Пандемия COVID-19 является глобальной проблемой с 2020 г. Ее основные особенности — высокая заразность вируса SARS-CoV-2, высокие морбидность и смертность [1, 2], а также быстрая эволюция вируса [3]. На сентябрь 2022 г. официально зарегистрировано более 600,5 млн случаев заболевания COVID-19 и более 6,5 млн смертей [4]. Положение усугубляет то, что даже нелетальные случаи заболевания могут вызвать долговременные последствия для здоровья, особенно в сердечно-сосудистой системе [5–7]. Создание универсальной вакцины против COVID-19, способной вызывать долговременный иммунитет против распространенных штаммов вируса, становится неотложной задачей для мировой фармацевтики.

Разработку такой вакцины осложняет высокая антигенная вариативность вируса [8], в том числе его S-белка [9]. На сегодняшний день все клинически сертифицированные и широко распространенные вакцины основаны на использовании S-белка [10]. Высокая специфичность антител и Т-клеточных рецепторов, обусловливающих гуморальный и клеточный иммунные ответы, вследствие быстрой эволюции вируса приводит к снижению эффективности как нейтрализации вируса, так и элиминации инфицированных клеток. В литературе представлены данные о снижении уровня нейтрализации вирусов новых штаммов сыворотками вакцинированных S-белком [11,12]. Стоит также отметить большое число публикаций, описывающих снижение эффективности распознавания Т-клеточных эпитопов, а соответственно и активации Т-клеток эпитопами белков из новых штаммов вируса [11,13–16]. Хотя имеются и противоречащие этому данные о сохранении Т-клеточного иммунного ответа на пептиды, содержащие характерные для новых вариантов вируса мутации [17].

Вследствие эволюции вируса эффективность существующих вакцин против COVID-19 снижается со временем [18]. Гораздо лучшей, чем S-белок, целью для формирования долговременного иммунитета против вируса является его консервативный нуклеокапсидный N-белок [19–21], который не подвержен мутациям, как S-белок. Успешность подхода к созданию вакцин на основе нуклеокапсидных белков, упаковывающих генетический материал вируса, была продемонстрирована для вируса гриппа [22–26], вируса Денге [27–29] и коронавируса [20,30]. Т-лимфоциты и нацеленные с помощью антител натуральные киллеры способны быстро уничтожать инфицированные клетки. Именно механизмы, опосредованные Т-клетками и натуральными киллерами, обеспечивают полную элиминацию вируса из организма. Кроме того, консервативность N-белка влечет за собой его высокую схожесть для разных штаммов, что обусловливает способность вакцины на основе N-белка защищать против широкого спектра вариантов SARS-CoV-2.

В ФГУП СПбНИИВС ФМБА России была разработана вакцина Конвасэл® против SARS-CoV-2 на основе N-белка. Аминокислотная последовательность антигена в вакцине соответствует N-белку штамма Ухань. Вакцина проходит клинические исследования объединенных I и II фаз. Благодаря такому выбору цели вакцина Конвасэл® должна вызывать долговременный иммунитет против всех вариантов SARS-CoV-2. Это выгодно отличает ее от существующих вакцин на основе S-белка. Целью данной работы было продемонстрировать возможность Конвасэл® вызывать специфичный иммунный ответ против спектра существующих штаммов SARS-CoV-2.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Лабораторное исследование проводили в отделе анализа и прогнозирования медико-биологических рисков здоровью ФГБУ ЦСП ФМБА России. В исследование включили 12 субъектов. Переболевшие: шесть пациентов с диагнозом COVID-19, подтвержденным лабораторными исследованиями, переболевшие в январе 2022 г. в легкой форме (три мужчины, три женщины в возрасте 18–51 год). Вакцинированные: добровольцы, прошедшие полную вакцинацию Конвасэл® (две дозы с интервалом 21 день), другие данные вакцинированных субъектов заслеплены до окончания клинического исследования. Критерии включения/исключения пациентов и другие детали исследования представлены в базе данных ClinicalTrials.gov (NCT05156723).

Кровь у переболевших отбирали в день выздоровления. Кровь у вакцинированных — на 42-е сутки после введения первой дозы вакцины. Отбор образцов периферической крови для анализа производили утром натощак (не менее 8 ч после последнего приема пищи) из кубитальной вены пункционным методом в стерильные вакуумные пробирки, содержащие К3-ЭДТА в качестве антикоагулянта.

Мононуклеарные клетки (МПК) получали из образцов периферической крови. Объем образцов периферической крови составлял не менее 6 мл. Все процедуры выполняли не позднее чем через 8 ч после взятия биоматериала. Хранение и транспортировку образцов осуществляли при комнатной температуре (18–25 °C) с сохранением холодовой цепи.

Выделение МПК периферической крови осуществляли методом центрифугирования на градиенте плотности фиколла 1,077 г/л. Для этого цельную кровь несколько раз аккуратно перемешивали путем переворачивания пробирки на 180° 5–6 раз, разводили в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS) в соотношении 1 : 1, после чего наслаивали на фиколл плотностью 1,077 г/мл и центрифугировали 30 мин при нагрузке 450 g с отключенным торможением ротора при комнатной температуре. По окончании центрифугирования с помощью серологической пипетки собирали интерфазное кольцо, расположенное на границе сред фиколла и плазмы крови, и переносили его в чистую коническую пробирку объемом 15 мл. Затем клетки дважды отмывали в DPBS путем центрифугирования при 300 g в течение 10 мин (Eppendorf; Германия). После второго отмывания осуществляли подсчет клеток и оценку жизнеспособности путем окрашивания трипановым синим с помощью автоматического счетчика клеток Countess 3 (Thermo; США), далее клетки разводили в полной среде RPMI 1640 (10% фетальной телячьей сыворотки, 1% пенициллин-стрептомицина) в концентрации до 10⁶ кл./мл. Жизнеспособность клеток составляла не менее 95%.

Определение количества и фенотипа антигенспецифичных клеток осуществляли с помощью многоцветной проточной цитометрии по их способности продуцировать цитокины в ответ на стимуляцию пептидами, охватывающими области N-белков различных вариантов вируса SARS-CoV-2. Для этого в цитометрические пробирки вносили 10⁶ МНК в 100 мкл культуральной среды, добавляли 1 мкг/мл антигена (белок или пуллированные пептиды) и инкубировали в течение 12 ч при 37 °С и 5% CO₂. Спустя 2 ч после внесения антигена к клеткам добавляли 10 мкг/мл брефелдина А (Sigma-Aldrich; США). По завершении инкубации клетки отмывали в фосфатно-солевом буферном растворе Дульбекко (DPBS), после чего осуществляли поверхностное окрашивание с помощью конъюгатов антител anti-CD3 (UCHT1), anti-CD4 (13B8.2), anti-CD8 (B9.11), anti-CD45RA (2H4), anti-CD197 (G043H7) (все антитела производства компании Beckman Coulter; США). Для оценки жизнеспособности клеток использовали Zombie Aqua™ Fixable Viability Kit (Biolegend; США). Затем клетки отмывали в DPBS, фиксировали и пермеабилизировали клеточные мембраны с помощью набора реагентов IntraPrep Permeabilization Reagent (Beckman Coulter; США) и осуществляли внутриклеточное окрашивание с помощью конъюгатов антител anti-IL2 (IL2.39.1) и anti-IFNg (45.15) (Beckman Coulter; США).

Анализ осуществляли на проточном цитометре CytoFlex (Beckman Coulter; США). Для каждого образца регистрировали не менее 100 тысяч Т-клеток. Анализ результатов выполняли с помощью программного обеспечения CytExpert Acquisition and Analysis Software, версия 2.4 (Beckman Coulter; США). Графики подготовлены в программном обеспечении GraphPad Prism 9. Для статистического анализа во всех случаях применяли дисперсионный анализ ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитометрия МПК, стимулированных N-белком штаммов Ухань, Дельта, Омикрон

Моделирование встречи иммунных клеток вакцинированных и переболевших пациентов со штаммами Ухань, Дельта и Омикрон вируса SARS-CoV-2 было проведено с помощью инкубации клеток при добавлении репрезентативных антигенов каждого штамма. Клетки были инкубированы с антигеном SARS-CoV-2 в трех вариантах:

а) полноразмерный N-белок с последовательностью, соответствующей референсному штамму (Ухань);

б) пептидный пул N-белка штамма Дельта;

в) пептидный пул N-белка штамма Омикрон.                

Для создания пептидных пулов для штаммов Дельта и Омикрон был проведен следующий анализ.

1. На портале Coronavirus 3D [31] в разделе Lineages/Mutations отобраны мутации в нуклеокапсидном белке вируса интересующих клад.
2. На портале GISAID [32] загружена референсная нуклеотидная последовательность N-белка (штамм Ухань) и полногеномная референсная последовательность для штамма Дельта B.1.617.2 (EPI_ISL_1663516). На текущий момент для штаммов Омикрон BA.2, BA.4, BA.5 на GISAID отсутствуют референсные полногеномные последовательности.
3. С помощью инструмента VIGOR4 [33] нуклеотидные последовательности N-белка транслированы в аминокислотные.
4. С помощью UGENE [34] внесены мутации, отобранные в п. 1, в референсную последовательность N-белка. Четыре полученных FASTA файла объединены в мульти-FASTA файл.
5. Множественное выравнивание проведено с помощью инструмента MUSCLE [35].

Через выравнивание последовательностей N-белков, характерных для разных штаммов SARS-CoV-2 (рис. 1), было установлено, что различия между нуклеокапсидными белками штаммов Дельта и Омикрон могут быть сведены к следующим мутациям, по сравнению с N-белком референсного штамма Ухань. Омикрон: P13L, 31-33del, P151S, R203K, G204R, S413R; Дельта: D63G, R203M, G215C, D377Y.

На основании этого анализа были выбраны пептидные пулы для представления каждого штамма (рис. 2), c пятью мутациями и тремя пептидами для каждой с перекрытием в 11 аминокислот. Несмотря на наличие литературных данных по иммунодоминантным эпитопам у вакцинированных и переболевших COVID-19 [36] в данной работе был сделан выбор в пользу эпитопов, содержащих мутации, поскольку они наиболее репрезентативны в плане изменений иммунного ответа в связи с эволюцией вируса.

Для анализа и сравнения клеточного иммунитета, вызываемого вакциной Конвасэл® и инфекцией SARSCoV-2, кровь была отобрана у участников клинических исследований вакцины Конвасэл® и у добровольцев, перенесших COVID-19. Затем МПК были выделены и заморожены до момента проведения анализа. После разморозки клетки были разделены на аликвоты и специфично стимулированы антигенами из штаммов Ухань, Дельта и Омикрон. Кроме того, были введены соответствующие отрицательная (питательная среда) и положительная (ацетат форбола миристата и иономицин) контрольные пробы. Подробнее протокол стимуляции описан в разделе «Пациенты и методы».

После стимуляции была произведена окраска МПК флюоресцентными антителами к маркерам, соответствующим основным фенотипам Т-клеток — CD4, CD8, а также маркерам их активации — IFNγ, IL2. Затем был проведен цитометрический анализ окрашенных МПК.                     

Результаты анализа (рис. 3) показали, что для вакцинированных, в целом, стимуляция N-белком вызывает схожий иммунный ответ всех исследованных субпопуляций Т-хелперов и Т-киллеров для всех штаммов SARS-CoV-2.

Для субпопуляции МПК CD4⁺INFγ⁺ вакцинация Конвасэл® вызывает ответ, схожий с ответом после самого заболевания, при этом статистически значимые различия в количестве активированных клеток для N-белка разных штаммов отсутствуют как у вакцинированных, так и у переболевших.

Для субпопуляции МПК CD8⁺INFγ⁺ наблюдается немного более сильный ответ у перенесших заболевание, чем у вакцинированных, и более сильный ответ при стимуляции N-белком штаммов Ухань и Дельта, чем при стимуляции N-белком штамма Омикрон. Тем не менее статистически значимые различия между субпопуляциями отсутствуют, и во всех случаях стимуляция N-белком вызывает сильный ответ.

Для клеток CD4⁺IL2⁺ сильный ответ получен у вакцинированных и значимо более слабый — у переболевших. Разница при стимуляции N-белком разных штаммов отсутствует.

Наконец, для клеток CD8⁺IL2⁺ выявлен одинаково слабый ответ у всех субпопуляций, вне зависимости от источника иммунитета и штамма протеина для стимуляции.

Фенотипирование клеток памяти       

Дополнительный анализ фенотипа специфичных клеток памяти (рис. 4), активирующихся у вакцинированных Конвасэл® и перенесших COVID-19 после обработки N-белком разных штаммов вируса, показал отсутствие значимых различий между структурой иммунного ответа во всех субпопуляциях.

Для Т-хэлперов характерно доминирование эффекторных клеток памяти (EM) на уровне примерно 60% от всех активированных клеток и превалирование центральных клеток памяти (CM) на уровне примерно 30% от общего числа клеток. Наивные (naive) Т-клетки представлены на уровне около 10%, а клетки памяти с увеличенным количеством эффекторов (TEMRA) представлены слабо. Каких-либо статистически значимых различий между переболевшими и вакцинированными, а также между штаммами SARS-CoV-2 нет.

Для цитотоксичных Т-клеток характерно наличие 40–50% эффекторных клеток памяти и 20–40% TEMRAклеток. Наивные Т-клетки и центральные клетки памяти представлены на уровне 10–20%. При стимуляции N-белком штамма Омикрон наблюдается более высокая пропорция TEMRA-клеток и более низкие пропорции наивных Т-клеток и клеток центральной памяти, по сравнению со стимуляцией белком штамма Дельта, но эти различия не являются статистически значимыми. Различий между вакцинированными и переболевшими не наблюдается.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ранее были опубликованы данные с долей CD4⁺- и CD8⁺-клеток, отвечающих экспрессией IFNγ на стимуляцию антигенами [17, 37]. У вакцинированных мРНК-вакцинами с S-белком обнаружен более сильный ответ к гомологичному штамму, чем для переболевших COVID-19 [17]. Более сильный Т-клеточный ответ, в частности CD4⁺IL2⁺-клеток (см. сравнение столбцов серых и красных оттенков на рис. 3), наблюдается для вакцинированных Конвасэл® по сравнению с переболевшими, однако в отличие от S-белковых вакцин этот эффект распространяется и на не гомологичные штаммы. В образцах крови переболевших около 40 из 10⁵ CD4⁺-клеток и 50 из 10⁵ CD8⁺-клеток секретируют IFNγ при стимуляции пептидами из N-белка [17]. Количество отвечающих на стимуляцию клеток у переболевших, по нашим данным, немного меньше количества, приведенного в работе [17]. Стоит отметить что количество отвечающих на стимуляцию Т-лимфоцитов пептидами из S-белка стремительно снижается как у переболевших, так и у вакцинированных мРНК-вакцинами [37, 28]. Число клеток снижается в 2 раза в среднем за 1–1,5 месяца.

Результаты свидетельствуют о том, что вакцина Конвасэл® способна вызывать такой же или более сильный иммунный ответ на SARS-CoV-2 по сравнению с перенесенным заболеванием: число активированных цитотоксичных Т-клеток и Т-хэлперов статистически не различается для вакцинированных и переболевших субъектов, а количество продуцирующих IL2 Т-хэлперов для вакцинированной группы значительно выше. Полученные данные подтверждают способность Конвасэл® создавать высоконапряженный клеточный иммунный ответ на N-белок SARS-CoV-2.

Отсутствуют также какие-либо значимые различия в числе активированных клеток для всех вакцинированных субпопуляций при стимуляции N-белком любого из использованных штаммов вируса, что свидетельствует о способности Конвасэл® формировать одинаково сильный иммунитет против новых штаммов.

Фенотипирование CD4⁺-клеток памяти у вакцинированных и переболевших проводили ранее [37]. Доминирование клеток CD4⁺-CM и CD4⁺-EM (40–50% от всех отвечающих клеток), полученное в нашей работе, хорошо согласуется с данными этих авторов.

Отсутствие различий в структуре иммунного ответа у вакцинированных при стимуляции белками разных штаммов SARS-CoV-2 подтверждает способность Конвасэл® формировать высоконапряженный клеточный иммунитет против всех штаммов вируса, а схожесть структуры иммунного ответа при вакцинации и после перенесенного заболевания свидетельствует в пользу эффективности иммунного ответа, формируемого вакциной.

ВЫВОДЫ

Вакцина Конвасэл® показала способность формировать одинаково сильный клеточный иммунный ответ против штаммов Ухань, Дельта и Омикрон SARS-CoV-2. Это подчеркивает перспективность подхода к созданию универсальной вакцины от COVID-19 на основе белка N. Данное исследование демонстрирует способность Конвасэл® создавать высоконапряженный клеточный иммунитет против актуальных циркулирующих штаммов SARS-CoV-2. В свете быстрой эволюции вируса наличие универсальной вакцины позволит обеспечить защиту населения от новых волн COVID-19.