Применение различных агентов, преимущественно низкомолекулярных, мишенью которых являются молекулярные шапероны, в особенности Hsp90 и Hsp70, стало в последние годы основой для целого направления в терапии новообразований. Экспрессия белков теплового шока Hsp90 и Hsp70 повышена во многих опухолях, с чем прямо связана селективность накопления ингибиторов Hsp90 в опухолевой ткани [1]. Подавление экспрессии и/или снижение функциональной активности белков теплового шока сопровождается накоплением в клетке поврежденных, частично денатурированных белков с измененными биологическими функциями. Предполагается, что ингибиторы белков Hsp90 и Hsp70 как противоопухолевые средства могут быть наиболее эффективны в комбинации с традиционными цитостатиками для усиления их эффекта или преодоления лекарственной резистентности. В ряде недавних публикаций [2–4] обсуждается синтез различных ингибиторов белка теплового шока Hsp70, представляющих собой небольшие молекулы, структуры которых были получены с применением молекулярного докинга. В частности, описаны условия синтеза 67-ми производных 4-аминопиперидина — потенциальных ингибиторов Hsp70 [4]. В статье представлены результаты скрининга этих веществ на моделях культур клеток in vitro, а также оценки констант комплексообразования с Hsp70, полученные методом поверхностного плазмонного резонанса, и показатели ингибирования АТФ-азной активности Hsp70. В работе [5] описан альтернативный способ синтеза части производных 4-аминопиперидина из [4], а именно 1-(2-алкилтиопиримидин-4-ил)пиперидин-4-N-алкил,Nгетарил/арил аминов. Предложенный способ позволил существенно расширить возможности комбинаторики в синтезе целевых структур для проведения последующего скрининга на культурах клеток и дальнейшей разработки оптимальных кандидатов в качестве цитостатиков. 

В 2018–2019 гг. была синтезирована коллекция производных 4-аминопиперидина, пересекающаяся с коллекцией [4], и проведен скрининг веществ по показателю цитостатической активности на культурах клеток in vitro. В результате скрининга было отобрано три производных 4-аминопиперидина для дальнейшего тестирования на моделях опухолей животных in vivo. Противоопухолевую активность исследуемых веществ изучали на перевиваемых опухолях мышей — лимфоидной лейкемии L1210 и меланоме B16 (солидной). Для лечения опухолей в качестве положительного контроля использовали циклофосфамид на основании рекомендаций [8] и как составляющую моделей.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные

Для поддержания перевиваемых опухолей использовали самок мышей линии C₅₇Bl/6 и самок мышей линии DBA/2. Оценку специфической активности исследуемых препаратов in vivo проводили на опухолях, привитых самкам мышей гибридов BDF1 (C₅₇Bl/6 × DBA/2). Все животные к началу исследования имели вес 20–30 г. Животных приобретали в Научном центре биомедицинских технологий ФМБА (филиал «Столбовая»; Московская область). Животных содержали в помещениях конвенциональной зоны вивария, животные других видов в этой комнате отсутствовали.

Животные были размещены в поликарбонатных клетках (Tecniplast, Италия, размером 26 × 17 × 12 см³), не более шести особей в клетке. Клетки были оборудованы стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением, стальными разделителями для корма и стальными держателями этикеток. Клетки размещали на стеллажах из нержавеющей стали (Tecniplast; Италия).

В качестве подстила использовали древесную стружку («Лабораторкорм»; Россия). Толщина слоя подстила в клетке достигала 5–10 мм.

Для кормления животных применяли стандартный гранулированный корм «Комбикорм ПК-120 для содержания лабораторных крыс, мышей и хомяков» («Лабораторкорм»; Россия). Корм для свободного неограниченного доступа помещали в кормовое углубление на крышке клетки.

Животные получали воду, соответствующую СанПиН 2.1.4.1074-01 (с изменениями от 2 апреля 2018 г.). Подготовленную фильтрованную водопроводную воду для свободного неограниченного доступа давали в стандартных питьевых бутылочках со стальными крышками-носиками. Подготовка воды обеспечивала отсутствие контаминации, способной повлиять на результаты исследования.

Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды при температуре 20–26 °С и относительной влажности воздуха 30–70%. Температуру и влажность в экспериментальной комнате постоянно контролировали с помощью автоматической системы мониторинга климата. В комнате содержания животных поддерживали искусственное освещение в режиме: 12 ч — день / 12 ч — ночь. Кратность воздухообмена составляла 15 объемов/ч. Животные проходили карантин 14 суток.

Поддержание опухолевых линий

Противоопухолевую активность исследуемых веществ изучали in vivo на перевиваемых опухолях мышей — лимфоидная лейкемия L1210 и меланома B16 (солидная).

Клетки перевиваемых опухолей были получены из НМИЦ онкологии им. Н. Н. Блохина (Россия), где их хранили в жидком азоте в криоконсерванте в ампулах по 1 мл. Транспортировку осуществляли в жидком азоте в металлическом термосе с двойными стенками. Восстановление после криоконсервации проводили по одинаковой схеме для обеих опухолей. После извлечения из жидкого азота ампулы с клетками опухоли помещали в термостат при 37 °С на 30 мин, после этого вводили по 0,5 мл клеточной суспензии мышам требуемой линии. Лимфоидную лейкемию L1210 поддерживали на мышах линии DBA/2, меланому B16 — на мышах линии C₅₇Bl/6. Опухоли сохраняли в жизнеспособном состоянии, перевивая интактным мышам через 5–6 дней (L1210) или через 16–20 дней (меланома B16): асцит L1210 разводили в соотношении 1 : 60 физиологическим раствором, вводили внутрибрюшинно по 0,3 мл; 1 г опухоли меланома B16 гомогенизировали в 10 мл физиологического раствора, вводили подкожно по 0,5 мл.

Лечение исследуемых опухолей

Для лечения клетки опухоли прививали самкам мышей гибридов BDF1 (C₅₇Bl/6 × DBA/2), так же как при поддержании опухоли. Для прививки использовали опухолевые клетки, прошедшие после восстановления из жидкого азота не менее двух пассажей на мышах. Лечение лимфоидной лейкемии L1210 начинали через 24 ч после прививки опухоли, меланомы B16 — через 48 ч после прививки опухоли [6]. В отработку моделей входили определение эффективных доз и схем лечения мышей с опухолью противоопухолевым препаратом циклофосфамидом (Cyclophosphamide), в модели лейкемии L1210 выбор циклофосфамида в качестве положительного контроля был определен результатами ранее опубликованной работы [7], в модели меланомы В16 — практическими наработками. В случае мышей с лимфоидной лейкемией L1210 циклофосфамид вводили внутримышечно двукратно через сутки и трое суток после прививки опухоли в дозе 50 мг/кг. Данная схема лечения позволяла увеличить среднюю продолжительность жизни на 31–43% по сравнению с группой животных отрицательного контроля (ОК). Продолжительность жизни животных после прививки опухоли в рамках этой модели составляла 2–3 недели.

В случае мышей с меланомой В16 циклофосфамид вводили внутримышечно трехкратно через 2-е суток, 5 суток и 9 суток после прививки опухоли в дозе 80 мг/кг. При данной схеме лечения происходило торможение роста опухоли на 62–100% внутри месячного периода наблюдения и увеличение средней продолжительности жизни на 10–23% по сравнению с группой животных ОК. Продолжительность жизни животных после прививки опухоли в рамках этой модели составляла 4–5 недель.

Производные 4-аминопиперидина испытывали в водорастворимой форме гидрохлоридов. При лечении мышей с лимфоидной лейкемией L1210 вещества вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней, первая инъекция — на следующий день после прививки опухоли. При лечении мышей с меланомой В16 вещества вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 10 дней, первая инъекция — через 48 ч после прививки опухоли. Рецептуры для введения готовили в условиях ламинарного шкафа на стерильном физиологическом растворе (аптечная форма).

Статистическая обработка данных

Эффективность лечения оценивали относительно группы ОК (мыши с привитой опухолью, без лечения), по двум основным показателям: увеличение продолжительности жизни (УПЖ) и торможение роста опухоли (ТРО), а также связанным показателям Т/С [6]. Для определения основных показателей вычисляли средние арифметические по группам животных для таких исходных показателей, как объем опухоли на определенный момент времени после прививки опухоли и продолжительность жизни в пределах одного эксперимента для модели меланомы В16, а также продолжительность жизни в пределах одного эксперимента для модели лимфоидной лейкемии L1210. Для установления статистически достоверных различий между основными показателями в пределах одного эксперимента использовали подход с привлечением аппарата функций нескольких случайных величин [7]. Вычисляли среднеквадратические отклонения (СКО) по группам животных для таких исходных показателей, как объем опухоли на определенный момент времени после прививки опухоли и продолжительность жизни в пределах одного эксперимента для модели меланомы В16, а также продолжительность жизни в пределах одного эксперимента для модели лимфоидной лейкемии L1210. На основании выборочных средних, СКО исходных показателей, а также объемов выборок (число животных в группах) с использованием специального программного модуля, написанного в Mathematica 9 [7], производили расчеты математических ожиданий (МО) и границ 95%-х доверительных интервалов (ДИ) для основных показателей ТРО и УПЖ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка эффективности производных 4-аминопиперидина на модели лейкоза L1210

Для сравнительного тестирования противоопухолевой эффективности соединений N-(2-хлоробензил)-N-этил1-(2-(метилтио)пиримидин-4-ил)пиперидин-4-амина (№ 1); 4-((метил(1-(2-(метилтио)пиримидин-4-ил)пиперидин-4-ил) амино)метил) бензонитрила (№ 2) и N-(2,6-дихлорбензил)1-(1-(2-(этилтио)пиримидин-4-ил)пиперидин-4-ил)-Nметилметанамина (№ 3) (далее по тексту вещества обозначены цифрами) предварительными экспериментами были определены их максимальные переносимые дозы (МПД) при однократном внутрибрюшинном введении мышам BDF1 (C57Bl/6 × DBA/2). После однократного введения проводили клинические наблюдения за состоянием животных и ежедневное определение веса в течение 7 суток. На основании клинических наблюдений и динамики веса были установлены следующие МПД: 250 мг/кг — для № 1, 200 мг/кг — для № 2, 300 мг/кг — для № 3. После введения указанных доз у большинства животных наблюдали повышенное сердцебиение, учащенное дыхание, клонические и тонические судороги. В течение 10–15 мин после инъекции указанные признаки исчезли, первые 2–3 суток у половины животных наблюдали снижение веса в пределах 2–8%, к окончанию периода наблюдений все животные набирали вес.

С учетом полученных данных по МПД и на основании рекомендаций для первичных испытаний противоопухолевой активности на модели лейкоза L1210 [8] были выбраны следующие дозы для курсового введения: № 1 — 200 мг/кг, для № 2 — 150 мг/кг, для № 3 — 250 мг/кг. Вещества вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 7 дней, первую инъекцию — через 24 ч после прививки опухоли. В эксперименте участвовало 8 групп животных, по 6 животных в группе, в группе ОК — 8 особей. В группе ОК животные не получали никакого лечения. В группе положительного контроля (ПК) животных лечили циклофосфамидом (табл. 1). 

В табл. 2 представлены результаты серии из двух экспериментов представленного формата. В качестве оценки воспроизводимости в серии в таблице приведены размахи показателей УПЖ, Т/С и средние этих показателей.

По данным табл. 2 испытанные дозы субстанций № 1, 2 и 3 продемонстрировали относительно высокую активность по показателю УПЖ только в случае комбинированной терапии с циклофосфамидом.

Вещества № 2 и 3 в комбинации с цитостатиком попадают в низшую категорию перспективности «+» (Т/С ≥ 175%) для модельных лейкозов животных [6].

В комбинации с циклофосфамидом субстанции № 1, 2 и 3 продемонстрировали потенцирующий эффект.

Для сопоставления основных показателей эффективности лечения лимфоидной лейкемии L1210 в табл. 3 представлены математические ожидания показателей УПЖ и их 95%-е доверительные интервалы.

По данным табл. 3 с учетом границ доверительных интервалов были достигнуты статистически значимые (р = 0,05) различия величин показателей УПЖ для групп № 2 и 5; № 2 и 7 во II эксперименте.

Оценка эффективности производных 4-аминопиперидина на модели меланомы В-16

На основании результатов первичных испытаний противоопухолевой активности на модели лейкоза L1210 были проведены эксперименты с разовыми дозами: для вещества № 1 — 200 мг/кг, № 2 — 150 мг/кг, № 3 — 250 мг/кг на модели меланомы В16. Вещества вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 10 дней, первую инъекцию — через 48 ч после прививки опухоли. В эксперименте участвовало 8 групп животных, по 6 животных в группе, в группе ОК — 8 особей. В группе ОК животные не получали никакого лечения. В группе ПК животных лечили циклофосфамидом (табл. 4).

В табл. 5 показаны результаты серии из двух экспериментов представленного формата. В качестве оценки воспроизводимости в серии в таблице приведены размахи показателей ТРО, УПЖ и средние показателей ТРО.

По данным табл. 5 испытанные дозы субстанций № 1, 2 и 3 продемонстрировали относительно высокую активность по показателю ТРО только в случае комбинированной терапии с циклофосфамидом.

Вещества № 1, 2 и 3 в комбинации с цитостатиком попадают либо в низшую категорию перспективности «+» (ТРО < 51–80%), либо в категорию «++» (ТРО < 81–90%) для модельных солидных опухолей животных на 13-е, 21-е и 28-е сутки с момента прививки опухоли [6].

В комбинации с циклофосфамидом потенцирующий эффект по показателю ТРО продемонстрировали субстанции № 2 и 3 на 13-е сутки; субстанции № 1, 2 и 3 — на 21-е сутки; субстанция № 3 — на 33-е сутки; аддитивный эффект продемонстрировали субстанция № 1 на 33-е сутки; субстанция № 2 — на 28-е и 33-е сутки; субстанция № 3 — на 28-е сутки наблюдения.

Заметное увеличение средней продолжительности жизни было выявлено только в группах, получавших лечение циклофосфамидом и субстанцией № 2 в комбинации с циклофосфамидом.

Последнее обстоятельство наряду с сопоставимой с веществами № 1 и 3 эффективностью, продемонстрированной на модели меланомы В16 (см. табл. 4) и на модели лейкоза L1210 (см. табл. 2), позволило выделить вещество № 2 как наиболее перспективное среди остальных для дальнейшей отработки дозировок и схем лечения с применением этой субстанции.

Для сопоставления основных показателей эффективности лечения меланомы В16 представлены математические ожидания показателей ТРО и УПЖ и их 95%-е доверительные интервалы (табл. 6).

По данным табл. 6 с учетом границ доверительных интервалов были достигнуты статистически значимые (р = 0,05) различия величин показателей ТРО для групп № 2 и 5; № 2 и 7 на 13-е сутки и для групп № 2 и 5 на 21-е сутки во II эксперименте. В остальных случаях комбинированного лечения увеличение показателей ТРО отмечено преимущественно на уровне тенденций.

В совокупности на основании данных по статистически значимым увеличениям показателей ТРО и УПЖ в случаях комбинированного лечения по сравнению с монотерапией циклофосфамидом (см. табл. 3 и табл. 6) вещество № 2 было выделено как наиболее перспективное среди остальных для дальнейших исследований.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ингибиторы Hsp70 принято классифицировать по механизму действия и по структурному принципу. Как правило, механизмы действия основаны на присоединении ингибиторов к нуклеотидсвязывающему домену и препятствовании функциональному взаимодействию с нуклеотидсвязывающим и субстратсвязывающим доменами Hsp70 [9–11], а также на ингибировании АТФ-азной активности Hsp70 в целом без уточнения механизмов [12–15], избирательной супрессии GRP78 [16–18], взаимодействии с EEVD-доменом Hsp70 [19], нарушении Hsp70/BAG3 взаимодействия [20–22] и др. В то же время ингибиторы разделяют на следующие основные группы согласно их химической структуре: аналоги АТФ (Ver-155008) [9, 23], дигидропиримидины (MAL3-101, DMT3132, NSC 630668-R/1) [14, 15, 24], флавоноиды (эпигаллокатехин-3-галлат, кверцетин) [25, 26], имидазолы (Апоптозол, Az-TPP-O3) [27, 28], фенилметилсульфонамиды (Пифитрин-μ) [29, 30], родоцианины и их производные (YM-1, MKT-077, JG-98) [21, 31, 32], метиленовый синий [33] и еще несколько отдельных соединений. 

Вещества, описанные в нашей работе, относятся к категории ингибиторов АТФ-азной активности Hsp70, но по своей химической природе образуют новое структурное направление низкомолекулярных неспецифичных ингибиторов семейства Hsp70. Данное исследование является логическим продолжением опубликованной ранее многоплановой работы [4], в которой был впервые проведен подбор in silico химических структур, обладающих сродством к сайту связывая АТФ белка Hsp70, предложены условия синтеза производных 4-аминопиперидина — потенциальных ингибиторов Hsp70, дана оценка константы комплексообразования веществ коллекции с белком Hsp70 методом поверхностного плазмонного резонанса и продемонстрировано ингибирование АТФазной активности Hsp70 с помощью адаптированного колориметрического теста. Там же были проведены срининговые испытания оригинальной коллекции веществ на 16 линиях опухолевых клеток и двух линиях клеток фибробластов человека; для наиболее активных веществ величины LC₅₀ находились в интервале 0,7–2,0 мкМ, а для одного из веществ ЛД₅₀ достигала 870 мг/кг на модели мышей в остром эксперименте при пероральном введении.

В данной работе была поставлена цель пойти дальше и оценить потенциал производных 4-аминопиперидина как ингибиторов Hsp70 на моделях животных-опухоленосителей. Что и было сделано на мышах с перевиваемыми опухолями лимфоидная лейкемия L1210 и меланома B16 (солидная).

ВЫВОДЫ

В ходе предварительных испытаний, как ожидалось, высокие дозировки субстанций продемонстрировали обещающие эффекты лечения в комбинации с цитостатиком циклофосфамидом.

В ряде экспериментов для веществ № 2 и № 3 были достигнуты статистически значимые различия (р = 0,05) величин основных показателей эффективности лечения для групп животных, получавших комбинированную терапию и монотерапию циклофосфамидом, а именно: по показателю УПЖ на модели лейкемии L1210 и по показателю ТРО на модели меланомы B16 на 13-е и 21-е сутки с момента прививки опухоли.

На основании совокупности данных по величинам противоопухолевого эффекта на моделях лейкемии L1210 и меланомы B16 из трех веществ было выбрано одно — наиболее активное производное 4-аминопиперидина: 4-((метил(1-(2-(метилтио) пиримидин-4-ил)пиперидин-4ил)амино)метил) бензонитрил в форме гидрохлорида для дальнейшей отработки способов и схем введения.

Величины полученных эффектов подтверждают перспективность применения представленных низкомолекулярных ингибиторов белков теплового шока, в частности Hsp70, в составе комбинированной химиотерапии в онкологии.