Механизмы повреждающего действия ионизирующего излучения тесно связаны с усилением окислительного стресса в облученных клетках [1]. Повышенное содержание активных форм кислорода (АФК) способствует повреждению макромолекул, в том числе белков, нуклеиновых кислот и липидов, что приводит к дисфункции, повреждениям ДНК и апоптотической гибели клеток [2]. Центральное место в антиоксидантной защите занимают глутатионпероксидаза (ген GPX), каталаза (ген CAT), марганец-зависимая супероксиддисмутаза (ген SOD2), миелопероксидаза (ген MPO) и цитохром b-245 (ген CYBA). Однонуклеотидный полиморфизм (ОНП) в генах, кодирующих антиоксидантные ферменты, может способствовать изменению активности ферментов и нарушению их функций [3]. В частности, наблюдаются изменение активности ферментов супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы, а также снижение их способности нейтрализовать свободные радикалы при наличии неблагоприятных аллелей по полиморфным локусам генов SOD2 (rs4880) и GPX1 (rs1050450) соответственно [4]. Каталаза является важным эндогенным антиоксидантным ферментом, который катализирует разложение перекиси водорода на кислород и воду, тем самым нейтрализуя вредное воздействие АФК. Полиморфный локус rs7943316 в промоторной области гена CAT может модифицировать аффинность связывания факторов транскрипции. Из-за присутствия мутантного аллеля Т неправильное связывание факторов транскрипции может привести к изменению активности промотора, экспрессии генов и снижению каталитической активности фермента [5]. Снижение каталитической активности антиоксидантных ферментов, в свою очередь, повышает восприимчивость к окислительному стрессу. Полиморфный локус rs2333227, расположенный в промоторной области гена миелопероксидазы, снижает экспрессию гена MPO, нарушая сайт связывания транскрипционного фактора SP1. Установлено, что замена основания G на A связана с уменьшением экспрессии мРНК гена MPO и снижением количества фермента, тогда как аллель G, наоборот, связан с повышенной выработкой MPO [6]. Ряд полиморфизмов в промоторной и экзонной областях гена CYBA влияют на экспрессию гена и активацию НАДФНоксидазы, что приводит к повышенному образованию свободных радикалов наряду с регистрируемым дефицитом антиоксидантов [7]. Все это свидетельствует о том, что наличие полиморфных участков в генах, кодирующих ферменты антиоксидантной системы, может влиять как на количественные, так и на функциональные характеристики фермента, а в случае дополнительного воздействия ионизирующего излучения модифицировать эффект облучения.

Целью исследования было установить связь полиморфных локусов СYBA (rs4673), GPX1 (rs1050450), MPO (rs2333227), CAT (rs7943316), SOD2 (rs4880) с риском развития злокачественных новообразований (ЗНО) у лиц, подвергшихся хроническому низкоинтенсивному радиационному воздействию, с учетом межгенных взаимодействий и дозы радиационного облучения.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Генотипирование по полиморфным маркерам СYBA (rs4673), GPX1 (rs1050450), MPO (rs2333227), CAT (rs7943316), SOD2 (rs4880) проводили у лиц, проживавших на радиоактивно загрязненных территориях вдоль р. Течи и подвергшихся низкоинтенсивному хроническому радиационному воздействию в диапазоне малых и средних доз [8]. Все пациенты, включенные в исследование, были госпитализированы в клиническое отделение Уральского научно-практического центра радиационной медицины ФМБА России (УНПЦ РМ) в период с 2003 по 2023 г., у них забирали образцы крови в банк тканей УНПЦ РМ. Для всех обследованных лиц критериями включения были проживание в любое время в период с 1 января 1950 г. по 31 декабря 1960 г. в одном из 41 села, расположенных на прибрежной территории р. Течи; наличие индивидуальной накопленной дозы облучения красного костного мозга (ККМ), рассчитанной с применением дозиметрической системы Techa River Dosimetry System (TRDS-2016) [9]. Для группы сравнения критерием включения было отсутствие онкологических заболеваний, для группы облученных с ЗНО — наличие солидных ЗНО. Критериями исключения для всех обследованных лиц были наличие гематологических заболеваний и отсутствие информации об истории болезни.

Обследуемые лица (611 человек) были разделены на две группы: лица, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию на р. Тече без ЗНО — 384 человека; лица, подвергшиеся хроническому радиационному воздействию на р. Тече, имеющие в анамнезе ЗНО различной локализации, — 227 человек. Подробная характеристика обследуемых групп представлена в табл. 1.

Обследуемые лица имели накопленные дозы облучения ККМ в диапазоне от 0,85 до 3715,72 мГр, а средняя доза облучения не превышала 659 мГр. Статистически значимых различий в накопленных дозах облучения ККМ между группами облученных, имеющих в анамнезе ЗНО, и облученных без ЗНО обнаружено не было (p > 0,05).

Представленные группы сопоставимы по полу, этническому составу и возрасту.

Из диагностированных форм солидных опухолей у облученных жителей прибрежных сел р. Течи были следующие: ЗНО органов пищеварительной системы — 49 человек (коды по МКБ-10: С00, C02, C04, C15, C16, С18.4, С19, C22.7, C25.9, С26), органов дыхательной системы — 28 человек (коды по МКБ-10: С30, C32.9, С34), органов покровной системы — 44 человека (коды по МКБ-10: С43.9, С44), органов женской репродуктивной системы — 70 человек (коды по МКБ-10: С50, С53, С54, С56), органов мужской репродуктивной системы — восемь человек (коды по МКБ-10: С61, С63), органов мочевыделительной системы — 16 человек (коды по МКБ10: С64, C67), органов эндокринной системы — 13 человек (код по МКБ-10: С73). Помимо этого, в обследованной группе встречались ЗНО костей и суставных хрящей — один человек (код по МКБ-10: С40), мозга и нервной системы — два человека (коды по МКБ-10: С71, С72), зрительного аппарата — два человека (коды по МКБ-10: С69), ЗНО неуточненной локализации — четыре человека (код по МКБ-10: С80), карцинома in situ — три человека (код по МКБ-10: D09) и ЗНО неопределенного характера — три человека (код по МКБ-10: D48). Распределение ЗНО в группе облученных лиц представлено на рис. 1.

Забор периферической крови для исследования проводили в вакуумные пробирки Vacuette (Greiner BioOne; Австрия) объемом 9 мл, покрытые мелкодисперсным антикоагулянтом К3ЭДТА. Выделение геномной ДНК производили на спин-колонках с использованием коммерческого набора ExtractDNA Blood & Cells («Евроген»; Россия) согласно протоколу производителя.

Однонуклеотидные полиморфные варианты геновкандидатов для исследования выбирали с учетом расположения полиморфного локуса в гене, а также наличия связи со ЗНО на основе анализа баз данных HapMap (URL: hapmap.ncbi.nlm.nih.gov), NCBI (URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/), SNPedia (URL: https://snpedia.com/). В - к 3-концу ДНК) целевой последовательности." >табл. 2 представлена характеристика полиморфных участков исследуемых генов.

Амплификацию исследуемых полиморфных локусов проводили методом ПЦР в реальном времени на приборе StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems; США) с использованием наборов реагентов, синтезированных ООО «ТестГен» (Россия), согласно протоколу производителя.

Оценку отклонения распределения частот генотипов исследованных полиморфизмов от ожидаемого равновесного распределения по закону Харди–Вайнберга проводили с использованием критерия хи-квадрат (χ²) в онлайн-калькуляторе Gene Calc (URL: https://genecalc.pl/hardy-weinberg-page). Для оценки связи аллелей в полиморфных локусах с риском развития ЗНО использовали расчет отношения шансов (ОШ) с 95%-м доверительным интервалом (ДИ). Ассоциацию считали статистически значимой при p < 0,05.

Для оценки межгенного взаимодействия, а также дозы облучения использовали непараметрический метод снижения многофакторной размерности (Multifactor Dimensionality Reduction, MDR) [10], который реализован в свободно распространяемом пакете MDR v. 3.0.2 (URL: http://sourceforge.net/projects/mdr). В ходе такого анализа мультилокусные генотипы и факторы объединяются в группы повышенного и сниженного риска развития заболевания, что уменьшает размерность числа рассчитываемых параметров. Таким образом, из всех предложенных вариантов моделей, сформированных на основе вводимых первичных данных, путем многократных проверок выбирается оптимальная модель факторного взаимодействия, позволяющая с наиболее высокой точностью и низкой вероятностью ошибки предсказать наличие или отсутствие предрасположенности к определенным болезням [11]. Оптимальность полученных моделей оценивали, основываясь на воспроизводимости по результатам перекрестной проверки (Cross Validation Consistency, CVC) и точности предсказания (Testing Balanced Accuracy, TBA). Модель должна воспроизводиться не менее 9 раз из 10, а ее точность должна превышать 55%. Значение p для показателя точности предсказания было установлено с помощью теста 1000-кратной перестановки (Permutation Testing). Значения считали статистически значимыми при p < 0,05. Для визуализации результатов анализа взаимодействий факторов использовали графы, построенные силовым алгоритмом Фрюхтермана– Рейнгольда (Fruchterman–Rheingold). Вклад каждого фактора и/или взаимодействия факторов оценивается величиной энтропии Н, выраженной в %. Так, фактор со 100% энтропией однозначно определяет, к какому классу (больных или здоровых) относится индивид; соответственно, фактор с 0% не играет никакой роли в предрасположенности к заболеванию. Для учета дозового фактора обследованные лица были ранжированы на три дозовые подгруппы: 1 — 0,85–99 мГр; 2 — 100–999 мГр; 3 — ≥ 1000 мГр.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Результаты исследования распределения полиморфных участков генов антиоксидантной системы у лиц, подвергшихся хроническому радиационному воздействию, представлены в табл. 3.

Для всех полиморфных участков генов наблюдалось соответствие равновесию Харди–Вайнберга. Кроме того, значения наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности для всех полиморфных участков были схожими, что указывает на случайность выборки.

На следующем этапе исследования был выполнен анализ связи каждого отдельно взятого полиморфизма гена с риском развития ЗНО на основе рецессивной и доминантной моделей наследования (табл. 4).

В результате анализа было установлено, что аллели rs4880*С и rs1050450*Т ассоциированы с повышенным риском развития ЗНО (ОШ = 1,49 (1,02–2,18), р = 0,04) и ОШ = 2,00 (1,11–3,62), р = 0,02 соответственно). Принимая во внимание тот факт, что при исследовании ассоциаций отдельных аллелей и генотипов не учитывают сложный каскад взаимодействий продуктов генов оксидантной системы, а также фактор радиационного воздействия в риске развития ЗНО, мы выполнили анализ межгенных взаимодействий с накопленной дозой облучения, в результате которого были получены 1n-, 2n-, 3n- и n-факторные модели (табл. 5). Одномоментно тестировали все пять ОНП и фактор накопленной дозы облучения ККМ. В табл. 5 представлены четыре наилучшие комбинации факторов по результатам моделирования. Дальнейшее увеличение числа параметров значительно снижало точность представляемых моделей.

Среди всех выявленных моделей наибольшей точностью (66%) и 100%-й воспроизводимостью обладает трехфакторная модель, включающая в себя полиморфизмы SOD2 (rs4880), CYBA (rs4673) и накопленную дозу облучения ККМ (р = 0,001). Как сопряженные с повышенным риском развития ЗНО были отмечены аллели С*rs4880 (генотипы C/C и C/T) и Т*rs4673 (генотипы T/T и T/C). Остальные модели не соответствовали условиям отбора. Полиморфизм GPX1 (rs1050450) был включен в 4n-факторную модель, однако одновременно с повышением чувствительности такой модели уменьшается ее специфичность, что сказывается на точности. Остальные полиморфизмы были признаны недостаточно информативными. Граф взаимодействия элементов в трехфакторной модели представлен на рис. 2.

Наибольшей информационной ценностью обладают полиморфизм SOD2 (rs4880), объясняющий 0,96% фенотипической энтропии (неопределенности), и фактор накопленной дозы облучения ККМ — 1,24%. Наименьший информационный вклад вносит CYBA (rs4673) — 0,06%, что, вероятно, не играет существенной роли в риске развития ЗНО. Однако стоит учесть взаимодействия между всеми элементами модели, которые носят синергетический характер. Так, на долю пары rs4880 и rs4673 приходится 0,61% энтропии, на долю rs4673 и накопленной дозы на ККМ — 0,83%, а на долю rs4880 и накопленной дозы на ККМ — 0,21%.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

АФК являются продуктами нормального клеточного метаболизма и играют важную роль в стимуляции сигнальных путей в клетках в ответ на изменения внутри- и внеклеточных условий. Большинство АФК генерируются в дыхательной цепи митохондрий [12]. Однако дисбаланс между образованием свободных радикалов и реактивных метаболитов и их устранением с помощью ферментов антиоксидантной системы приводит к возникновению окислительного стресса. Факторы, способствующие формированию окислительного стресса, разнообразны — от образа жизни (курение, употребление алкоголя) до воздействия окружающей среды (химическое и радиационное воздействие). Кроме того, хронические заболевания и воспаление также могут быть связаны с окислительным стрессом. В конечном счете окислительный стресс приводит к повреждению важных биомолекул и структур клеток с потенциальными последствиями для всего организма [13]. При устойчивом окислительном стрессе АФК вырабатываются в течение длительного времени. Так могут возникать значительные повреждения структуры и функций клеток, что может привести к возникновению соматических мутаций и неопластической трансформации [14]. Способность антиоксидантов нейтрализовать действие свободных радикалов может быть важной частью противоопухолевой защиты организма. Эффективность антиоксидантной системы генетически детерминирована. Сверхэкспрессия или снижение активности антиоксидантных ферментов может модифицировать эффекты облучения [15].

В ходе проведенного нами исследования установлено, что аллель rs4880*С гена SOD2 и аллель rs1050450*Т гена GPX1 ассоциированы с повышенным риском развития ЗНО у людей, подвергшихся хроническому радиационному воздействию в широком диапазоне доз, что в целом

согласуется с литературными данными по необлученным людям. Согласно геномной оценке онкогенности на основе модели прогнозирования regBase, rs4880 имеет статус вероятно патогенного. По литературным данным, rs4880 ассоциирован с повышенным риском развития ЗНО предстательной железы [16]. Кроме того, у лиц с генотипом С/Т и Т/Т по полиморфизму SOD2 (rs4880) измеренная активность фермента SOD2 была на 33% ниже, чем у носителей генотипа C/C [17]. Однако в исследовании [18], напротив, показано снижение активности фермента при наличии варианта Т в кодоне 16, приводящее к усилению окислительного стресса, — что, вероятно, является причиной повреждения структур клетки. Связь между генетическими вариантами полиморфизма GPX1 (rs1050450) и предрасположенностью к ЗНО у необлученных людей также показана в ряде исследований [19]. Комплексный метаанализ, включавший в себя 31 опубликованную статью, показал, что rs1050450 может способствовать предрасположенности к развитию ЗНО за счет нарушения антиоксидантного баланса. Носители варианта аллеля Т имеют повышенный риск развития различных типов ЗНО, особенно в азиатских подгруппах на основе доминантной генетической модели [20]. Возможным механизмом таких эффектов может быть снижение функциональной активности гена. Так, по данным ClinVar, rs1050450 связан с дефицитом глутатионпероксидазы.

Учитывая, что на процесс онкотрансформации клетки влияет большое число факторов, в том числе межгенные взаимодействия и факторы внешней среды, мы провели анализ роли межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов и дозы облучения ККМ в развитии ЗНО у облученного человека. В результате анализа с наибольшей точностью (66% (р = 0,001) и 100%-й воспроизводимостью была установлена трехфакторная модель, согласно которой повышенный риск развития ЗНО регистрируется при сочетании аллеля С*rs4880 гена SOD2, аллеля T*rs4673 гена CYBA и накопленной дозы облучения ККМ. Стоит отметить, что в наиболее точную модель включен полиморфный вариант SOD2 (rs4880), для которого в нашем исследовании была установлена ассоциация с повышенным риском развития ЗНО. В то же время полиморфизм GPX1 (rs1050450), который также был сопряжен с повышенным риском развития ЗНО, не вошел в модель — вместо него по результатам тестирования был определен CYBA (rs4673). Однако учитывая его незначительный вклад (0,06%) на данном этапе работы сложно однозначно определить его роль. По результатам исследований [21], rs4673 ассоциирован с повышенным риском развития рака молочной железы. У лиц с генотипом С/Т и Т/Т rs4673 риск развития рака молочной железы в 1,42 раза выше, чем у лиц с генотипом С/С. 

По всей видимости, повышенное образование АФК вследствие радиационного воздействия на фоне пониженной ферментативной активности супероксиддисмутазы предположительно может играть роль в усилении окислительного стресса, повреждении клеточных компонентов, ДНК и, как следствие, приводить к повышению риска развития ЗНО.

ВЫВОДЫ

Исследование показало, что полиморфные локусы генов, регулирующих оксидантный статус клеток, такие как аллель rs4880*С гена SOD2 (ОШ = 1,49; 95%-й ДИ = 1,02–2,18; р = 0,039) и аллель rs1050450*Т гена GPX1 (ОШ = 2,00; 95%-й ДИ = 1,11–3,62; р = 0,024), связаны с повышенным риском развития ЗНО у хронически облученных лиц. Модель межфакторных взаимодействий также позволила установить повышенный риск развития ЗНО у носителей минорных аллелей rs4880*С, rs4673*Т и дозы облучения ККМ. Для выявления модифицирующего эффекта облучения при наличии неблагоприятных аллелей по полиморфным участкам генов антиоксидантной системы требуются дополнительные исследования.