга. Молекулярно-генетические механизмы патогенеза ТМ связаны с выделением возбудителями многочисленных белков (MAHRP1,2, REX3, HSP40, KAHRP и др.). Наиболее важным экспортируемым семейством белков является PfEMP1 (эритроцитарный мембранный белок — главный фактор вирулентности P. falciparum), который обнаруживается на поверхности инфицированной клетки [3, 4]. Транспортировка паразитарных белков обеспечивается расщелинами Маурера, которые определяются как выпячивания мембраны паразитофорной вакуоли и представляют собой высокомобильные структуры [5, 6]. На начальных этапах развития паразитов они быстро перемещаются, участвуя в транспортировке PfEMP1 на поверхность эритроцитов. Главный фактор вирулентности плазмодиев обладает повышенным сродством к основным клеточным рецепторам, таким как ICAM-1 (от англ. intercellular adhesion molecule-1), CD36, CR и др. [7, 8]. Специфичное связывание PfEMP1 с клеточными рецепторами приводит к формированию патологических контактов инфицированных эритроцитов со здоровыми клетками, что приводит к явлениям розеттинга, адгезии и секвестрации [9].

Световая микроскопия остается основным методом изучения паразитов в крови и других тканях восприимчивого организма. Однако этот метод не обеспечивает возможность исследования ультраструктуры микроорганизмов и клеточных механизмов, лежащих в основе патогенеза злокачественного течения малярии. Высокая разрешающая способность электронного микроскопа значительно расширяет возможности для исследования взаимодействия малярийных паразитов с клетками крови и других тканей организма. Сложность пробоподготовки, трудоемкость, значительные временные затраты, а также высокие требования к качеству исследуемых образцов существенно ограничивают применение электронной микроскопии для исследования клинического материала [10]. Этому способствует также короткая продолжительность развития эритроцитарных форм P. falciparum, аккумулирование пораженных эритроцитов в капиллярном русле, низкий уровень паразитемии, а также быстрая утрата морфологических признаков паразитов и инфицированных ими эритроцитов [11]. В связи с этим для электронно-микроскопических исследований преимущественно используют образцы, полученные при искусственном культивировании стандартных лабораторных штаммов плазмодиев, зачастую низко вирулентных или вовсе непатогенных для человека [12]. Данные об ультраструктурных патоморфологических изменениях в организме больных малярией встречаются редко. В связи с этим представляем результаты комплексного исследования с помощью электронной микроскопии материала, полученного от пациента, погибшего от осложненной тропической малярии.

Цель исследования — изучить ультраструктуру эритроцитарных стадий развития P. falciparum, а также оценить ультраморфологические изменения пораженных тканей при исследовании клинического материала, полученного от больного тропической малярией.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалом для исследования послужили прижизненные пробы венозной крови, взятой в диагностических целях, а также материал, полученный в ходе последующего патологоанатомического исследования головного мозга, сердца, почек пациента, погибшего от осложненной тропической малярии.

Световая микроскопия

Препараты крови готовили в соответствии с общепринятой методикой и окрашивали по Романовскому–Гимзе [13].

Материал, полученный при аутопсии, фиксировали в 10%-м нейтральном забуференном формалине. Затем пробы обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафин (ООО «Биовитрум»; Россия). Срезы тканей толщиной 5 мкм, сделанные с парафиновых блоков, окрашивали гематоксилином и эозином (ООО «Биовитрум»; Россия). Для исследования использовали световой микроскоп AxioImager A2 (Carl Zeiss; Германия).

Сканирующая электронная микроскопия

Пробы венозной крови фиксировали в 2,5%-м глутаровом альдегиде на фосфатно-солевом буфере (ФСБ), рН 7,2–7,4, в течение суток. В дальнейшем форменные элементы отмывали от фиксатора путем трехкратного добавления ФСБ с последующим центрифугированием и удалением надосадочной жидкости. Объем взвеси форменных элементов доводили до 5% от объема пробы, полученный материал ресуспендировали, наносили на предметные стекла. После высыхания препараты пропитывали 2%-м тетроксидом осмия (оксид осмия (VIII) в течение 30 мин, затем последовательно обезвоживали в этиловых спиртах восходящей концентрации (30°, 50°, 70°, 80°, 96°) и высушивали на воздухе. Для обеспечения сканирующего эффекта материал обрабатывали сплавом золота с палладием (Au/Pd (60 : 40). Напыление слоя толщиной 5 нм проводили при помощи установки Q150T ES (Quorum; Германия). Готовые препараты исследовали в сканирующем режиме с использованием электронного микроскопа Merlin (Carl Zeiss; Германия), оснащенного детектором вторичных электронов SE2.

Срезы тканей внутренних органов толщиной 5 мкм переносили на предметные стекла, депарафинировали посредством трехкратной обработки ксилом (АО «Экос-1»; Россия) в течение 3 суток, затем пропитывали 2%-м тетроксидом осмия (Serva; Германия). Напыление сканирующего слоя и исследование готовых препаратов проводили вышеописанным способом.

Трансмиссионная электронная микроскопия

Подготовку проб венозной крови и тканей внутренних органов проводили по стандартным методикам. Подготовленные образцы заливали в блоки, в качестве встраиваемой среды использовали пластифицированную смолу Аралдит (EMS; США). Срезы блоков толщиной 100 нм подвергали двойному контрастированию цитратом свинца и 1%-м водным раствором уранил ацетата (Serva; Германия). Готовые препараты исследовали в трансмиссионном режиме с помощью электронного микроскопа Merlin (Carl Zeiss; Германия) с использованием детектора STEM. Снимки, полученные с препаратов, анализировали в программе для анализа и обработки фотографий ImageJ (NIH; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Пациентка И., 44 лет, жительница Санкт-Петербурга, была инфицирована возбудителями тропической малярии при кратковременном посещении высокоэндемичного тропического региона. Химиопрофилактику от малярии не получала. Через неделю после возвращения из поездки почувствовала недомогание, повысилась температура тела. Состояние прогрессивно ухудшалось. Госпитализирована в инфекционный стационар на пятые сутки заболевания. На основании клинических проявлений и эпидемиологического анамнеза в приемном отделении проведено паразитологическое исследование препаратов крови, выявлены P. falciparum. Безотлагательно начато противомалярийное лечение, несмотря на это через 13 ч внезапно наступила смерть пациентки. Непосредственной причиной смерти послужили инфекционно-токсический шок и отек — набухание головного мозга, т. е. известные осложнения злокачественного течения тропической малярии.

В ходе исследования препаратов крови «толстая капля» и «тонкий мазок» в каждом поле зрения выявлялось множество юных кольцевидных трофозоитов P. falciparum. Уровень паразитемии превышал 50 000 клеток в 1 мкл крови (рис. 1).

На фотографиях, полученных при проведении электронной сканирующей микроскопии препаратов периферической крови, отмечено большое количество деформированных эритроцитов, утративших характерную двояковогнутую форму. Пораженные эритроциты имеют бугристую поверхность, повторяющую очертания развивающихся в них паразитов. Оболочка инфицированных эритроцитов теряет эластичность, становится неровной за счет встраивания в нее паразитарных белков. Между пораженными эритроцитами формируются межклеточные контакты. Это связано со специфическим взаимодействием встроенных в оболочку пораженных эритроцитов белков главного фактора вирулентности P. falciparum с клеточными рецепторами соседних клеток. Этот же механизм лежит в основе явления «розеттинга», сопровождающегося формированием конгломератов, состоящих из инфицированных и здоровых клеток крови. Предполагается, что, окружая себя неповрежденными клетками, паразиты избегают тем самым воздействия факторов клеточного иммунитета (рис. 2).

По данным литературы, форма инфицированных эритроцитов становится ригидной, а белки, ответственные за ригидность, напрямую связаны с вирулентностью, что дополнительно свидетельствует о влиянии секретома на тяжесть течения инфекции [14]. Деформация эритроцитов происходит в результате формирования крупных выступов над трофозоитами. Именно здесь локализованы области цитоплазматической мембраны, несущие белки адгезии паразита PfEMP1 [15].

С помощью трансмиссионной электронной микроскопии в препаратах крови исследовали ультраструктуру паразитарных клеток и пораженных ими эритроцитов (рис. 3).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Обзорные произвольные срезы препаратов венозной крови показали наличие внутри эритроцитов трофозоитов P. falciparum, окруженных мембраной паразитофорной вакуоли. Ядра паразитов имеют аморфную структуру, хроматин не конденсирован, ядерная оболочка имеет нечеткие контуры, что служит признаками начинающейся шизогонии, сопровождающейся асинхронными последовательными циклами репликации [16]. Конкретные механизмы множественного деления у P. falciparum до конца не известны. Установлено, что процессы в клетках плазмодиев существенно отличаются от размножения других эукариот [17]. Пищеварительные вакуоли заполнены электронно-плотным веществом, схожим с гемоглобином. Известно, что в пищеварительных вакуолях (модифицированные лизосомы) паразитов накапливается гемозоин, продукт метаболизма гемоглобина, поглощаемого P. falciparum [18]. В цитоплазме трофозоитов выявляется множество свободных рибосом, указывающих на активный синтез паразитами специфических белков, необходимых для обеспечения его мембранных и экзомембранных систем. Цитоплазма инфицированных эритроцитов имеет рыхлую мелкозернистую структуру, мембрана утрачивает четкие контуры. Внутри эритроцитов отчетливо определялись тубуловезикулярные структуры с электронно-плотными стенками и электронно-прозрачным содержимым — расщелины Маурера. Расщелины Маурера появляются уже на ранних стадиях развития паразитов и состоят из отростков и завитков, отходящих от мембраны паразитофорной вакуоли, созревая с образованием функционально независимых структур, прикрепленных к цитоплазматической мембране эритроцитов [19]. 

При исследовании тканей миокарда и коры головного мозга выявляются признаки облитерации просветов капилляров розетками инфицированных эритроцитов, адгезированных на эндотелии. Эритроциты в розетках сохраняют вид отдельных клеток, стенки их отчетливо различимы (рис. 4).

При изучении срезов тканей головного мозга и миокарда с помощью сканирующей электронной микроскопии выявляется множественная адгезия эритроцитов на поверхности эндотелия кровеносных капилляров. Инфицированные и непораженные эритроциты деформированы, образуют розетки, среди них присутствуют клетки сферической формы. Это, вероятно, связано с изменением структуры цитоплазматической мембраны эритроцитов вследствие встраивания в нее паразитарных белков. Известно, что сфероцит можно рассматривать как предгемолитическую стадию эритроцита [20]. Вероятно, в процессе изменения структуры эритроцитарной мембраны нарушается ее проницаемость, однако в какой стадии жизненного цикла P. falciparum это происходит, остается невыясненным (рис. 5).

Среди эритроцитов, организованных в розетки на поверхности эндотелиальных клеток, обращает на себя внимание отсутствие волокон фибрина, в норме являющегося ключевым участником в формировании тромба. Отсутствие фибриновых масс, наблюдаемое в зонах слипания эритроцитов, указывает на различия механизмов тромбообразования при ТМ и в процессе свертывания крови. Доказано, что конгломерация эритроцитов в розетки и их адгезия на эндотелии капилляров обусловлена патологическим взаимодействием паразитарных белков с клеточными рецепторами эритроцитов и эндотелиоцитов [21]. Подтверждением ведущей роли патологического межклеточного взаимодействия в патогенезе злокачественной тропической малярии служит выявление тесных межклеточных контактов между мембранами эритроцитов, формирующих розетки в капиллярах головного мозга. Особую значимость при этом имеют извитые каналы расщелин Мауэра, расположенные в зоне прилегания паразита к мембране пораженного эритроцита (рис. 6).

ВЫВОДЫ

В работе представлены результаты морфологического исследования эритроцитов венозной крови, тканей миокарда и головного мозга при тяжелой форме тропической малярии. Анализ результатов изучения ультраструктурных изменений P. falciparum и эритроцитов в процессе эритроцитарной шизогонии плазмодиев подтверждает наличие сложных молекулярно-генетических и клеточных механизмов патологического влияния паразитов на клетки хозяина. Результатом такого взаимодействия служат изменения поверхностной архитектуры цитоплазматической мембраны инфицированных эритроцитов, формирование конгломератов эритроцитов, их адгезии на эндотелии капилляров миокарда и коры головного мозга. Наблюдаемые изменения приводят к нарушению микроциркуляции в тканях жизненно важных органов. Выявленные ультраструктурные изменения подтверждают способность паразитов менять свойства клеточных мембран инфицированных эритроцитов, что приводит к формированию патологических межклеточных контактов и служит одним из основных механизмов вирулентности P. falciparum, определяющих злокачественное течение тропической малярии.