Принципиальные основы современной радиационной микробиологии нашли широкое применение в медицине и ветеринарии (стерилизация веществ микробного происхождения, антибиотиков, крови, сывороток, вакцин, питательных сред, оценка биологической безопасности облученных кормов и пищевых продуктов) [1, 2]. Радиоинактивированные бактерии и вирусы, а также антигены (радиовакцины, радиоантигены) успешно используют в области инфекционной патологии в качестве профилактических и диагностических средств. Установленные антимикробные эффекты ионизирующих излучений позволили постулировать важнейшие для радиомикробиологии и радиовирусологии положения, которые составляют основу современной радиационной микробиологии и радиационной генетики микроорганизмов, и используются при получении и конструировании радиовакцин и радиоантигенов [3–6]. При этом весьма важную роль играют сведения о том, что радиоинактивация микроорганизмов сопровождается резким снижением токсичности микробов и изменением их метаболизма с индукцией синтеза субстанций, обладающих радиопротекторными свойствами [7–10].

Снижение токсичности микроорганизмов с одновременной индукцией синтеза радиопротекторных субстанций в процессе ослабления или радиоинактивации послужили основанием для изучения у облученных микроорганизмов способности оказывать радиозащитное действие при поражении организма ионизирующей радиацией [11, 12]. При этом установлено, что использование как корпускулярных вакцин из грамотрицательных бактерий (сальмонелл, эшерихий, клебсиелл и др.), так и клеточных компонентов метаболитов микробов (эндо-, экзотоксины, полисахариды, ДНК) при назначении веществ микробного происхождения (ВМП) за несколько часов или от 1 до 2 суток до и в первые часы и сутки после облучения способствует значительному повышению выживаемости облученных животных [13–16].

Цель исследования — изучить влияние гаммалучей на золотистый стафилококк и возможности использования облученных вариантов микробов в качестве противорадиационного средства.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве тест-штамма использовали золотистый стафилококк Staphylococcus aureus штамм (шт.) 209, полученный из отдела государственной коллекции микроорганизмов ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности», Казань, Россия. Перед облучением культуры выращивали в жидкой питательной среде Китта–Тароцци с добавлением 1% нормальный сыворотки крупного рогатого скота (ФГБНУ «Федеральный центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности»; Россия), термостатировали при температуре 37 °С в течение 72 ч. Выращенную трехсуточную культуру разливали в стерильные флаконы и осаждали центрифугированием при 3000 об./мин в течение 40 мин. Супернатант сливали, а центрифугат разводили стерильной дистиллированной водой до концентрации 1 × 10⁹ микробных клеток (м. к.) в 1 см³. Полученную взвесь культуры St. аureus фасовали во флаконы по 10 см³, закрывали их резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками. После этого флаконы с тест-культурой облучали на гамма-установке «Исследователь» (Завод «Балтиец»; Эстония) с источником излучения ⁶⁰Со при мощности экспозиционной дозы 2,652 × 10^–2 А/кг в поглощенных дозах 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 и 70 кГр. Степень инактивации гамма-облученных взвесей St. аureus определяли путем высева их на среду Китта–Тароцци с последующим термостатированием в течение 7 суток и ежедневной регистрацией наличия или отсутствия роста микроорганизмов.

С целью отбора радиорезистентных мутантов выросшие одиночные субкультуры многократно пересевали на среду Китта–Тароцци, содержащую нормальную сыворотку крупного рогатого скота, до сплошного роста культуры. Полученные субкультуры при сплошном росте подвергали дальнейшему гамма-облучению в постепенно возрастающих вышеуказанных дозах.

Облученные культуры подвергали микробиологическому анализу, для чего делали серийные разведения в стерильном фосфатном буфере и анализировали на колониеобразующей единице (КОЕ) с помощью стандартных процедур путем пересева на чашки Петри с МПА. Последние инкубировали в течение 24 ч при температуре 3 °С. Количество КОЕ подсчитывали на 3 чашках Петри с 30–300 колониями с помощью автоматического счетчика колоний New Brunswick Scientific Rietran II R (New Brunswick Scientific; США) и находили среднее арифметическое для каждого образца. Жизнеспособность клеток выражали в виде среднего log10 ± SD трех повторностей.

С выращенных культур делали мазки, окрашивали по Граму, микроскопировали под иммерсией с 90-кратным увеличением.

Противорадиационную активность облученных вариантов St. аureus и радиорезистентного варианта St. аureus шт. 209R испытывали на облученных в летальных дозах беспородных белых мышах со средней живой массой 18–20 г. Моделирование острой лучевой болезни (ОЛБ) осуществляли с помощью стационарной гамма-установки «Пума» (АО «В/О “Изотоп"»; Россия) с источником излучения ¹³⁷Cs в дозе 7,9 Гр (ЛД_100/30) с мощностью дозы 2,5 × 10^–5 А/кг неравномерностью гамма-поля, не превышающей 10%.

Опыты проводили на 117 белых мышах, разделенных на 13 групп по 9 животных в каждой. Животные 12 групп были подвергнуты гамма-облучению в летальной дозе (7,9 Гр) и через 3 суток однократно подкожно в объеме 0,2 см³ (2 × 10⁸ м. к./особь) им вводили исходную необлученную культуру St. аureus шт. 209 (1-я группа), облученную в дозе 30 кГр культуру St. аureus шт. 209 (2-я группа), облученную в дозе 35 кГр культуру St. аureus шт. 209 (3-я), облученную в дозе 40 кГр культуру St. аureus шт. 209 (4-я), облученную в дозе 45 кГр культуру St. аureus шт. 209 (5-я), облученную в дозе 50 кГр культуру St. аureus шт. 209 (6-я), облученную в дозе 55 кГр культуру St. аureus шт. 209 (7-я), облученную в дозе 60 кГр культуру St. аureus шт. 209 (8-я), облученную в дозе 65 кГр культуру St. аureus шт. 209 (9-я), облученную в дозе 70 кГр культуру St. аureus шт. 209 (10-я), радиорезистентную культуру St. аureus шт. 209R₇₀ (11-я). Облученным животным контрольной группы (12-я группа) в аналогичных условиях вводили 0,2 см³ физиологического раствора. Животных 13-й группы не облучали и не лечили, они служили биологическим контролем.

За облученными, контрольными и опытными животными вели наблюдения в течение 30 суток, регистрируя павших и выживших животных. Влияние испытуемых веществ микробного происхождения оценивали по критерию выживаемости и срокам продолжительности жизни (СПЖ), морфологическому и биохимическому составу крови общепринятыми в радиационной гематологии методикам, состоянию антиоксидантной защиты (по уровню синтеза малонового диальдегида).

Учитывая, что облучение животных, растений и микроорганизмов сопровождается образованием токсических продуктов радиолиза (радиотоксинов), опыты проводили по индикации указанных метаболитов в исходной и облученных культурах стафилококка. Для индикации радиотоксинов в исследуемых пробах использовали РНГА-тест путем постановки реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием разработанного нами антительного варианта противорадиационного эритроцитарного диагностикума (АТЭД), представляющего собой сенсибилизированные антирадиотоксической гипериммунной сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана.

Иммунохимический анализ дезинтегрантов облученных вариантов St. аureus шт. 209 проводили путем постановки РНГА с АТЭД. Для этого из полученных дезинтеграторов готовили последовательные двукратные (1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 и т. д.) разведения антигена на физиологическом растворе и добавляли к каждому разведению по 1 капле (330 мкл) сенсибилизированных антирадиотоксической сывороткой формалинизированные и танизированные эритроциты барана — АТЭД. Смесь испытуемых антигенов и диагностикума тщательно перемешивали до гомогенной взвеси и оставляли на 2–2,5 ч в термостате при температуре 37 °С.

Результаты реакции оценивали по общепринятой в иммунологии методике. Количественную оценку реакции выражали в титрах радиотоксина (1 : 2, 1 : 4, 1 : 8 и т. д.) или в логарифмах с основанием 2 (1 : 2 = 1log₂; 1 : 4 = 2log₂ и т. д.).

Реакцию сопровождали соответствующими контролями. В качестве положительного контроля в РНГА использовали стандартный хиноидный радиотоксин, полученный от летально облученного St. аureus шт. 209, а в качестве отрицательного контроля использовали необлученный вариант указанной культуры.

На следующем этапе работы проводили исследования по определению пероксидазной активности в клеточной суспензии и культуральной жидкости радиорезистентного варианта St. aureus шт. 209R₇₀ [17]. При этом в качестве окисляемого субстрата использовали пирогаллол, который окислялся в пурпурогаллин с максимумом поглощения. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре СФ-46 (ОАО «ЛОМО»; Россия). Клеточную суспензию и культуральную жидкость исходные и радиорезистентные варианты St. aureus получали общепринятым методом путем центрифугирования бульонной культуры, разводя центрифугат до концентрации 1 × 10³ м. к./см³, а супернатант использовали как культуральную жидкость.

Исследуемый раствор содержал 0,8 мг 0,006 М натрийфосфат буфера pH 6,8; 0,12 см³ ферментной вытяжки (суспензия, центрифужная жидкость); 0,5 см³ 0,15%-ной Н₂О₂; 1,1 см³ Н₂О и 0,5 см³ 0,003 М пирогаллола. В контроле вместо Н₂О₂ добавляли 0,5 см³ Н₂О.

Активность фермента определяли по формуле:

A = D_t2‒D_t1 / (t2‒t1) × c,

где А — активность фермента, D — оптическая плотность, t — время, с — концентрация.

Измерения проводили в течение 2,5–3 мин.

В следующей серии опытов изучали механизм противорадиационного действия St. aureus шт. 209R₇₀ на облученный организм. Для этой цели опыты проводили на 30 белых мышах живой массой от 15 до 20 г, разделенных на три группы по 10 животных в каждой. Животных 1-й и 2-й групп подвергли гамма-облучению на установке «Пума» в летальной дозе (7,9 Гр, ЛД_100/30). Через 3 суток после облучения животным 1-й группы однократно подкожно вводили радиорезистентный вариант St. aureus шт. 209R₇₀ с титром 1 × 10⁸ м. к./особь в объеме 0,2 см³. Облученным в указанной дозе гамма-лучей животным 2-й группы вводили 0,2 см³ стерильного инъекционного раствора (контроль облучения). Необлученные животные 3-й группы никакие средства не получали — служили биологическим контролем.

За облученными животными вели наблюдение в течение 30 суток, изучая клинику, форму течения ОЛБ. Противорадиационную активность препарата оценивали по выживаемости, СПЖ, а также по морфологическому составу крови, состоянию системы антиоксидантной защиты, синтезу цитокинов и реакции системы клеточного обновления (опустошение и восстановление кроветворных клеток костного мозга).

Цитокининдуцирующую активность радиорезистентного варианта St. aureus шт. 209R₇₀ оценивали путем определения концентрации интерлейкина 1β (IL1β) в сыворотке крови и суспензии костного мозга методом иммуноферментного анализа (ИФА) через 24, 48, 72 ч после облучения и применения лечебного препарата. Коммерческий набор Mouse IL1β для ИФА (Biosourse, R&D и Eudogen; США) имел предел чувствительности для IL1β 50 нг/см³ [18]. Для оценки уровня секреции ИЛ1β клетками костного мозга бедренную кость отпрепарировали в асептических условиях, тщательно измельчали в 0,5 см³ физиологическом растворе с добавлением гепарина. Полученную суспензию инкубировали в течение 5 ч при 37 °С, а затем центрифугировали 10 мин при 800 g. Содержание цитокинов в супернатанте определяли в расчете на 1 млн клеток костного мозга и на общее количество миелокариоцитов в бедре.

В качестве интегрального показателя противорадиационного эффекта испытуемого средства использовали 30-суточную выживаемость. Гемопротекторный эффект препарата оценивали путем подсчета клеток периферической крови на автоматическом анализаторе MINOS STO (Horiba ABX Diagnostics; Франция). Функциональную полноценность системы антиоксидантной защиты определяли путем измерения концентрации в сыворотке крови стабильных альдегидных продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), реагирующей с тиобарбитуровой кислотой [19].

Материалы исследований обрабатывали статистически с использованием параметрических методов. Степень достоверности результатов между сравнительными показателями определяли по критерию Стьюдента с поправками Бонферрони.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение радиочувствительности тест-штамма St. aureus 209 к гамма-лучам показало, что микроорганизм обладает высокой радиорезистентностью. Результаты наших исследований показали, что отсутствие роста наблюдалось лишь в образце, облученном в дозе 70 кГр, при наличии слабого роста в диапазоне доз от 45 до 65 кГр [20].

После облучения в дозах от 40 до 70 кГр рост культур отсутствовал в течение 4 суток после высева, а при длительном культивировании (120 ч) вырастали единичные колонии. Поэтому опыты по изучению формирования радиорезистентности исходной культуры к гамма-лучам в процессе последовательного облучения выживших колоний в возрастающих дозах излучений были продолжены. При этом для получения радиорезистентного варианта St. аureus выросшие единичные колонии после летального облучения (40 кГр) подвергали длительному пассажу на средах Китта–Тароцци, МПА и МПБ до получения сплошного роста культуры. Такие операции повторяли многократно с использованием возрастающих доз гамма-лучей 45, 50, 55, 60, 65 и 70 кГр.

При микроскопии мазков, изготовленных из облученной культуры и окрашенной по Граму, в поле зрения отчетливо обнаруживаются грамположительные одиночные и парные кокки в виде несимметричных виноградных гроздей, характерные для данной культуры.

В результате проведенных исследований установлено, что из исходной культуры St. аureus шт. 209 путем отбора выживших единичных колоний после каждой дозы облучения и длительного пассирования на соответствующих питательных средах, на 10-м пассаже после облучения в дозе 70 кГр, получили радиорезистентный вариант St. аureus шт. 209R₇₀, радиоустойчивость к гамма-лучам которого превосходила исходный штамм в два раза.

Облученные в вышеуказанных дозах от 30 до 70 кГр St. аureus 209 (30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70) и радиорезистентный вариант (St. аureus шт. 209R₇₀), на следующем этапе работы были испытаны на радиозащитные свойства на летально облученных белых мышах.

При подкожном введении облученных культур St. введения образовывалась небольшая припухлость, которая в течение суток рассасывалась. В контрольной группе у животных, которым вводили St. aureus шт. 209 (исходная необлученная культура), на месте инъекции наблюдали припухлость, местную гиперемию, болезненность.

Противорадиационная активность испытанных необлученного и облученных вариантов St. аureus 209, изученная на летально облученных белых мышах, представлена в табл. 1.

Облучение стафилококков гамма-лучами в дозах от 30 до 40 кГр приводит к модификации тестмикробов, сопровождающейся повышением их противорадиационной активности, обеспечивая от 55 до 66,6% выживаемости летально облученных животных, что превышает исходный противорадиационный уровень в 1 группе в 2–3 раза (табл. 1). Дальнейшее увеличение дозы облучения исходной культуры оказывает отрицательное действие на микробы — противорадиационный уровень облученных животных в дозах от 45 до 70 кГр снижается от 44,4 до 22,2% соответственно.

В отличие от однократного облучения исходной культуры в дозах от 30 до 70 кГр, многократное облучение исходной культуры, полученное в ходе эксперимента из субкультур стафилококков в постепенно возрастающих дозах, оказывало модифицирующее действие на тест-микробы. Противорадиационная активность радиорезистентного варианта St. аureus шт. 209R₇₀ превышала таковую исходного штамма в 3,5 раза и составляла 77,7%. При этом отмечено, что при использовании облученных вариантов St. аureus в качестве радиозащитных препаратов наряду с повышением выживаемости летально облученных животных наблюдали также увеличение другого важного показателя радиозащиты — средней продолжительности жизни павших животных (СПЖ).

Как видно из приведенных данных, СПЖ у больных ОЛБ животных после применения необлученного варианта St. аureus шт. 209 составляла 8,0 дней. Применение облученных в дозах от 30 до 50 кГр культуры приводило к увеличению этого показателя до 11,0–13,7 дней (варианты 6, 5, 4, 3, 2). Использование радиорезистентного варианта St. аureus шт. 209R₇₀ в качестве радиозащитного препарата обеспечивало увеличение срока продолжительности жизни павших животных до 17,5 дней против 8,0 дней у исходного штамма стафилококка, что превышает таковой исходного штамма в 2,19 раза.

Повторение вышеописанных экспериментов на другом виде лабораторных животных — белых крысах, облученных в летальных дозах (9,5 Гр, ЛД_100/30) и леченных радиомодифицированными вариантами St. аureus шт. 209 (30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70) и радиорезистентным вариантом (St. аureus шт. 209R₇₀), показало аналогичные результаты.

Облучение исходной культуры St. аureus шт. 209 гаммалучами в дозах от 30 до 70 кГр оказывает разнонаправленное действие на способность облученных культур индуцировать различную степень радиорезистентности организма летальному облучению (табл. 1). При этом установлено, что культуры St. аureus шт. 209, облученные в дозах от 30 до 40 кГр, повышали противорадиационный уровень до 66,6%, а облучение исходной культуры в дозах, начиная с 45 кГр и выше, оказывало противоположное действие, снижая радиозащитную активность облученных вариантов стафилококков до 22,2%.

Результаты индикации хиноидного радиотоксина в дезинтеграторах облученного различными дозами гаммалучей золотистого стафилококка в РНГА тест-системе с антительным вариантом эритроцитарного диагностикума представлены в табл. 2.

Облучение стафилококка гамма-лучами индуцирует усиление синтеза токсических продуктов радиолиза (радиотоксинов), которые в малых дозах (2,0–4,0 log₂) оказывают стимулирующее действие на организм (табл. 2). Выживаемость летально облученного животного повышается до 66,6%, а избыточное образование токсических продуктов (6,0–10,0 log₂) снижает выживаемость облученных животных, противорадиационный процент при этом составляет от 44,4 до 22,2%. Следовательно, оптимальной дозой облучения культуры стафилоккока гамма-лучами составляет 30–35 кГр, а повышение дозы облучения ведет к усилению синтеза микроорганизмом радиотоксина, то есть обуславливает снижение противорадиационных факторов облученных вариантов St. aureus.

В этой связи представляет интерес повышение противорадиационных свойств радиорезистентного варианта St. aureus шт. 209R₇₀, полученного путем многократного облучения исходной культуры и ее субкультур постепенно возрастающими дозами от 30 до 70 кГр. Известно, что развитие радиорезистентности сопровождается синтезом антиокислительных ферментов (каталазы, супероксиддисмутазы), проводили опыты по определению антиокислительного фермента — пероксидазы. Выбор указанного фермента для исследования обусловлен тем, что пероксидаза является антиоксидантным ферментом, одна из основных функций которого — это разрушение опасных для жизнедеятельности клеток токсических продуктов радиолиза — пероксидов.

Результаты измерения пероксидазной активности вариантов St. aureus шт. 209 и St. aureus шт. 209R₇₀ представлены в табл. 3.

Оба опытных варианта St. aureus обладают пероксидазной активностью (табл. 3). Однако у радиорезистентного варианта она была в 2,17 раза больше (p < 0,01) по сравнению с исходным вариантом микроба. Аналогичную тенденцию увеличения пероксидазной активности наблюдали в культуральной жидкости, в которой выращивали испытуемые микробы. При этом концентрация пероксидазы в культуральной жидкости, полученной при выращивании St. aureus шт. 209R₇₀, была в 3 раза выше (p < 0,001), чем таковая исходной культуры.

Полученные в этом эксперименте данные относительно повышения концентрации антиоксидантного фермента пероксидазы в культуральной жидкости во время инкубирования St. aureus шт. 209R₇₀ показывают то, что испытуемая культура способна синтезировать и экспрессировать данный фермент in vivo, то есть в организме интактных и облученных животных, оказывая антиоксидантное и, следовательно, противорадиационное действие.

С учетом сказанного нами была проведена серия опытов по изучению механизма радиозащиты организма на фоне применения радиорезистентных вариантов St. aureus шт. 209R₇₀ в качестве потенциального противорадиационного средства.

Результаты динамического наблюдения за подопытными животными показали, что однократное подкожное введение радиорезистентного варианта St. aureus шт. 209R₇₀ оказывало радиомодифицирующее действие, изменяя как течение ОЛБ, так и выживаемость облученных животных, а также увеличивая срок продолжительности жизни павших животных. При этом установлено, что ОЛБ у контрольных (облученных) животных протекала в тяжелой форме с СПЖ 6,8 суток. В отличие от контроля, у животных опытной группы, получавших в качестве противорадиационного средства St. aureus шт. 209R₇₀, ОЛБ проходила в более легкой форме. При этом выживаемость животных составляла 77,7%, а СПЖ павших животных составлял 17,5 против 6,8 сут в контрольной группе облучения.

Повышение выживаемости летально облученных животных на фоне применения испытуемого препарата сопровождалось коррекцией радиоиндуцированной панцитопении (табл. 4).

Летальное облучение белых мышей вызывает гемотоксическое действие, сопровождающееся опустошением костного мозга (гибель миелокариоцитов) и угнетением гемопоэза (достоверная лейко- и лимфопения) (табл. 4). Применение испытуемого препарата оказывало гемопротекторное и миелопротекторное действия, предотвращая развитие тяжелой панцитопении, сохраняя пул миелоцитов и гранулоцитов в костном мозге и периферической крови.

Гемопротекторное действие испытуемого препарата реализовалось путем ингибирования синтеза токсических продуктов радиолиза (малондиальдегида) и усиленного синтеза медиаторов иммуногемопоэза цитокинов (табл. 5).

Летальное облучение животных гамма-лучами сопровождается резким увеличением МДА (в 5,85 раза, р < 0,001) в сыворотке крови с одновременным снижением синтеза иммунорегуляторного цитокина — IL1β (табл. 5).

Применение на этом фоне веществ микробного происхождения (радиорезистентного варианта St. aureus шт. 209R₇₀) оказывает антиоксидантное действие, ингибируя процессы свободнорадикального и перекисного окисления липидов, снижая синтез альдегидных продуктов ПОЛ малондиальдегида.

Одновременно используемый препарат микробного происхождения проявил себя как усилитель синтеза интерлейкина IL1β в периферической крови и костном мозге облученных животных.

Описанные биохимические изменения в органах иммуногемопоэза под воздействием препарата микробного происхождения обеспечивают 70% выживаемость летально облученных животных.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В последние годы, при изучении различных аспектов механизма противолучевого действия, отечественными и зарубежными исследователями был накоплен экспериментальный материал, свидетельствующий о способности веществ микробного происхождения (эндотоксины, полисахариды, анатоксины и т. д.) повышать резистентность организма к ионизирующим излучениям [4, 11, 13–16]. С учетом изложенного проводили настоящие исследования по оценке радиозащитных свойств радиомодифицированного варианта St. aureus.

Проведенные опыты убедительно показали, что облучение стафилококков гамма-лучами в дозах 30–40 кГр оказывает на микробы модифицирующее действие, повышая их противорадиационные свойства на 22,2% по сравнению с исходной культурой. Эти результаты хорошо согласуются со всеми литературными данными по изучаемой проблеме. Многими авторами было показано, что корпускулярные микробы, микробные полисахариды, экзо-, эндотоксины и анатоксины на 20–30% повышают выживаемость экспериментальных животных, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации в дозах порядка ЛД_80-90/30 [21]. Не подлежит сомнению, что этими же свойствами обладают и липополисахариды стафилококков, содержащихся в вакцинных и других бактериальных препаратах [22].

Выбор стафилококков в качестве модели для конструирования микробного радиопротектора обоснован тем, что, во-первых, эти микробы продуцируют сильные экзо- и эндотоксины, которые под воздействием физико-химических факторов (УФ-, ионизирующая радиация, формалин и т. д.) переходят в анатоксины, обладающие радиозащитными свойствами [23], во-вторых, St. aureus обладает мощной антиоксидантной системой и способностью индуцировать антиокисидантные ферменты [24] и цитокины [25] и, в-третьих, из фаголизатов патогенных штаммов стафилококков получают высокоэффективные лечебные препараты широкого спектра биологического действия.

При проведении настоящих исследований исходили из того, что известна роль микроорганизмов в защите против действия ионизирующей радиации. Под влиянием веществ микробного происхождения в организме животных активируются защитные механизмы в виде усиления пролиферации кроветворных клеток гранулярного и лимфоидного рядов, непосредственно участвующих в реакции иммунного ответа, возрастает количество тромбоцитов, гранулоцитов, гемоглобина, усиливается активность эндогенных и экзогенных клеток лимфоидной системы селезенки, лимфоузлов [26]. Кроме этого, также учитывали, что облучение микробов в дозах, недостаточных для разрушения молекул их ДНК, не вполне приемлемых для ДНК перестройки с изменением фрагментов ДНК цепочек, может привести к образованию бактерий-мутантов с отличительными культуральноморфологическими свойствами с приобретением некоторых полезных качеств, а именно способностью продуцировать определенные субстанции, полезные с точки зрения человеческой практики [27].

С учетом необходимости разработки новых безопасных и эффективных противорадиационных средств для лечения ОЛБ, нами были проведены настоящие исследования по оценке противорадиационного действия ВМП, в качестве которых использовали препараты, полученные из стафилококков. Как рабочую гипотезу при проведении исследований мы использовали данные о том, что физическое воздействие на микробы индуцирует повышение радиорезистентности облученного организма путем индукции микроорганизмами Toll-подобных рецепторов (TLR) [4].

Для проверки правомочности этой гипотезы мы воздействовали на стафилококки гамма-лучами в широком диапазоне доз от 30 до 70 кГр. Опыты показали, что гамма-облучение стафилококков, в зависимости от дозы, оказывает разнонаправленное действие на микроорганизм, повышая или снижая радиозащитную эффективность St. aureus. Установлено, что облученные гамма-лучами культуры стафилококка в дозах от 30, 35 и 40 кГр обладали радиозащитной активностью, защищая 55,5–66,6% летально облученных белых мышей от радиационной гибели. Однако дальнейшее повышение дозы облучения (от 45 до 70 кГр) оказывало противоположный эффект, снижая уровень защиты животных от ОЛБ. Снижение радиозащитной активности облученных в высоких дозах вариантов St. aureus объясняется усилением образования радиотоксинов в облученных культурах, что и обуславливает повышение смертности облученных животных, вследствие суммации (потенцирования) токсических эффектов облученных микробов и макроорганизма [20].

Многократное облучение микроорганизмов постепенно возрастающими дозами ионизирующих излучений ведет к ступенчатому возрастанию радиорезистентности [27], сопровождающейся изменением метаболизма клеток с индукцией эндогенных радиопротекторов [21], и нами были проведены исследования по получению радиозащитного варианта St. aureus. Путем многократного облучения тест-микроба постепенно возрастающими дозами гамма-лучей в диапазоне 30–70 кГр нами был получен радиорезистентный вариант St. aureus 209R₇₀, который выживал при сверхлетальной дозе облучения (70 кГр). Изучая механизм формирования направленного приобретения чрезвычайной радиорезистентности St. aureus установили, что процесс адаптационного приспособления к сверхлетальной дозе гамма-лучей сопровождается изменением метаболизма микробных клеток с увеличением антиоксидантного фермента — пероксидазы, играющей одну из ключевых ролей в условиях воздействия на организм стресс-факторов, в том числе ионизирующей радиации [17]. Полученные нами данные согласуются с данными других исследователей, которые наблюдали у радиотерморезистентных мутантов St. aureus усиление продукции антиоксидантных ферментов (супероксидисмутазы, гидропероксидазы), убихинона, усиленной рекомбинационной репарации ДНК [7, 28].

Способность радиоустойчивого варианта St. aureus синтезировать антиоксидантные ферменты в процессе его радиоадаптации обуславливала повышение его противорадиационных свойств при применении его в качестве противолучевого средства в условиях in vivo. В опытах на белых мышах, облученных гамма-лучами в абсолютно летальных дозах (7,9 Гр, ЛД_100/30), показано, что однократное подкожное введение радиорезистентного варианта St. aureus 209R₇₀ в дозе 2 × 10⁸ м. к./особь через 3 суток после облучения обеспечивало 77% выживаемость при 100% гибели нелеченых животных. Повышение выживаемости облученных и леченых St. aureus 209R₇₀ животных сопровождалось переходом острой формы ОЛБ в легкую, которая была обусловлена предотвращением панцитопении и депопуляции костного мозга. Механизм гемо- и миелопротекторного эффекта облученного гаммалучами микроба (St. aureus 209R₇₀) реализовался, во-первых, путем перехвата и нейтрализации антирадикальными ферментами (пероксидазой и супероксиддисмутазой) радиоиндуцированных токсических продуктов радиолиза радиотоксинов (малондиальдегида), основной мишенью атаки которых служат клетки системы иммуногемопоэза (лимфоциты, моноциты, стволовые клетки костного мозга) и, во-вторых, путем индукции испытуемым микроорганизмом цитокинов (в нашем случае IL1β), инициирующих пострадиационное восстановление гемопоэза, что согласуется с данными других исследователей [29, 30].

ВЫВОДЫ

Полученные данные свидетельствуют о том, что лечебные средства, полученные на основе St. aureus, подвергнутые радиационному воздействию в диапазоне доз от 30 до 40 кГр, обладают противорадиационной эффективностью, обеспечивая 66,6% выживаемость летально облученных животных, а радиорезистентный вариант St. aureus шт. 209R₇₀ превосходит указанные препараты, увеличивая до 77,7% выживаемость облученных в ЛД100/30 животных от радиационной гибели.

Вещества микробного происхождения перспективны и целесообразны, поскольку препараты этого класса являются безвредными и главное, обладают полифункциональными (иммунотропными, антиоксидантными, гемо- и миелопротективными) свойствами.

В связи с вышеизложенным, считаем целесообразным продолжить поиски повышения эффективности ВМП, поскольку включение препаратов этого класса в арсенал средств борьбы с лучевым поражением позволило бы повысить эффективность комплексного противолучевого лечения.