Возникновение новых вариантов коронавируса SARS-CoV-2, обладающих повышенной трансмиссивностью и снижающих эффективность его нейтрализации выработанными ранее антителами, представляет угрозу для здоровья населения во всем мире. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) с флуоресцентными зондами, позволяющими детектировать единичные нуклеотидные замены, подходит для скрининга содержащих РНК SARS-CoV-2 образцов на наличие уже известных мутаций в S-гене, которые имеют функциональное значение, и выявление которых позволяет определять и дифференцировать геноварианты, имеющие наибольшее эпидемиологическое значение. Целью настоящей работы было разработать набор реагентов и методику для оперативного мониторинга распространения приоритетно значимых вариантов SARS-CoV-2. На основе выравнивания полногеномных последовательностей SARS-CoV-2, опубликованных в базе данных GISAID, были выбраны праймеры и LNA-модифицированные зонды для выявления мутаций в S-гене, характерных для генетических линий альфа, бета/гамма и дельта особой эпидемиологической значимости (VOC). Разработан и зарегистрирован набор реагентов в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления наиболее значимых мутаций в S-гене SARS-CoV-2, продемонстрированы его высокие аналитические и диагностические характеристики. Показано соответствие результатов выявления линий VOC и их основных мутаций разработанным набором с данными полногеномного секвенирования для 1500 образцов РНК SARS-CoV-2. Применение набора реагентов в сочетании с последующим секвенированием РНК SARS-CoV-2 в рамках проведения эпидемиологического мониторинга позволило оперативно установить факт появления на территории России геноварианта дельта и в дальнейшем отследить динамику изменения его распространенности в Московском регионе в период с апреля по сентябрь 2021 г.