Циклофосфамид (ЦФ) в супралетальных дозах применяют для миелоабляции с целью подготовки реципиентов к пересадке стволовых кроветворных клеток. В числе побочных эффектов такого лечения — угнетение желудочнокишечной моторики, цитостатическое повреждение эпителия тонкой кишки и эндотоксемия. Эти осложнения нарушают энтеральное питание, снижают эффективность перорально вводимых лекарственных средств, повышают вероятность гибели пациентов до осуществления трансплантации. Гастростаз и острый тонкокишечный мукозит, предупреждаемые введением в желудок раствора гидрокарбоната натрия (NaHCO₃), мы наблюдали у крыс после воздействия ЦФ в миелоабляционной дозе [1]. Остаются неизвестными характер связи желудочнокишечного стаза, энтероцитопении и эндотоксемии между собой, а также влияние на них средств, изменяющих pH желудочного химуса: NaHCO3 или соляной кислоты (HCl). Целью работы было выявление связи между желудочнокишечным стазом, повреждением слизистой оболочки тонкой кишки и острой кишечной эндотоксемией при моделировании на крысах миелоабляционной цитостатической терапии.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали самцов крыс-альбиносов линии Вистар весом 161–190 г (Филиал НИЦ «Курчатовский институт» – ПИЯФ ‒ ПЛЖ «Рапполово»; Россия). Животные получали стандартный корм для крыс и питьевую воду ad libitum. Формировали четыре рандомизированные группы по восемь особей: интактные животные; получившие только ЦФ; получившие ЦФ и NaHCO₃ или ЦФ и HCl. Через 24 ч после введения ЦФ крыс помещали в клетки с решетчатым полом, исключавшим копрофагию и поедание элементов подстилки, при доступе только к воде. Миелоабляцию вызывали однократным введением в латеральную вену хвоста свежеприготовленного водного раствора препарата ЦФ «Эндоксан» (Бакстер онкология ГМБХ; Германия), в дозе 390 мг/кг (≈ 1,7 ЛД_{99/30 сут}), в объеме 10 мл/кг. Указанная доза ЦФ составляла 1,7 ЛД9_{9/30 сут.} и обеспечивала дожитие всех крыс до трех суток после воздействия. Дважды (за 30 мин до и тотчас после введения ЦФ) вводили в желудок 0,48 М раствор NaHCO₃ (pH = 8,34) в объеме 15 мл/кг или 0,1 М раствор HCl (pH = 1) в том же объеме. Животных обследовали через 72 ч после введения ЦФ.

Забор крови из v. portae, извлечение органов проводили под фторотановым наркозом. Пропульсивную функцию желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) оценивали по относительной массе желудочного и слепокишечного химусов, которую рассчитывали как выраженную в граммах разность масс заполненного химусом и пустого органа (gaster, caecum), отнесенную к массе тела в килограммах. Для оценки избирательности действия NaHCO₃ или HCl на органы ЖКТ параллельно определяли относительную массу селезенки.

Для оценки выраженности энтероцитопении в тканях тонкой кишки определяли активность маркеров энтероцитов: щелочной фосфатазы, ЩФ [2] и холинэстеразы, ХЭ [3]. Краниальные отрезки duodenum, каудальные отрезки jejunum и ileum длиной по 4 см гомогенизировали в 15-кратном объеме трис-HCl буфера (50 мМ, pH = 7,4) и замораживали при минус 20 °C. Через 15 ч гомогенаты размораживали при 4 °C и центрифугировали при 2000 g в течение 10 мин. В супернатанте определяли активность ЩФ оптимизированным кинетическим методом с помощью набора реактивов (ООО «Ольвекс диагностикум»; Россия) и активность ХЭ методом Эллмана, используя в качестве субстрата ацетилтиохолина йодид (Sigma-Aldrich; США), на биохимическом анализаторе ChemWell 2910 (Awareness Tech.; США), а также содержание белка по Бредфорду.

Кишечную эндотоксемию оценивали по содержанию в плазме портальной крови эндотоксина и аммиака, а также продукта обезвреживания аммиака печенью — мочевины. Эндотоксин определяли с LAL-реактивом в модификации «гель-тромб тест» с помощью набора реактивов «ALPYR Test» (ООО «Альгимед Техно»; Россия). Для повышения чувствительности метода до разведения и смешивания с LAL-реактивом пробы инкубировали при 70 °С в течение 15 мин, этим переводя эндотоксин из связанного с альбумином в свободное состояние [4]. Концентрацию аммиака определяли спектрофотометрически с помощью набора реактивов «Ammonia Ultra» (Sentinel Diagnostics; Италия). Концентрацию мочевины определяли после ее гидролиза до аммиака, используя набор реактивов «Мочевина UV» (Biosystems; Испания). Параллельно в плазме крови определяли креатинин в реакции с пикриновой кислотой, альбумин в реакции с красителем бромкрезоловым зеленым и общий белок в реакции с красителем кислотным синим 90.

В качестве показателя избыточного бактериального роста использовали экскрецию индикана с мочой [5], которую собирали, помещая животных в метаболические камеры на срок с 48 по 72 ч после введения ЦФ. Индикан количественно определяли с реактивом Обермайера [6] и выражали экскрецию в микрограммах на килограмм массы тела в час.

Результаты представляли в виде среднего значения и его ошибки (M ± m). Влияние вводимых веществ на исследуемые количественные показатели оценивали с помощью дисперсионного анализа. В случаях значимости полученных моделей межгрупповое сравнение средних величин выполняли с помощью теста честной значимой разницы Тьюки [7]. Критический уровень значимости α приняли равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

После двух суток голодания химус был сосредоточен у крыс только в gaster и caecum; в просвете тонкой и ободочной кишок он отсутствовал. На фоне введения ЦФ относительная масса желудочного химуса была в 10,5 раз больше, чем у интактных животных, при отсутствии существенного различия средних значений относительной массы слепокишечного химуса. Введение в желудок как NaHCO₃, так и HCl частично предупреждало переполнение химусом желудка, но не изменяло объем содержимого caecum (рис. 1).

Введение ЦФ вело к энтероцитопении. Активность ЩФ снижалась в 1,6–4,9 раз во всех отделах тонкой кишки, наиболее значительно — в ileum; активность АХЭ была снижена только в ileum. Введение в желудок NaHCO₃ частично предупреждало снижение активности ЩФ в duodenum (рис. 2). Ни NaHCO₃, ни HCl не влияли на системный цитопенический эффект ЦФ, проявлявшийся снижением относительной массы селезенки на 57% (рис. 1).

Содержание аммиака в плазме портальной крови интактных крыс составляло 0,88 мМ, что втрое превышало это значение для плазмы крови крыс, полученной при декапитации [8]. На фоне введения ЦФ уровень аммиака крови не был существенно изменен, но содержание мочевины было повышено в 4,6 раза. На фоне введения в желудок NaHCO₃ уровень мочевины имел тенденцию к дополнительному повышению, а на фоне введения HCl был снижен вдвое, оставаясь выше, чем в контроле. После введения ЦФ содержание эндотоксина в портальной крови было вчетверо выше, чем у интактных животных; введение в желудок NaHCO₃ или HCl мало влияло на этот результат. Содержание креатинина в крови крыс, получивших ЦФ, было вдвое выше, чем у интактных животных, и не претерпевало существенных изменений после введения NaHCO₃ или HCl. Существенных межгрупповых различий содержания в плазме крови общего белка или альбумина не было (рис. 3). Экскреция индикана с мочой вдвое интенсифицировалась на фоне введения ЦФ, в том числе и при введении в желудок HCl. В случае введения в желудок NaHCO₃ гипериндиканурия была представлена в виде тенденции (рис. 4).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

После лишения животных корма масса их желудочного содержимого определяется пропульсивной функцией желудка. Поэтому наблюдавшееся в настоящей и в предыдущей [1] работах переполнение химусом желудка у крыс, получивших ЦФ, отражало развитие у них гастростаза. Если бы изменение моторики ЖКТ ограничивалось гастростазом, то поступление химуса в слепую кишку отставало бы от ее опорожнения, вследствие чего относительная масса ее химуса уменьшалась бы. Однако на фоне воздействия ЦФ масса слепокишечного химуса существенно не изменялась (рис. 1). Из этого следует, что воздействие ЦФ вело к торможению пропульсивной функции не только желудка, но и толстой кишки.

Можно предположить, что гастростаз был защитной реакцией, направленной на предупреждение травматизации химусом наиболее чувствительного к ЦФ отдела ЖКТ — тонкой кишки. Ее повреждение проявлялось энтероцитопенией, что следует из снижения содержания маркеров энтероцитов в тканях тонкой кишки (рис. 2). Другим следствием гастростаза могло быть ограничение доставки субстратов бактериям, вегетирующим в просвете толстой кишки. В ее химусе удельное содержание бактерий — на восемь порядков больше, чем в химусе желудка [9], что характеризует роль толстокишечной микрофлоры как источника эндотоксемии. При частоте деления 3 ч−1 (средний показатель для Escherichia coli при 37 °С) теоретически возможно восьмикратное увеличение числа бактерий за час после прекращения пропульсивной функции толстой кишки. Субстратные ограничения, обусловленные гастростазом, могли сдерживать столь стремительный рост толстокишечной микрофлоры, равно как и продукцию ею аммиака. Однако желудочно-кишечный стаз не мог воспрепятствовать жизнедеятельности аммиакпродуцирующей пристеночной микрофлоры, субстратами для которой служат вещества, диффундирующие к люминальной поверхности слизистой оболочки ЖКТ из крови. Продукции аммиака в слепой кишке мог способствовать и стаз толстой кишки, препятствовавший удалению аммиакпродуцирующей микрофлоры из организма. Аммиак, продуцируемый кишечной микрофлорой, в печени вовлекается в состав мочевины. Ее содержание в крови животных, получивших ЦФ, через трое суток возрастало более чем вчетверо (рис. 3), что указывает на интенсификацию образования аммиака в кишечнике в более ранние сроки. Эта гипотеза подкрепляется почти двукратным повышением уровня аммиака в крови крыс через 3 ч после введения ЦФ в миелоабляционной дозе [8]. Частично уремия могла быть связана и с задержкой выведения мочевины из организма: на это указывает двукратное повышение содержания в крови маркера почечной недостаточности, креатинина. Поэтому наблюдавшееся в настоящей работе повышение уровня мочевины в крови через трое суток после введения ЦФ было маркером острой кишечной эндотоксемии смешанного типа: продукционной и ретенционной.

Грамотрицательные бактерии, являющиеся источником эндотоксина, у получивших ЦФ животных могли быть сосредоточены в желудке и слепой кишке, поскольку другие отделы ЖКТ были свободны от химуса. Содержание в толстокишечном химусе эндотоксина близко к 2,5 г/л [10], а его высвобождение из бактерий могло интенсифицироваться в результате их гибели из-за субстратных ограничений, обусловленных гастростазом. Толстокишечный стаз увеличивал продолжительность контакта эндотоксина с сорбирующей поверхностью слизистой оболочки, поэтому портальная эндотоксинемия после введения ЦФ (рис. 3) могла быть как продукционной, так и перераспределительной. Отсутствие влияния ЦФ на содержание белков в плазме крови свидетельствует о том, что содержание эндотоксина в биологически активной свободной форме повышалось пропорционально его суммарному содержанию в плазме.

Индикан — конечный продукт метаболизма индола, единственным источником которого в условиях эксперимента была реакция, катализируемая триптофаназой кишечной микрофлоры. Гипериндиканурия — валидный показатель избыточного роста индолпродуцирующих бактерий в ЖКТ [5]. Экскреция индикана с мочой интенсифицировалась (рис. 4) вопреки нарушению экскреторной функции почек, которое проявлялось повышением уровня креатинина в крови (рис. 3). Это свидетельствует о преобладании продукционного и (или) перераспределительного компонента кишечной эндотоксемии над ретенционным у получивших ЦФ животных.

Как NaHCO₃, так и HCl частично предотвращали развитие у крыс переполнения желудка (рис. 1), в то время как энтероцитопению частично предотвращало лишь введение в желудок NaHCO₃. Ощелачивающее действие NaHCO₃ было преимущественно местным, поскольку предотвращало энтероцитопению лишь в duodenum, но не в каудальных отделах тонкой кишки и не в селезенке (рис. 2). Это подкрепляет гипотезу [1] об уменьшении цитостатического повреждения эпителия слизистой оболочки как о вероятном механизме профилактического действия NaHCO₃ на гастростаз, вызванный ЦФ. Частичное предупреждение переполнения желудка введением в него HCl могло быть обусловлено повышением в ее присутствии активности пепсина [11] и ускорением переваривания корма, потребленного животными в последующие 24 ч. Такое объяснение подкрепляется данными об угнетающем действии ЦФ на желудочную секрецию [12].

Выраженность кишечной эндотоксемии зависит от интенсивности образования токсикантов кишечной микрофлорой, проницаемости для них энтерогематического барьера и скорости их выведения из организма. У крыс, получивших ЦФ, цитостатическое повреждение было наиболее выражено в тонкой кишке [13], в то время как кишечная микрофлора была сосредоточена в желудке и слепой кишке — органах, эпителий слизистой оболочки которых более резистентен к цитостатикам. Поэтому цитостатическое повреждение тонкой кишки не могло прямо влиять на поступление в кровь токсикантов кишечного происхождения. Об этом говорит отсутствие существенного влияния NaHCO₃, уменьшавшего выраженность энтероцитопении, на уровень эндотоксина в портальной крови (рис. 3) и на выраженность индиканурии (рис. 4) у крыс на фоне воздействия ЦФ. Различие влияния NaHCO₃ и HCl на уровень продукта обезвреживания аммиака, мочевины, в портальной крови (рис. 2) могло быть обусловлено переходом в щелочной среде аммиака в свободную форму NH3, легко диффундирующую сквозь биомембраны [14], в то время как в кислой среде аммиак был представлен в ионизированной форме NH4⁺, плохо преодолевающей энтерогематический барьер.

Таким образом, при моделировании на крысах миелоабляционной цитостатической терапии предупреждение осложняющих ее гастростаза или цитостатического повреждения тонкой кишки не устраняет острую кишечную эндотоксемию. При разработке мер профилактики осложнений миелоабляционной цитостатической терапии целесообразно оценить эффективность введения в желудок NaHCO₃ в сочетании со средствами подавления вегетации толстокишечной микрофлоры. Эти меры могут быть дополнены энтеральной детоксикацией (энтеросорбцией, кишечным лаважем) с целью удаления эндогенных токсикантов из мест их образования [15].

ВЫВОДЫ

Внутривенное введение крысам циклофосфамида в миелоабляционной дозе ведет к желудочнокишечному стазу, цитостатическому повреждению слизистой оболочки тонкой кишки и формированию острой кишечной эндотоксемии смешанного типа. Преобладающим механизмом острой кишечной эндотоксемии при моделировании на крысах миелоабляционной цитостатической терапии является интенсификация поступления в кровь продуктов жизнедеятельности микрофлоры слепой кишки. При миелоабляционном воздействии циклофосфамида на крыс профилактика гастростаза введением в желудок слабых растворов гидрокарбоната натрия или соляной кислоты не предотвращает формирование острой кишечной эндотоксемии. При миелоабляционном воздействии циклофосфамида на крыс профилактика энтероцитопении введением в желудок слабого раствора гидрокарбоната натрия не предотвращает формирование острой кишечной эндотоксемии. При разработке мер профилактики желудочно-кишечной токсичности циклофосфамида при миелоабляционной цитостатической терапии перспективна апробация гидрокарбоната натрия в сочетании со средствами энтеральной детоксикации и подавления вегетации толстокишечной микрофлоры.