Дезинфицирующие средства повсеместно используют в медицинской практике, в быту и многих других областях человеческой деятельности. Особенно важна роль мероприятий по дезинфекции в условиях эпидемий или при угрозе распространения опасных инфекций, в связи с чем обеспечение медицинских организаций и населения эффективными антисептическими средствами относится к задачам государственной важности. Общими требованиями, предъявляемыми к таким средствам, являются эффективность подавления всех типов патогенной микрофлоры, включая возбудителей микробных, грибковых и вирусных инфекций, а также безопасность для человека и окружающей среды. Существующие препараты лишь частично удовлетворяют этим требованиям, поэтому разработка новых антисептических средств остается актуальной.

К числу наиболее известных антисептиков относится хлоргексидин (1,6-ди-[бис-(4-хлорфенил)бигуанидо]гексана биглюконат), который уже более 60 лет применяют в медицинской, ветеринарной и бытовой практике; до настоящего времени он остается одним из самых востребованных антисептических агентов [1]. Препарат приобрел популярность благодаря своей высокой бактерицидной активности в отношении широкого спектра грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, включая грибы, а также за счет способности сохранять высокую активность при соприкосновении с различными биологическими субстратами (кровь, слюна, гной и т. д.) [2].

Молекула хлоргексидина состоит из двух симметричных хлорфенилзамещенных бигуанидовых групп, соединенных гидрофобной гексаметиленовой цепочкой, при физиологическом значении рН существует в виде бикатиона [3]. Механизм антимикробного действия хлоргексидина, как и у большинства катионных антисептиков, реализуется на уровне клеточной мембраны [4].

Хлоргексидин служит активным началом различных дезинфицирующих средств местного назначения, его используют для обработки ран, ожогов, для стерилизации операционного поля, кожных покровов, он входит в состав растворов и ополаскивателей для лечения простудных заболеваний [5]. Хлоргексидин незаменим в стоматологической практике, где он приобрел статус «золотого стандарта», на который в свое время было принято ориентироваться при разработке новых антисептиков [6].

Вместе с тем, хлоргексидин обладает рядом существенных недостатков. В частности, при комнатной температуре он практически не действует на бактериальные споры и поэтому малоэффективен против спорообразующих патогенов [5]. Малочувствительны к хлоргексидину и кислотоустойчивые микроорганизмы [7], к числу которых относят возбудителей туберкулеза и проказы. Серьезным недостатком хлоргексидина является отсутствие у него выраженной вирулицидной активности. Хотя у хлоргексидина отмечается некоторое действие на ВИЧ, герпес 1 и 2, грипп А [2, 5], по отношению к большинству вирусов он обладает слабым эффектом или совсем не проявляет такового, как, например, к коронавирусу SARS-CoV-2, согласно результатам недавних клинических исследований [8].

Наконец, общей проблемой повсеместно используемых препаратов является появление резистентных микробных штаммов. Долгое время считалось, что лекарственная устойчивость микроорганизмов к хлоргексидину не вырабатывается [2], но современные данные опровергают это мнение. Установлено, что, например, K. pneumoniae способна адаптироваться к хлоргексидину, что приводит к появлению патогенных штаммов, практически нечувствительных к рекомендуемым концентрациям антисептика [9].

Как показывают наши исследования, антисептическая активность хлоргексидина может быть увеличена за счет его использования в комбинации с другими химическими средствами. В связи с этим представляется интересным изучить целевую активность хлоргексидина в присутствии комплексообразующих вспомогательных веществ: трилона Б (натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты, ЭДТА) и хлорида цинка. Соли и комплексы цинка обладают умеренным антимикробным, противогрибковым и противовирусным действием [10], а ЭДТА, хотя не обладает самостоятельной антисептической активностью, но за счет образования устойчивых комплексов с большинством катионов металлов [11] увеличивает проницаемость клеточных мембран для других веществ, в том числе цинка, а возможно, и хлоргексидина. Целью работы было изучить молекулярную структуру нового хлоргексидинового комплекса, а также провести подробное исследование его биоцидных свойств.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Комплексное соединение хлоргексидина в виде водного раствора, содержащего 0,2% хлоргексидина биглюконата, 1% натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,5% хлорида цинка, предоставлено ООО «Росбио» (СПб).

Масс-спектрометрическое исследование

Анализ осуществляли методом матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации — масс-спектрометрии (МАЛДИ-МС). Исходный раствор комплекса разбавляли водой в 100 раз. На ячейку МАЛДИ-мишени наносили 0,5 мкл полученного раствора, добавляли 0,5 мкл раствора матрицы (5 мг/мл) и высушивали. В качестве матрицы использовали 2,5-дигидроксибензойную кислоту, которую растворяли в 70%-м ацетонитриле с добавкой 0,1%-й трифторуксусной кислоты (ТФУ). После высушивания при комнатной температуре образцы анализировали с помощью тандемного времяпролетного массспектрометра ultrafleXtreme (Bruker Daltonics; Германия) на базе Научного парка СПбГУ.

Масс-спектры регистрировали в диапазоне m/z 600–1500 в режиме «рефлектрон» с детектированием положительных ионов. Для одного спектра суммировалось 15 000 актов облучения образца лазером (Nd:YAG 355 нм). Для калибровки масс-спектрометра использовали калибровочную смесь Peptide Calibration Standard II (Bruker Daltonics; Германия).

Элементный состав комплекса хлоргексидин-ЭДТА-Zn устанавливали стандартным методом (CHN-анализ), а количественное содержание цинка определяли методом атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой, используя спектрометр Optima 2100DV (Perkin Elmer; США). Для выделения индивидуального комплекса исходный раствор концентрировали упариванием в вакууме до 1/10 от первичного объема, выделившийся кристаллический продукт отделяли, промывали водой и сушили на воздухе при 40 °С до постоянного веса. Полученный комплекс представлял собой бесцветный мелкокристаллический порошок ограниченно растворимый в воде. В исходном растворе содержалось 0,34% данного комплекса, что в пересчете на чистый хлоргексидин составляло 0,2%. Данные элементного анализа: найдено С — 44,50%, Н — 5,21%, N — 19,44%, Zn — 7,57%. C₃₂H₄₄Cl₂N₁₂O₈Zn — MW 858,21; вычислено С — 44,64%, Н — 5,15%, N — 19,52%, Zn — 7,60%. Данные масс-спектра МАЛДИ-МС: m/z 859,27.

Микробиологические исследования in vitro и in vivo

Эксперименты in vitro и клинические испытания антисептических свойств комплекса хлоргексидин-ЭДТА-Zn на животных проводили на базе УО «Витебская ордена «Знак почета» Государственная Академия ветеринарной медицины» (Беларусь) и ОАО «Агрокомбинат «Юбилейный» (Беларусь). Тестирование препарата проводили на чашках Петри методом кратных разбавлений. Каждый микроорганизм тестировали в двух сериях экспериментов, используя культуру, выращенную на двух разных питательных средах [12].

Исследования in vivo включали лечение дерматитов у домашних и сельскохозяйственных животных (собак, кошкек, кроликов и овец), антисептик применяли один раз в сутки методом аппликаций в течение 5–14 дней.

Изучение противотуберкулезной активности

Проведено на базе ФГБУ «СПб НИИФ» Минздрава России. Активность in vitro оценивали в отношении чувствительного референтного штамма микобактерий туберкулеза (МБТ) Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Институт гигиены и эпидемиологии, Прага, 1976) и клинического изолята M. tuberculosis 5582 с множественной лекарственной устойчивостью (коллекция штаммов МБТ СПб НИИФ). Минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) определяли с помощью метода REMA [13] на культурах М. tuberculosis H37Rv и клинического изолята 5582 с устойчивостью к изониазиду, рифампицину, стрептомицину и пиразинамиду. За значение МИК принимали минимальную концентрацию препарата, при которой средний уровень флуоресценции значимо не превышал 1% от уровня в контрольной культуре МБТ, растущей без ингибитора. Рост бактерий регистрировали как визуально по изменению цвета индикатора резазурина (с голубого на розовый), так и с помощью планшетного флуориметра FLUOstarOptima (Германия) при длине волны возбуждения — 520 нм, излучения — 590 нм).

Противотуберкулезную активность in vivo исследовали на мышах-самцах линии C57black/6 массой 16–18 г (питомник «Андреевка», Научный центр биомедицинских технологий ФМБА; Россия) [14,  15], используя две модели туберкулеза: при заражении стандартным тест-штаммом М. tuberculosis H37Rv, и лекарственно устойчивым штаммом МБТ 5582. Введение лечебных препаратов модельным животным начинали в обеих сериях опытов на четвертый день после заражения. Все препараты вводили внутрижелудочно ежедневно, кроме субботы и воскресения, до окончания эксперимента. Комплекс

ХГ-ЭДТА-Zn вводили в двух дозах: 7 мг/кг и 14 мг/кг. В качестве сравнения служил противотуберкулезный препарат моксифлоксацин в средней терапевтической дозе 7 мг/кг. Общее время эксперимента составляло 40 дней.

Изучение вирулицидной активности

Изучение вирулицидной активности проводили на базе «Института вирусологии им. Д. И. Ивановского» в соответствии с Методическими указаниями [16]. Использовали вакцинный штамм вируса полиомиелита (тип 1, титр вируса — 6,5 lgТЦИД₅₀; НИИ полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова, Россия), аденовирус человека (тип 5, титр вируса — 5,5 lg ТЦИД₅₀; Государственная коллекция вирусов Института вирусологии им. Д. И. Ивановского, Россия). Для работы с вирусом полиомиелита использовали перевиваемую культуру клеток почки зеленых мартышек Vero, для работы с аденовирусом — перевиваемую линию клеток НЕр2. Статистическая обработка данных

Для статистической обработки использовали пакет прикладных программ Statistica 7.0 (StatSoft; США). Метрические показатели представляли в виде среднего и ошибки среднего (М ± m). Оценку достоверности различия метрических показателей проводили с использованием критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка биоцидной активности

Изучение активности 0,05%-го ХГ-ЭДТА-цинкового комплекса in vitro в сравнении с биглюконатом хлоргексидина в той же концентрации проведено на серии культур стандартных микроорганизмов. Результаты оценки площади зоны отсутствия роста культур на чашках Петри представлены в табл. 1.

Результаты in vitro оценки антимикробной активности в отношении основных возбудителей бактериальных болезней птиц представлены в табл. 2.

В концентрации 1,0–0,008 мг/мл (в зависимости от вида возбудителя) комплекс ХГ-ЭДТА-Zn обладает как бактериостатическим, так и бактерицидным действием в отношении всех исследованных болезнетворных культур.

Результаты исследований in vivo, полученные в клинических условиях при лечении дерматитов у домашних и сельскохозяйственных животных, представлены в табл. 3.

Применение антисептика методом аппликаций в течение 5–14 дней приводило к полному выздоровлению животных. Аллергических реакций или других негативных побочных эффектов при лечении не было отмечено.

Результаты тестирования противотуберкулезной активности in vitro в отношении штамма M. tuberculosis 5582 представлены на рис. 1.

По результатам тестирования in vitro на модели M. tuberculosis H37Rv, комплекс ХГ-ЭДТА-Zn обладает выраженной противотуберкулезной активностью: значение МИК составляет 6,2 мкг/мл.

Результаты изучения противотуберкулезной активности in vivo. Результаты исследования терапевтической эффективности комплекса ХГ-ЭДТА-Zn в сравнении с моксифлоксацином представлены в табл. 4, а данные по высеваемости МБТ из легких — в табл. 5.

К окончанию эксперимента на 40-й день от инфицирования в группе контроля (без лечения) летальность составила 70% в случае М. tuberculosis H37Rv; и 40% — в случае штамма 5582. При этом на обеих моделях в группе контроля обнаружено резкое увеличение коэффициентов массы легких и селезенки, а также тотальное поражение легочной ткани с участками некроза, в посевах гомогенатов легких регистрировался сплошной рост МБТ.

Лечебный эффект комплекса ХГ-ЭДТА-Zn подтвержден на обеих моделях туберкулеза, при заражении мышей стандартным тест-штаммом М. tuberculosis H37Rv и лекарственно устойчивым штаммом МБТ 5582, в сравнении с известным противотуберкулезным препаратом моксифлоксацин в средней терапевтической дозе (7 мг/кг). На обеих моделях туберкулеза комплекс оказывал протективное действие, предотвращая гибель инфицированных мышей (см. табл. 4). На модели лекарственно чувствительного штамма M. tuberculosis H37Rv препарат достоверно снижал величину всех тестируемых параметров по сравнению с группой контроля. В дозе 14 мг/кг действие препарата было достоверно более выраженным, чем в дозе 7,0 мг/кг, т. е. наблюдаемый эффект был дозозависимым. По снижению показателей пораженности легких комплекс ХГ-ЭДТАZn в дозе 14 мг/кг на обеих моделях туберкулеза был практически так же активен, как моксифлоксацин в дозе 7 мг/кг, а по показателям селезенки он незначительно уступал моксифлоксацину.

Результаты изучения вирулицидной активности. Результаты оценки степени ингибирования репродукции вирусов, выраженные в единицах ТЦИД₅₀ (50%-я тканевая цитопатическая инфекционная доза) представлены в табл. 6.

Как в суспензионном тесте (смешение), так и при обработке поверхностей, контаминированных вирусом полиомиелита и аденовирусом человека, раствор комплекса с содержанием хлоргексидина 0,2% в течение 1–5 мин инактивировал данные вирусы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Известно, что ЭДТА дает прочный комплекс с катионом цинка (константа нестойкости [Zn Edta]²⁺ K_n равна 3,2×10^–17) [11]. Описано также получение комплексного соединения хлоргексидина с ЭДТА [17]. Однако более сложные, трехкомпонентные комплексы, включающие ЭДТА, цинк и хлоргексидин, не изучены. Как мы предположили, в водной среде биглюконат хлоргексидина, динатриевая соль ЭДТА и хлорид цинка могут образовывать комплексное соединение со структурой, представленной на рис. 2. Действительно, в МАЛДИ-масс-спектре был обнаружен сигнал с m/z 859,27, соответствующий протонированной форме МН+ предсказанной структуры. Фрагментный масс-спектр данного иона содержал сигналы с m/z 567,2 (ион протонированного аддукта хлоргексидина и цинка), m/z 505,3 (ион протонированного хлоргексидина) и m/z 353,3 (ион протонированного комплекса ЭДТА-Zn), что однозначно доказывало его структуру. В структуре данного комплекса, очевидно, содержится центральный четырехкоординированный двухзарядный катион цинка, двухзарядный катион хлоргексидиния и четырехзарядный анион полностью депротонированной молекулы ЭДТА. Следует отметить достаточно высокую стабильность тройного комплекса, о чем свидетельствует тот факт, что он сохраняется в жестких условиях испарения под действием лазера.

Стабильность тройного комплекса ХГ-ЭДТА-Zn можно объяснить внутримолекулярным солеобразованием, в результате чего катионные и анионные фрагменты в данной системе стехиометрически уравновешивают друг друга, образуя в сумме электронейтральную молекулу.

Включение хлоргексидина в состав прочного тройного комплекса с участием ЭДТА и цинка сопровождается повышением биоцидной активности (см. табл. 1). В отношении исследованных бактериальных и грибных штаммов комплекс ХГ-ЭДТА-Zn в 4–5 раз более активен, чем биглюконат хлоргексидина.

Комплекс хлоргексидина демонстрирует также высокую эффективность in vitro в отношении основных возбудителей бактериальных болезней птиц (см. табл. 2), а также in vivo в клинических условиях при лечении дерматитов у домашних и сельскохозяйственных животных — собак, кошек, кроликов и овец (см. табл. 3). Можно заключить, что комплекс ХГ-ЭДТА-Zn может быть эффективным средством для лечения бактериальных и грибковых заболеваний кожи различной этиологии, для заживления царапин, трещин, ожогов, инфицированных ран, пиодермии.

Как показывают наши исследования, комплекс ХГ-ЭДТА-Zn проявляет заметную противотуберкулезную активность, что весьма неожиданно, поскольку хлоргексидин сам по себе обладает очень слабым воздействием на микобактерии туберкулеза (МБТ). В экспериментах in vitro активность (МИК) комплекса по сравнению со стандартным штаммом M. tuberculosis H37Rv (см. рис. 1) составляет 6,2 мкг/мл, а по сравнению с лекарственно устойчивым штаммом МБТ 5582 активность в 2 раза выше (МИК 3,1 мкг/мл), т. е. активность по сравнению с лекарственно устойчивым штаммом в 2 раза выше, чем в случае с стандартным туберкулезным штаммом.

Еще более неожиданно наличие у комплекса ХГ-ЭДТАZn противотуберкулезного действия in vivo — в условиях перорального введения на мышах, хотя известно, что хлоргексидин в свободном виде практически не всасывается из ЖКТ. Достоверность лечебного эффекта препарата подтверждается на двух моделях туберкулеза — на основании данных по выживаемости животных, по результатам оценки физиологических показателей (см. табл. 4) и данных по высеваемости МБТ из легких (см. табл. 5). На модели лекарственно чувствительного штамма M. tuberculosis H37Rv комплекс ХГ-ЭДТА-Zn уступает моксифлоксацину, а на модели лекарственно устойчивого штамма его эффект практически равен моксифлоксацину.   

Полученные результаты позволяют рассматривать комплекс ХГ-ЭДТА-Zn не только как средство дезинфекции, но и как потенциальный противотуберкулезный препарат, который может быть использован в качестве вспомогательного средства при лечении лекарственно устойчивых форм туберкулеза.

Помимо бактерий, биоцидный эффект комплекса ХГ-ЭДТА-Zn распространяется и на вирусы (см. табл. 6). Полученные результаты свидетельствуют, что комплекс ХГ-ЭДТА-Zn может быть использован для дезинфекции объектов, контаминированных данными вирусами.

ВЫВОДЫ

Трехкомпонентный комплекс хлоргексидин-ЭДТА-Zn обладает выраженным биоцидным эффектом в отношении болезнетворных бактерий, грибов, микобактерий туберкулеза и вирусов, причем по уровню биоцидной активности и широте спектра действия он значительно превосходит хлоргексидин. В целом, комплекс хлоргексидин-ЭДТА-Zn представляется перспективным дезинфицирующим средством, которое может быть использовано для борьбы с распространением опасных бактериальных и вирусных инфекций. На моделях экспериментального туберкулеза при системном введении комплекс хлоргексидин-ЭДТА-Zn проявляет лечебный эффект, сопоставимый с моксифлоксацином. Это позволяет рекомендовать данный комплекс для дальнейшего изучения в качестве возможного средства лечения лекарственно устойчивых форм туберкулеза.