Коронавирусы (Coronaviridae) относятся к семейству РНК- содержащих вирусов, способных инфицировать человека и некоторых животных. У людей коронавирусы могут вызвать целый ряд заболеваний - от легких форм острой респираторной инфекции до тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС). В настоящее время известно о циркуляции среди населения четырех коронавирусов (HCoV-229E, -ОС43, -NL63 и -HKU1), круглогодично присутствующих в структуре острых респираторных вирусных инфекций, и, как правило, вызывающих поражение верхних дыхательных путей (ВДП) легкой и средней тяжести [1].
До 2002 года коронавирусы рассматривались в качестве патогенов, вызывающих заболевания ВДП с крайне редкими летальными исходами. В конце 2002 года был зарегистрирован коронавирус SARS-CoV - возбудитель атипичной пневмонии, вызывающий ТОРС. Всего за период эпидемии в 37 странах мира зарегистрировано более 8000 случаев, из них 774 со смертельным исходом. С 2004 года новых случаев атипичной пневмонии, вызванной SARS-CoV, не регистрировалось [2].
В 2012 году мир столкнулся с новым коронавирусом MERS (MERS- CoV) - возбудителем ближневосточного респираторного синдрома. С 2012 года зарегистрировано 2494 случая этой коронавирусной инфекции, из которых 858 закончились летальным исходом. Все случаи заболевания географически ассоциированы с Аравийским полуостровом. В настоящий момент MERS-CoV продолжает циркулировать и вызывать новые случаи заболевания [3, 4].

В декабре 2019 года в г. Ухань, провинция Хубэй выявлено заболевание (получившие название COVID-19), вызываемое новым коронавирусом SARS-CoV-2, поставившее перед специалистами в области здравоохранения новые задачи, связанные с необходимостью быстрой диагностики и разработкой тактики клинического ведения больных [5]. В настоящее время сведения об эпидемиологии, клинических особенностях, профилактике и лечении COVID-19 ограничены и противоречивы. Вирус отнесен ко II группе патогенности, как и некоторые другие представители этого семейства (вирус SARS-CoV-1, MERS-CoV). Наиболее распространенным клиническим проявлением нового варианта коронавирусной инфекции является пневмония, у значительного числа пациентов зарегистрировано развитие острого респираторного дистресс-синдрома.
К препаратам, отобранным для применения при заражении 2019-nCoV, относятся производные хинолина - хлорохин и гидроксихлорохин [6]. Ранее была продемонстрирована противовирусная активность хлорохина и гидроксихлорохина в отношении SARS-CoV в исследованиях на культуре клеток [7], при этом активность хлорохина была примерно в пять раз выше, чем активность гидроксихлорохина (EC₅₀ в культуре клеток составила 6,5±3,2 мкМ и 34±5 мкМ, а индекс селективности - >15 и >3, соответственно). Еще большая противовирусная активность хлорохина установлена в отношении штамма HCoV-OC43 (возбудитель атипичной пневмонии). EC₅₀ хлорохина по подавлению репликации вируса в культуре клеток составила 0,306 ± 0,091 мкM.

В экспериментах на мышах установлено, что хлорохин в дозе 15 мг/кг (около 80 мг в пересчете на человека) обеспечивал выживаемость мышей при заражении HCoV-OC43 в дозе 10³ копий [8]. Также была отмечен эффект хлорохина, связанный с блокадой репликации вируса MERS в концентрациях 3-8 мкМ [9].

В сравнительном исследовании противовирусной активности хлорохина и гидроксихлорохина in vitro [10] были построены кривые «доза-эффект» при четырех различных кратностях заражения (multiplicities of infection - MOI) путем количественного определения количества копий вирусной РНК в супернатанте клеток через 48 ч после заражения. Препараты были внесены в культуру клеток профилактически за 1 ч до заражения вирусом.
В зависимости от дозы заражения, ЕС₅₀ для гидроксихлорохина составила 4,51-12,96 мкМ. Цитотоксическая доза гидроксихлорохина относительно клеточной культуры более чем в 100 раз превышала среднеэффективную дозу в отношении вируса.
В другом исследовании [11] при использовании MOI=0,01 и лечебном применении гидроксихлорохина (внесение препаратов в среду переживания проводили через 2 ч после инкубации культуры клеток с вирусными частицами при 37 °С) EC₅₀ через 24 ч составило 6,14 мкМ (2060 мкг/мл), а через 48 ч – 0,72 мкМ (258 мкг/мл).
Эти препараты, наряду с другими лекарственными средствами, вошли в 5-е и 6-е издания Руководства по профилактике, диагностике и лечению COVID-19, изданные в Китае в январе-феврале 2020 г. Гидроксихлорохин был включен во «Временные методические рекомендации. Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции «COVID-19» (версии 4-6), изданные Министерством здравоохранения Российской Федерации в 2020 г.
К числу других противомалярийных препаратов, которые потенциально могут применяться при новой коронавирусной инфекции, вызванной SARS-CoV-2, относится Мефлохин. Препарат был разработан для лечения форм малярии, устойчивых к хлорохину и гидроксихлорохину.

Исследования, посвященные противовирусной активности Мефлохина, ограничены. Тем не менее, у него была выявлена противовирусная активность в отношении вируса лихорадки Эбола [12], вирусов Денге и Зика [13]. Активность Мефлохина в отношении различных коронавирусов была выявлена в исследованиях in vitro. В сравнительных исследованиях, проведенных на модели заражения культуры клеток вирусом FCoV (кошачий коронавирус), было отмечено, что среди 19-ти различных исследованных соединений к числу наиболее активных относятся хлорохин и Мефлохин. Противовирусная активность Мефлохина в 2-5 раз превышает активность хлорохина, а его среднеэффективная доза, подавляющая цитопатический эффект вируса в культуре клеток, составила 7,5-8,31 мкМ. Среднеэффективная доза по эффекту подавления репликации вируса составила 4,43-7,36 мкМ [14]. Противовирусная активность Мефлохина усиливается при его комбинированном применении с интерфероном [15].
Была выявлена противовирусная активность Мефлохина и в отношении коронавируса 2019-nCoV. Установлено, что Мефлохин блокирует цитопатический эффект коронавируса в культуре клеток и препятствует его репликации в концентрациях не более 10 мкМ (4 мкг/л) [16], однако более точного определения среднеэффективной дозы Мефлохина не проводилось.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При выполнении исследования использовались образцы трех серий субстанции Мефлохин (№ 010719, № 020719, № 030719), разработанных в ФГУП НПЦ «Фармзащита» ФМБА России. В работе использовали вирус SARS-nCoV, вариант В, полученный в 2020 году из ФГБУ ГНЦ ВБ «Вектор» (Роспотребнадзор) без данных о выделении, который хранится в Специализированной коллекции ФГБУ «48 ЦНИИ» Минобороны России. В экспериментах использовали постоянную культуру клеток почки африканской зеленой мартышки - Vero С1008. В качестве ростовой и поддерживающей культур использовали среду Игла (МЕМ) на солевом растворе Хенкса, содержащую соответственно 7,5 % и 2 % фетальной телячьей сыворотки.
Оценку биологических свойств возбудителя SARS-CoV-2 оценивали титрованием вируссодержащей суспензии в культуре клеток Vero С1008 по цитопатическому действию вируса.
Цитотоксичность образцов препарата Мефлохин оценивали методом визуального наблюдения за состоянием культуры клеток Vero С1008 с помощью светового микроскопа при малом увеличении. Концентрации препаратов, оказывающие цитопатическое действие на клетки (деструкция монослоя клеток и их разрушение по данным визуального наблюдения), рассматривали как токсические. При этом определяли: максимально переносимую концентрацию образцов (МПК) -  концентрацию вещества, не вызывающую деструкцию используемой культуры клеток. Оптимальный срок контакта изучаемого соединения с культурой клеток при определении МПК соответствовал периоду максимального функционирования клеточных культур (в среднем 4 суток) [17-19].

Оценку противовирусной эффективности экспериментальных субстанций осуществляли в соответствии с рекомендациями ФГБУ «НЦЭСМП» Минздравсоцразвития России. Противовирусная эффективность Мефлохина оценивалась при внесение его десятикратной концентрации, вызывающей 50 % цитопатический эффект (10 ЦПД₅₀) до инфицирования (за 1 час и 24 часа) и через 1 час после инфицирования. Оценивали влияние на цитопатогенность вируса через 24 часа и 48 часов после инфицирования. Полную деструкцию монослоя отмечали через 48 часов, через 24 часа - разрушение клеток наблюдали в 75 % случаях. Для каждой исследуемой концентрации препарата Мефлохин использовали по 4 пробирки с монослем клеток, в трех независимых опытах (сумма пробирок - 12). Критерием оценки эффективности препаратов являлся коэффициент ингибирования (КИ, %) цитопатогенного действия вируса, рассчитываемый по формуле:

формула

где А_контр - биологическая активность вируса, определенная в клетках без внесения химиопрепарата, (ЦПД); A_оп - биологическая активность вируса, определенная в клетках с внесением химиопрепарата, (ЦПД).
Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы Microsoft Office Exсel 2007.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Приготовление инфицирующих препаратов

Для приготовления инфицирующего препарата вируса SARS-CoV-2, вариант В, использовали культуру клеток Vero С1008. Суспензию клеток с плотностью 200 тыс./мл вносили в стерильные пластиковые флаконы для культуры клеток, инкубировали в течение 24 ч в СО₂-инкубаторе в атмосфере 5 % СО₂ при (37,0±0,5) °С до формирования сплошного монослоя (контроль под малым увеличением светового микроскопа). Культуру вируса разводили на ростовой среде. Множественность инфицирования составила 1 БОЕ на клетку. Адсорбцию вируса проводили в течение 60 мин при (37,0±0,5) °С. По окончании адсорбции инокулят удаляли, клетки промывали тремя объемами среды МЕМ и в каждый флакон вносили 7-8 мл свежей ростовой среды, содержащей 2 % фетальной сыворотки КРС. Флаконы с инфицированным монослоем культуры клеток помещали в СО₂-инкубатор в атмосфере 5 % СО₂ с температурой (37,0±0,5) °С. По истечении времени инкубации (48 часов) проводили криодеструкцию клеток, осветляли и фасовали для хранения при – 70 °С. Оценивали стерильность полученного инфицирующего препарата и его инфекционную активность. Активность рабочей культуры вируса SARS- CoV-2, вариант В, определяли методом негативных колоний на суточном монослое культуры клеток Vero С1008 (БОЕ/мл) и цитопатическому действию вируса (ЦПД₅₀/мл). Наличие посторонней микрофлоры в приготовленных препаратах оценивали посевом 10-кратного разведения на универсальную селективную тиогликолевую среду.

Исследование цитотоксичности препарата Мефлохин для культуры клеток Vero С1008 и его противовирусной активности в отношении вируса SARS-CoV-2

Исследуемые серии препарата Мефлохина вносили в пробирки с монослоем клеток Vero С1008 и, после инкубирования при температуре (37,0±0,5) °С в течение 120 ч, оценивали их повреждающее действие на клетки.
Результаты экспериментов свидетельствуют, что все изученные серии препарата выявили одинаковую цитотоксичность in vitro. Показатель ЦПД₅₀ для используемой культуры клеток составил 4,5 мкг/мл. При этом в концентрациях ниже 2,25 мкг/мл препарат не обладал токсическим действием в отношении культуру клеток, а концентрации, в которых отмечено цитопатическое действие в отношении практически всех клеток монослоя, превышало 8,0 мкг/мл. Таким образом, максимальная переносимая концентрация (МПК) Мефлохина составила 2,25 мкг/мл, а диапазон концентраций препарата для оценки противовирусной активности составил 0,5-2,0 мкг/мл.

Результаты изучения влияния Мефлохина на цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, вариант В, через 24 ч после инфицирования представлены в табл. 1. Результаты были аналогичны для всех изученных серий препарата.
Полученные результаты позволили сделать вывод, что через 24 часа после инфицирования клеток цитопатический эффект вируса отсутствовал при внесении препарата Мефлохин как до инфицирования, так и после заражения клеток в диапазоне концентраций 0,5-2,0 мкг/мл. В контрольной группе цитопатический эффект составил 75 %.

Результаты изучения влияния Мефлохина на цитопатическую активность вируса SARS-CoV-2, вариант В, через 48 ч после инфицирования представлены в табл. 2.
Через 48 часов после инфицирования клеток цитопатический эффект вируса отсутствовал при внесении препарата Мефлохин после заражения клеток в концентрации 2,0 мкг/мл. В контрольной группе цитопатический эффект составил 100 % (12/12). При внесении препарата за 1 час до инфицирования подавление цитопатической активности вируса не выявлено во всех изученных концентрациях. При внесении препарата за 24 часа до инфицирования 50 % подавление ЦПД отмечено в концентрации 1 мкг/мл, 25 % подавление - в концентрации 0,5 мкг/мл.

Результаты оценки влияния препарата Мефлохин на репродукцию вируса в культуре клеток представлены в табл. 3. В качестве препаратов сравнения были использованы препарат Рибавирин и Ребиф^® (Интерферон β1α).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что Мефлохин в концентрации 2,0 мкг/мл при внесении его после инфицирования клеток подавляет репродукцию вируса SARS-CoV-2 на 1,7-1,9 lg, коэффициент ингибирования составил около 99 %.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные результаты позволили доказать, что Мефлохин в концентрации 2 мкг/мл, добавленный к культуре клеток Vero Cl008 через 1 ч после внесения SARS-CoV-2, полностью блокировал действие вируса в течение 2-х суток после инфицирования. Через 1 сутки после инфицирования противовирусное действие Мефлохина регистрировали как при внесении препарата за 24 ч и 1 ч до заражения SARS-CoV-2, так и при его добавлении через 1 ч после инфицирования культуры клеток. При этом 100 % подавление вирусной активности отмечали уже при добавлении Мефлохина в концентрации 0,5 мкг/мл. Изучение токсичности Мефлохина показало, что концентрация, в которой препарат проявляет цитопатическое действие в отношении 50 % клеток Vero Cl008 (ЦПД50), составляет 4,5 мкг/мл. Максимальная переносимая концентрация (МПК) Мефлохина составляет 2,25 мкг/мл.

Таким образом, химиотерапевтический индекс (показатель широты терапевтического действия, представляющий собой отношение его минимальной эффективной дозы к максимальной переносимой) для Мефлохина составил ≥ 2, что свидетельствует о низкой специфической активности препарата. Вместе с тем, следует отметить, что концентрация, в которой отмечается противовирусное действие Мефлохина в отношении SARS-CoV-2, может быть достигнута при приеме препарата в дозах, рекомендованных для профилактики и лечения малярии.

Обобщенные данные фармакокинетических исследований свидетельствуют о том, что при эскалации дозы Мефлохина в диапазоне 250-500-1000-1500 мг (соответствуют «Инструкции по медицинскому применению лекарственного препарата Мефлохин») отмечено практически линейное увеличение максимальной концентрации препарата в плазме крови: 0,25-0,43-0,8-1,22 мкг/мл, соответственно, при неизменном значении t_max – 19,6 ч [20]. При однократном приеме Мефлохина в дозах 750-1500 мг/сут максимальная концентрация в плазме крови достигает 1510 мкг/л [21], а при курсовом приеме увеличивается в 1,8-2,5 раза [22]. Учитывая, что период полувыведения препарата составляет 15,5±10,4 сут, концентрация, обеспечивающая элиминацию вируса, может быть достигнута на 2-е - 3-е сутки приема и поддерживается на протяжении всего срока лечения пациента.
Установлено, что концентрация Мефлохина во внутренних органах и клетках крови более чем в 5 раз превышает концентрацию в плазме крови [23-24], а концентрация в тканях головного мозга может превышать концентрацию в плазме крови в 10-30 раз, достигая 20 мкМ [25]. Это может обеспечить элиминацию вируса из внутренних органов уже в 1-е сутки после начала приема.