В конце 2019 г. в Китае был выявлен новый коронавирус, вызывающий опасное респираторное заболевание человека — COVID-19. После секвенирования генома вирус был отнесен к бетакоронавирусам и назван SARS-CoV-2 [1–3]. Высокая способность коронавирусов к приобретению новых мутаций хорошо известна [4]. Большинство возникающих мутаций не влияют на свойства вируса, однако некоторые из них могут приводить к функциональным изменениям, в том числе к увеличению скорости распространения вируса и/или тяжести течения заболевания.

С момента начала распространения нового коронавируса в базе данных GISAID опубликовано большое количество последовательностей геномов [5], что позволило следить как за распространением вируса, так и за возникновением новых мутаций в его геноме.

В декабре 2020 г. власти Великобритании заявили о возросшем числе случаев заражения COVID-19. Резкий рост заболеваемости был вызван новым генетическим вариантом коронавируса SARS-CoV-2, имевшим отличия от референсного генома. Он содержал мутации в гене S-белка [6, 7]. На основании филогенетического анализа вновь появившаяся британская линия SARS-CoV-2 была названа B.1.1.7, ее отнесли к вариантам особой эпидемиологической значимости (VOC). Вариант B.1.1.7 имеет ряд характерных мутаций в спайковом белке, в том числе N501Y, A570D, D614G и P681H, а также делеции аминокислот 69-70 и 144Y [8, 9]. Одновременно была выявлена еще одна эпидемиологически важная линия, вызвавшая вспышку в различных провинциях Южноафриканской республики, которая известна как B.1.351. Южноафриканский штамм содержит девять спайковых мутаций в дополнение к D614G, в том числе кластер мутаций (например, 242–244del и R246I) в N-концевом домене (NTD) шипа, три мутации (K417N, E484K и N501Y) в рецептор-связывающем домене (RBD) и одну мутацию (A701V) рядом с сайтом расщепления фурина [10, 11]. В январе 2021 г. специалисты Национального института инфекционных болезней в Японии обнаружили новый вариант SARS-CoV-2, изоляты которого были выявлены у прибывших из Бразилии туристов — линию P.1. Некоторые мутации бразильского штамма были найдены ранее в британском и южноафриканском вариантах. Данный изолят имеет 12 мутаций в спайковом белке, в том числе N501Y и E484K [12]. Позднее описанные выше генетические линии коронавируса назвали буквами греческого алфавита в соответствии с предложенной ВОЗ номенклатурой — альфа (B.1.1.7 и ее субварианты Q.1–Q.8), бета (B.1.351), гамма (P.1). Все три указанных генетических варианта SARS-CoV-2 включены Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) и Европейским центром контроля и профилактики заболеваний (ECDC) в категорию особой эпидемиологической значимости (VOC) и циркулируют по всему миру [6].

Весной 2021 г. в Индии выявили новую линию SARS-COV-2 — B.1.617.2, которая стремительно распространялась и вызвала новую волну пандемии с резким ростом заболеваемости и числа летальных исходов сначала в Индии, а затем и в других странах в различных регионах мира. Линия B.1.617.2, как и ряд выявленных позднее близких генетических линий AY.1, AY.2-124, содержит следующие характерные мутации в белке S: T19R, E156G, del157/158, L452R, T478K, D614G, P681R и D950N, включая мутации внутри рецептор-связывающего домена [13]. Линия B.1.617.2, как и линии AY.1–124, отнесены к категории наибольшего эпидемиологического значения, в соответствии с классификацией ВОЗ им дано наименование дельта.

По данным ряда публикаций, мутация N501Y в гене S, которая присутствует в геномах трех из четырех описанных выше линий VOC, влияет на аффинность связывания S-белка с ACE2-рецептором, что может приводить к повышению трансмиссивности [14–16]. Наличие мутации E484K может быть причиной ускользания вируса от моноклональных антител, возникших после ранее перенесенного заболевания, вызванного SARS-CoV-2 вариантами без этой мутации, или после вакцинации [17–19].

Опубликованы данные об увеличении средней продолжительности инфекции, вызванной штаммами, относящимися к линии альфа, по сравнению с аналогичным показателем для не относящихся к этой линии штаммов (13,3 дня против 8,2 дня соответственно) [20]. На сегодняшний момент нет данных, подтверждающих способность генетического варианта SARS-CoV-2 альфа ускользать от моноклональных антител, выработанных после вакцинации [8, 21–23]. При этом, согласно литературным данным, южноафриканский и бразильский варианты могут снижать эффективность некоторых вакцин против COVID-19 [7, 24]. Структурный анализ мутации RBD L452R вместе с расположенной в сайте расщепления фурина мутацией P681R показал, что эти мутации могут способствовать увеличению эффективности связывания с рецептором ACE2 и скорости расщепления S1-S2, обеспечивая увеличение трансмиссивности вируса. Наличие этой мутации в RBD-домене указывает на снижение связывания с выработанными моноклональными антителами и может влиять на их потенциал нейтрализации [13, 25].

Исходя из всего вышесказанного, выявление различных линий коронавируса и отслеживание распространения изолятов SARS-CoV-2, относящихся к линиям особой эпидемиологической значимости, является важной задачей.

В настоящее время секвенирование генома вируса представляет собой самый доступный метод, позволяющий обнаруживать новые быстро возникающие варианты SARS-CoV-2. Однако исследования методом геномного секвенирования являются дорогостоящими и занимают длительное время. Кроме того, в отличие от ПЦР метод имеет дополнительное ограничение по минимальной необходимой концентрации РНК вируса в образце. Метод полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) подходит для скрининга содержащих РНК SARSCoV-2 образцов на наличие уже известных имеющих функциональное значение мутаций в S-гене коронавируса. Выявление таких мутаций позволяет определять и дифференцировать включенные в категорию VOC варианты вируса, которые имеют наибольшее эпидемиологическое значение. Использование олигонуклеотидных зондов с модифицированными LNA-нуклеотидами позволяет успешно выявлять даже однонуклеотидные замены в анализируемой последовательности гена [26]. Применение ОТ-ПЦР рекомендовано для увеличения объемов и производительности при скрининге приоритетно значимых генетических вариантов вируса руководством по выявлению и идентификации генетических вариантов SARS-CoV-2, подготовленном экспертами ВОЗ и ECDC [27]. Существуют зарубежные наборы реагентов для выявления важных мутаций в гене S-белка методом ОТПЦР в реальном времени. Например, набор реагентов корейского производителя PowerChek выявляет мутации, характерные для линий дельта, альфа, бета и гамма, а набор французского производителя ID детектирует мутации L452R, E484K и E484Q. В России зарегистрированы наборы реагентов для выявления мутаций, характерных только для линии альфа (выпущены ЦНИИЭ Роспотребнадзора и компанией «ДНК-Технология»), другие линии не охвачены.

Таким образом, разработка отечественного набора реагентов для оперативного мониторинга распространения приоритетно значимых вариантов SARS-CoV-2 чрезвычайно актуальна. В связи с этим разработаны методика и набор реагентов на основе ОТ-ПЦР для детекции спектра мутаций в S-гене коронавируса, характерных для четырех генетических вариантов особого эпидемиологического значения, и выявления РНК SARS-CoV-2 вариантов дельта, альфа и бета/гамма (без дифференцировки двух последних) путем выявления соответствующего сочетания основных мутаций. Целью настоящей работы было разработать набор, позволяющий выявлять мутации N501Y, P681H и делецию 69-70del, сочетание которых характерно для генетической линии альфа, мутацию E484K, которая в сочетании с мутацией N501Y характерна для генетических линий бета и гамма SARS-CoV-2, мутации P681R и L452R, сочетание которых характерно для генетической линии дельта, а также определять наличие каждой из указанных мутаций в отдельности. Разработанный набор может служить инструментом мониторинга, обеспечивая оперативное получение данных по динамике распространения штаммов (или генетических вариантов) коронавируса SARSCoV-2 приоритетного эпидемиологического значения, обладающих функционально значимыми мутациями.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн олигонуклеотидов для амплификации целевых участков S гена

Для выбора диагностических праймеров и зондов, детектирующих мутации, характерные для генетических линий коронавируса SARS-CoV-2 особой эпидемиологической значимости, использовали выравнивание полногеномных последовательностей коронавируса SARS-CoV-2, опубликованных в базе данных GISAID (дата обращения: 05.10.2021). На основе выравнивания определены участки с соответствующими мутациями в области S-гена вируса, подобраны праймеры и LNA-модифицированные зонды для выявления следующих мутаций в геноме коронавируса SARS-CoV-2: N501Y, делеции 69-70del, P681H и P681R, L452R, E484K, E484Q. Олигонуклеотиды подбирали в соответствии со стандартными требованиями к выбору праймеров и TaqMan-зондов [28, 29], используя онлайн-ресурсы Oligo Calc [30] и OligoAnalyzer Tool [31]. Термодинамические характеристики флуоресцентных зондов и их вторичную структуру оценивали с помощью онлайн-сервиса Mfold Web Server [32]. Синтез олигонуклеотидов выполнен специалистами компании АО «Гентерра» (Россия).

Клинические образцы

Мазки из ротоглотки и носоглотки (n = 10 297) получены ФГБУЗ «Головной центр гигиены и эпидемиологии Федерального медико-биологического агентства» (г. Москва) в период с декабря 2020 г. по сентябрь 2021 г. от пациентов с симптомами ОРВИ. Образцы мазков собирали в пробирки с транспортной средой («ЦНИИЭ Роспотребнадзора»; Россия) и хранили при температуре –70 °С до испытания.

Экстракция РНК

Экстракцию РНК проводили с помощью набора «АмплиТест РИБО-преп» («ЦСП ФМБА»; Россия) в соответствии с инструкцией производителя. РНК элюировали в 50 мкл РНК-буфера. Образцы РНК хранили при температуре не выше -70 °С до использования.

ОТ-ПЦР

ОТ-ПЦР проводили в мультиплексном формате в соответствии с инструкцией. Помимо образцов РНК каждая постановка включала в себя положительные контрольные образцы (ПКО) А, В, С, ПКО W на дикий тип, а также отрицательный контроль постановки.

Анализ каждого образца на наличие мутаций, характерных для генетических линий особого эпидемиологического значения (VOC) альфа, дельта и бета/ гамма, проводили в трех пробирках — на смесях 2-А, 2-В и 2-С. Анализировали кривые накопления флуоресцентного сигнала по трем различным каналам (таблица). Объем исследуемой РНК — 10 мкл.

Программа амплификации включала следующие стадии термоциклирования: 50 °C — 15 мин, 95 °C — 15 мин. Перечисленные ниже стадии повторяли 45 циклов: 95 °C — 15 с, 60 °C — 30 с, 72 °C — 15 с.

Оптимизация набора реагентов «АмплиТест SARSCoV-2 VOC v.2» выполнена на амплификаторах Rotor-Gene Q (Qiagen; Германия), CFX96 (Bio-Rad Laboratories; США) и ДТпрайм («ДНК-Технология»; Россия).

Разработка ПКО

В качестве ПКО использовали смесь рекомбинантных плазмид, содержащих амплифицированные целевые фрагменты S-гена, которые являются мишенями для выбранных праймеров и зондов.

 ПЦР-продукты очищали с помощью набора MiniElute Gel Extraction Kit (Qiagen; Германия), лигировали в плазмидный вектор pGEM-T (Promega; США) и трансформировали в Escherichia coli. Рекомбинантные плазмиды из индивидуальных клонов очищали с помощью набора Plasmid Miniprep Kit (Axygen; США). Нуклеотидные последовательности ПКО подтверждали с помощью секвенирования по Сенгеру методом «cycle sequence» с использованием набора ABI PRISM Big Dye v.3.1 (Thermo Fisher Scientific; США) согласно инструкции изготовителя, используя капиллярный автоматический генетический анализатор Applied Biosystems Sanger Sequencing 3500 (Thermo Fisher Scientific; США). Для секвенирования использовали прямой и обратный праймеры, фланкирующие ПЦР-фрагмент.

Реакцию секвенирования проводили в объеме 5 мкл реакционной смеси в тонкостенных микропробирках объемом 0,2 мл. Реакционная смесь содержала 0,8 мкл специфичного праймера (прямого или обратного) в концентрации 1 мкМ и 1 мкл готовой смеси Ready Reaction BigDye Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific; США). Компоненты смеси аккуратно смешивали и проводили термоциклирование на амплификаторе

SimpliAmp VeriFlex 96 (Thermo Fisher Scientific; США) по следующей программе: начальная денатурация — 2 мин при 95 °С, затем 45 циклов (денатурация 95 °С — 20 с, отжиг праймера 60 °С — 30 с, элонгация 68 °С — 1 мин). Капиллярный электрофорез проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems Sanger Sequencing 3500 (Thermo Fisher Scientific; США) после очистки образцов от избытка дидезоксинуклеотидов и солей.

Для набора реагентов разработали четыре ПКО: ПКО А, содержащий участок кодона 501 гена S SARS-CoV-2 с мутацией N501Y и участок гена S с делецией 69-70del; ПКО В, содержащий смесь рекомбинантных плазмид с участками кодона 484 гена S SARS-CoV-2 с мутациями E484K и E484Q; ПКО С, содержащий плазмиды c мутациями P681H, L452R и P681R в гене S SARS-CoV-2; ПКО W, содержащий плазмиды с участками кодонов 484 и 501 гена S SARS-CoV-2 без мутаций N501Y и E484K.

Концентрацию каждого из ПКО измеряли методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories; США). ПКО вводили на этапе постановки ОТПЦР как отдельные образцы.

Аналитическая чувствительность и специфичность

Для оценки аналитической чувствительности использовали образцы РНК вируса SARS-CoV-2, полученные путем экстракции из биологического материала (мазки со слизистой оболочки носо- и ротоглотки), которые исследовали с помощью разработанной диагностической системы для выявления минимального порогового разведения, при котором образец детектируется как положительный. Предварительно концентрацию каждого из образцов измеряли методом цифровой капельной ПЦР (ddPCR) с использованием системы QX200 Droplet Digital PCR System (Bio-Rad Laboratories; США). Порог чувствительности устанавливали по минимальному разведению, детектированному в трех повторах.

Для оценки аналитической специфичности набора реагентов использовали РНК штамма вируса SARS-CoV-2 № ГК2020/1 из коллекции НИЦЭМ имени Н. Ф. Гамалеи, РНК штаммов коронавирусов HCoV 229E, HCoV OC43, HCoV Nl63, SARS-CoV HKU39849, MERS-CoV (European Virus ArchiveGlobal 011N-03868 — Coronavirus RNA specificity panel), штаммов вируса гриппа А (H1N1) (ATCC VR-1469), вируса гриппа А (H3N2) (ATCC VR-776) и вируса гриппа В (Victoria Lineage) (ATCC VR-1930) из коллекции АТСС (American Type Culture Collection; США), штаммов Streptococcus pneumoniae (№ 131116), Streptococcus pyogenes (№ 130001), Hаemophilus influenzaе (№ 151221), Staphylococcus aureus (№ 201108), Klebsiella pneumoniae из коллекции патогенных микроорганизмов (ГКПМ) НЦЭСМП Минздрава России, штаммов вируса парагриппа человека типов 1, 2, 3, риновируса человека типов 13, 17, 26 из Государственной коллекции НИИ гриппа имени А. А. Смородинцева в концентрации не менее 1 x 10⁶ ГЭ/мл.

Полногеномное секвенирование образцов (WGS)

Референс-методом выявления мутаций в образцах РНК было полногеномное секвенирование (WGS).

В секвенирование взяли образцы с пороговым циклом (Ct) при постановке ОТ-ПЦР не более 25. Проведена обратная транскрипция образцов РНК с использованием набора реагентов «Реверта-L» («ЦСП ФМБА»; Россия). Полученную кДНК амплифицировали с помощью панели олигонуклеотидов AmpliSeq for Illumina SARS-CoV-2 Research Panel (Illumina; США), которая содержит 247 ампликонов в двух пулах,  полностью покрывающих геном вируса SARS-CoV-2. Подготовку библиотек для высокопроизводительного секвенирования выполняли с помощью набора реагентов AmpliSeq Library PLUS kit (Illumina; США). Качество библиотек оценивали методом капиллярного электрофореза с использованием системы Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent; США). Концентрацию библиотеки измеряли с помощью флуориметра Qubit 4 (Thermo Fisher Scientific; США) с применением набора реактивов HS Qubit dsDNA (Thermo Fisher Scientific; США). Для секвенирования использовали систему Illumina NextSeq 550 и набор реагентов NextSeq 500/550 v2.5 (300 циклов) (Illumina; США). Все процедуры выполняли в соответствии с рекомендациями производителей.

Статистический анализ

Диагностическую чувствительность (долю положительных результатов теста в группе положительных образцов) рассчитывали как В/(А+В)×100%, а диагностическую специфичность (долю отрицательных результатов теста в группе отрицательных образцов) — как В/(А+В)×100%, где В — число исследованных проб, для которых с помощью набора получен положительный результат из общего числа проб, А — число исследованных проб, для которых с помощью набора получен отрицательный результат из общего числа проб c истинно положительным результатом. Доверительные интервалы диагностических характеристик рассчитывали по методу Клоппера–Пирсона, доверительную вероятность считали равной 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При разработке набора реагентов в качестве мишеней были выбраны участки S-гена SARS-CoV-2, фланкирующие мутации, характерные для генетических линий SARSCoV-2 альфа, бета/гамма и дельта. Подобраны праймеры и зонды для выявления мутаций N501Y, P681H и делеции 69-70del, сочетание которых характерно для генетической линии SARS-CoV-2 альфа (B.1.1.7), мутаций P681R и L452R, сочетание которых характерно для генетических линий дельта (B.1.617.2 и все варианты AY), мутации E484K, которая в сочетании с N501Y характерна для генетических линий бета и гамма (B.1.351/P.1, без дифференцировки этих линий).

Набор разработан в формате использования трех ОТПЦР-смесей для проведения анализа, каждая из которых обеспечивает детекцию трех маркеров, регистрируемых по трем различным флуоресцентным каналам. Помимо основных мутаций в гене S спектр определяемых набором генетических маркеров дополнительно включает два кодона E484 и N501, соответствующие референсной последовательности РНК SARS-CoV-2. Они выступают в качестве эндогенного контроля для исключения ложноотрицательного результата.

Для определения аналитической специфичности проведено тестирование образцов других перечисленных выше вирусов и бактерий, ложных положительных результатов выявлено не было. При исследовании РНК штамма вируса SARS-CoV-2 № ГК2020/1 из коллекции НИЦЭМ имени Н. Ф. Гамалеи с помощью набора не обнаружены мутации в кодонах 501, 484, 681 и 69-70 гена S SARS-CoV-2, результат соответствовал полногеномной нуклеотидной последовательности данного изолята, выложенной в базу данных GISAID (EPI_ISL_421275). Для всех образцов, не содержащих РНК SARS-CoV-2, получен следующий результат: недостаточно РНК SARS-CoV-2 для анализа.

Для определения аналитической чувствительности использовали образцы биологического материала c известной концентрацией РНК вируса SARS-CoV-2, определенной методом цифровой капельной ПЦР. Определяемые генетические варианты воcпроизводимо выявляли до концентрации РНК SARS-CoV-2 1 × 10³ копий/мл, что определило аналитическую чувствительность набора реагентов.

Диагностические характеристики разработанного набора реагентов оценены в ходе регистрационных клинических испытаний при исследовании образцов РНК SARS-CoV-2, охарактеризованных методом полногеномного секвенирования или секвенирования S-гена по Cенгеру. Для оценки диагностической чувствительности проанализированы 192 образца мазков из носо- и ротоглотки, в том числе 32 образца, содержащие РНК SARS-CoV-2 c комбинацией мутаций в S-гене, характерной для генетической линии альфа (B.1.1.7), 28 образцов, содержащих РНК SARS-CoV-2 с комбинацией мутаций, характерной для генетических линий бета/ гамма (B.1.351/P1), 50 образцов, содержащих РНК SARSCoV-2 линии дельта (B.1.617.2 и все варианты AY). Для оценки диагностической специфичности использовали 82 образца РНК из мазков из носо- и ротоглотки, содержащих РНК SARS-CoV-2 без анализируемых мутаций. Во всех образцах выявлены все целевые мутации и их комбинации, соответствующие линиям дельта, альфа или бета/ гамма. Дискордантные (неспецифичные) результаты не зафиксированы. Таким образом, определен показатель диагностической чувствительности (ДЧ), соответствующий 100% (ДЧ с 95%-й доверительной вероятностью составила 94,2–100% для линии дельта, 91,1–100% для линии альфа, 89,9–100% для линий бета/гамма). Показатель диагностической специфичности составил 100% (с 95%-й доверительной вероятностью — 96,4–100%).

В дальнейшем при практическом применении набора реагентов было показано полное соответствие результатов выявления линий VOC и их основных мутаций в сравнении с результатами полногеномного секвенирования для 1500 образцов, представляющих собой образцы РНК вируса линий альфа, бета, гамма и других линий (получены с марта по май 2021 г.) и дельта (получены с июня по август 2021 г.). Все проанализированные образцы имели соответствующие комбинации мутаций в S-гене, по которым были определены следующие генетические линии SARS-CoV-2: дельта (n = 750), альфа (n = 302), бета/гамма (n = 32), а также другие варианты (n = 416). Полученные результаты полностью соответствуют данным полногеномного секвенирования, что указывает на высокие диагностические характеристики набора реагентов.

За период с 1 декабря 2020 г. по 30 сентября 2021 г. протестированы более 10 000 клинических образцов РНК SARS-CoV-2, собранных на территории г. Москвы и Московской области в рамках мониторинга распространения линий SARS-CoV-2 особой эпидемиологической значимости. Полученные результаты учтены по месяцам и представлены с указанием доли выявляемых вариантов (рисунок). На протяжении исследуемого периода (с декабря 2020 г. по сентябрь 2021 г.) наблюдали появление линий особой эпидемиологической значимости или отдельных имеющих функционально важное значение мутаций, изменение их встречаемости и дальнейшее вытеснение новыми вариантами вируса SARS-CoV-2. Так, среди образцов, полученных в декабре 2020 г. – январе 2021 г.  не был обнаружен ни один изолят с мутациями, характерными для линий особой значимости, а в последующие несколько месяцев наблюдалось последовательное увеличение доли отдельных линий в каждом периоде по сравнению с предыдущим. За пять месяцев доля образцов РНК SARSCoV-2, содержащих мутации, характерные для линий бета/гамма, изменилась с 0 до 1,6%, а доля образцов, относящихся к линии альфа, выросла с 0 до 19,2%. Доля варианта дельта резко возросла до 25% к концу мая, достигла 87% к середине июня 2021 г., превысила 95% в первую неделю июля и была выше 99% в последующие месяцы до конца исследуемого периода.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Появление новых вариантов SARS-CoV-2 вызывает серьезную озабоченность во всем мире, так как новые линии потенциально могут иметь более высокую трансмиссивность, влиять на длительность и тяжесть заболевания, снижать эффективность вакцин, увеличивать показатели смертности [6, 7, 14–20, 24].

В настоящее время полногеномное секвенирование представляет собой наиболее распространенный универсальный метод выявления новых вариантов SARSCoV-2. К сожалению, это очень трудоемкий, дорогостоящий и требующий больших временных затрат метод. ОТПЦР представляет собой эффективную альтернативу, подходящую для выявления ранее охарактеризованных мутаций (маркеров основных линий), детекция которых важна для мониторинга распространения геновариантов и понимания эпидемиологической обстановки.

В результате проделанной работы создана диагностическая система в формате ОТ-ПЦР в реальном времени для выявления мутаций, которые имеют функциональное значение и позволяют определить генетические линии VOC коронавируса SARSCoV-2. Анализ состоит из этапов выделения РНК, обратной транскрипции РНК, амплификации кДНК с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени и интерпретации результатов.

Представленный набор позволяет дифференцировать РНК коронавируса SARS-CoV-2 вариантов альфа, бета/ гамма и дельта от других генетических линий по выявляемым сочетаниям характерных мутаций. По данным ряда исследований [15–23], наличие отдельных мутаций (E484K, N501Y, P681H, P681R), связанных с другими генетическими вариантами коронавируса, приводит к имеющим функциональное значение изменениям в структуре S-белка — например, способствующих увеличению трансмиссивности вируса и снижению эффективности его нейтрализации антителами, выработанными при инфекции другими ранее распространенными вариантами вируса или вакцинации. Поэтому выявление данных мутаций отдельно без учета их сочетаний также имеет эпидемиологическое значение.

Набор имеет высокую аналитическую чувствительность (1 х 10³ копий/мл РНК SARS-CoV-2) для каждого из определяемых генетических вариантов и 100%-ю аналитическую специфичность в рамках протестированной панели микроорганизмов. Диагностическая чувствительность с 95%-й доверительной вероятностью составила 94,2– 100% для линии дельта, 91,1–100% для линии альфа, 89,9-100% для линий бета/гамма, а диагностическая специфичность с 95%-й доверительной вероятностью — 96,4–100%.

Применение разработанного набора реагентов в рамках эпидемиологического мониторинга позволило своевременно отследить появление штаммов SARS-CoV-2 варианта дельта в г. Москве в апреле 2021 г. и оперативно отразить динамику резкого роста доли штаммов дельта среди вариантов SARS-CoV-2, выявляемых у обследуемых в Московском регионе. Необходимо отметить, что возникновение и дальнейшее распространение варианта дельта в России привело к практически полному вытеснению других линий коронавируса.

ВЫВОДЫ

В ЦСП ФМБА России разработан чувствительный, специфичный и простой в использовании набор реагентов «АмплиТест SARS-CoV-2 VOC v.2» для выявления мутаций в S-гене коронавируса, характерных для генетических линий альфа, бета/гамма и дельта, методом ОТ-ПЦР. Набор проверили на образцах РНК коронавируса, результаты исследования валидировали полногеномным секвенированием, получив полное совпадение. Применение разработанного набора реагентов позволяет быстро и эффективно анализировать распространение генетических линий коронавируса и, исходя из результатов, незамедлительно принимать соответствующие противоэпидемические меры.