Гептил (несимметричный диметилгидразин — НДМГ) используют в качестве жидкого топлива для вывода на орбиту космических кораблей типа «Протон», «Циклон», «Космос», «Рокот», «Стрела» и автоматических спутников Земли. Широкое использование НДМГ в ракетно-космической технике обусловлено его особыми эксплуатационными свойствами, и замены ему, как горючему, в ближайшем будущем не предвидится [1]. Благодаря его физико-химическим свойствам (высокая летучесть и растворимость в водных растворах) диметилгидразин мигрирует в природной среде, разлагается на ряд высокотоксичных продуктов, длительно сохраняется в почве. НДМГ относится к 1 классу опасности, он обладает канцерогенным, мутагенным, эмбриотоксическим («желтые дети») и тератогенным (нарушения эмбрионального развития) действием, вызывая развитие злокачественных опухолей у работающих с ним людей или проживающих на загрязненных территориях [1, 2]. Авиационный керосин, который применяют в пилотируемых кораблях типа «Союз», также высокотоксичен [1]. 

К настоящему моменту не разработаны действенные, экологически безопасные и дешевые методы очистки почв, загрязненных гептилом и авиационным керосином. Все существующие технологии можно условно разделить на три группы: термические (сжигание); методы глубокого окисления НДМГ с применением водных растворов, содержащих активные вещества, которые реагируют с НДМГ и в одном случае образуют нерастворимые или малорастворимые комплексы, а в другом — способствуют разложению до более простых по своему составу соединений. В основном применяют химические средства (перекись водорода, растворы марганцовокислого калия, негашеную известь), что дорого, экологически вредно и приводит к потере плодородия рекультивируемых почв. Другая разновидность методов включает использование водных растворов, содержащих активные вещества, в частности мета-нитробензойную кислоту, которая при определенных значениях рН среды образует с НДМГ комплексное соединение в виде твердой фазы. Далее, согласно предложенному методу, загрязненные НДМГ растворы подвергают термическому обезвреживанию в специальной печи. Применяют также связывание НДМГ в почве составами, содержащими гуминовые кислоты, торф, шунгит. Однако этот метод не обеспечивает очистку грунта до уровня ПДУ (0,1 мг/кг) [3].

Для детоксикации почвы и нейтрализации НДМГ на поверхности металлоконструкций, стен укрытий и т. д. применяют пероксид кальция, при разложении которого выделяется атомарный кислород, участвующий в реакции распада НДМГ. Недостатком данного способа является низкая степень очистки загрязненных участков, длительный процесс детоксикации [3].

Биологические технологии рекультивации загрязненных территорий являются наиболее предпочтительными ввиду экологической безопасности, низкой себестоимости работ и достаточно высокой эффективности, что было неоднократно продемонстрировано при решении различных экологических задач. Известно большое количество содержащих в своем составе набор бактериальных штаммов с аэробным типом дыхания биологических препаратов экологического назначения, предназначенных для биохимической деструкции и утилизации загрязнителей в основном углеводородной природы (нефти и продуктов ее промышленной переработки) [4–7]. Известны биологические способы, в основе которых лежит метод управляемого биокомпостирования. При этом используемые биопрепараты созданы на основе микроорганизмов, для которых опасные отходы являются источником питания. При таком способе детоксикации почв не используются токсичные химические соединения, метод экологически безопасен, микроорганизмы-деструкторы после разложения НДМГ погибают из-за недостатка питания, сохраняются биологическая активность и плодородие обрабатываемой почвы [8].

В России и за рубежом все более активно используют микроорганизмы для очистки загрязненной КРТ почвы и воды. Так, на космодроме «Байконур» (Казахстан) проводят исследования по применению аборигенных почвенных микроорганизмов для разложения диметилгидразина. Их выделяют из почвы и затем выращивают в ферментерах для внесения в загрязненную почву [9]. В настоящее время имеются единичные сообщения о видах и ассоциациях микроорганизмов, способных утилизировать НДМГ. Так, разработан способ биодеструкции гептила с использованием ассоциации микроорганизмов Acinetobacter sp. H-1, Rhodococcus sp. Н-2, Arthrobacter sp. H-3 [10]. Предложен способ биологической очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов при помощи экобиопрепарата «Центрум-MMS» [11], также способного обеспечить биодеструкцию несимметричного диметилгидразина в водных растворах. Основой экобиопрепарата являются микроорганизмы видов Pseudomonas fluorescens ВКМ В-6847 и Rhodococcus erythropolis AC-1769. Однако, по данным авторов изобретения, экобиопрепарат «Центрум-MMS» не обладает способностью очищать загрязненную гептилом почву [11].

Разработка и внедрение в практику эффективных технологий биоремедиации загрязненных высокотоксичными КРТ почв крайне актуальны. В настоящее время нет готовых микробных препаратов и высокоэффективных промышленных штаммов бактерий для биоремедиации почвы от НДМГ и авиационного керосина, что и явилось основанием для проведения исследования.

Целью исследования было выделить штаммы микроорганизмов-деструкторов КРТ, а также изучить их эколого-токсикологическую безопасность и возможности применения для биоремедиации загрязненных почв.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В ходе многолетних экспедиционных работ по отбору загрязненных почв и последующих лабораторных исследований в НИЦ ТБП создана коллекция культур микроорганизмов, разлагающих различные токсичные химические вещества (нефтепродукты, полициклические ароматические углеводороды, минеральные масла, фенолы, полихлорированные бифенилы, этиленгликоль, гептил, авиационный керосин, пестициды, иприт, люизит, хлорорганические и фосфорорганические соединения). Для выделения штаммов микроорганизмов, разлагающих гептил и авиакеросин, использовали образцы почв из длительно загрязненных пестицидами и нефтепродуктами территорий, с участков аварийных проливов гептила и с места падения ракеты носителя «Протон-М» — комплекс Байконур, площадка 81 (Казахстан).

Для выделения микроорганизмов-деструкторов КРТ использовали метод накопительных культур и последующий высев на минимальную питательную среду, содержащую в качестве единственного источника углерода формальдегид (продукт первичной деструкции гептила) или авиационный керосин [12].

Чистые культуры выделенных микроорганизмов идентифицировали методом МАЛДИ во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ФИЦ ПНЦБИ РАН, г. Пущино; Россия).

Биомассу микроорганизмов-деструкторов КРТ для лабораторных и полевых экспериментов наращивали на термостатируемой качалке Certomats-BS1 (Sartorius; Швеция) до выхода культуры на стационарную фазу роста (24–48 ч в зависимости от штамма) при температуре 28 °С и скорости 180 об./мин.

В качестве референс-штамма использовали штамм бактерии Rhodococcus globerulus 19Ф — биодеструктора НДМГ (гептила) [13].

В лабораторных и полевых экспериментах использовали дерново-подзолистую почву.

Микробную суспензию обрабатывали микрокапсулами на основе полимочевины (ООО «БНТ»; Россия).

Интегральную (суммарную) токсичность проб воды и почвы оценивали на лабораторной культуре рачка Daphnia magna, культивируемой в НИЦ ТБП в климатостате. Биотестирование проводили в соответствии с методиками [14, 15].

Определение интегральной токсичности почв проводили биолюминесцентным методом с использованием бактериального теста «Эколюм» (МГУ; Россия) на приборе «Биотокс-10М» (МГУ; Россия) согласно методическим рекомендациям [16, 17].

При определении дегидрогеназной активности почвы в качестве субстрата использовали бесцветный 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый. Общую гидролазную активность почвы изучали по реакции гидролиза флуоресцеин диацетата. Для оценки целлюлозоразлагающей способности почвы применяли аппликационный метод [18].

Фитотоксичность образцов почвы определяли тестированием на семенах овса по методу  О. А. Берестецкого [19].

Содержание авиационного керосина определяли с помощью анализатора нефтепродуктов, инфракрасного спектрометра КН-2 («Новолаб»; Россия) согласно методике [20].

Исследования патогенности (безопасности) микроорганизмов-деструкторов КРТ выполняли в соответствии с методическими указаниями МЗ СССР № 2620-82, № 4263-87 с учетом рекомендаций Всемирной организации здравоохранения [21–23]. Исследования включали в себя изучение вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах белых мышей и крыс.

Статистическую обработку результатов экспериментов проводили с использованием пакетов прикладных программ Excel 7.0 (Microsoft; США) и Statistica 10.0 (StatSoft; США). Экспериментальные данные представляли в виде средних арифметических величин и их доверительных интервалов, рассчитанных с вероятностью 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение микроорганизмов-деструкторов КРТ из загрязненной почвы

Микроорганизмы-деструкторы гептила выделяли из образцов почв, загрязненных НДМГ. Всего было получено более 100 микробных изолятов. Затем микроорганизмы пересевали на минимальную среду с формальдегидом в градиенте концентрации от 0 до 500 мг/л, длительное время культивировали (до 10 суток), наблюдая за ростом. Штаммы 2Г, 4Г, 5Г, Г8/2, Y-21 были способны расти при концентрации формальдегида 200 мг/л; референс-штамм 19Ф и штамм Г-803 росли при концентрации 100 мг/л; штаммы 19 С/1 и 37М/1 сохраняли жизнеспособность при концентрации 80 мг/л.

Микроорганизмы-деструкторы авиакеросина выделяли из загрязненных нефтепродуктами почв с территорий аэропортов, нефтебаз, автомобильных заправок. Из 34 полученных изолятов были отобраны шесть наиболее активных штаммов бактерий, растущих на минимальной питательной среде, содержащей 5% дизельного топлива. По результатам проведенных дальнейших лабораторных исследований были выбраны три наиболее активных штамма-деструктора авиакеросина — 12Р, 37М/1и 62М/3.

По результатам лабораторных исследований на загрязненной почве и оценки параметров роста микроорганизмов на питательной среде для дальнейших экспериментов по созданию ассоциации биодеструкторов КРТ были отобраны штаммы Pseudomonas putida 5Г (НДМГ) и Rhodococcus erythropolis 62М/3 (авиакеросин). Ассоциация микроорганизмов-деструкторов активно размножалась в загрязненной КРТ почве и разлагала эти токсиканты. Интегральная токсичность загрязненной гептилом и авиакеросином почвы после обработки ассоциацией микроорганизмов-деструкторов КРТ постепенно снижалась до безопасного уровня, при этом повышалась ее ферментативная активность.

Токсикологические исследования выделенных штаммов микроорганизмов-деструкторов КРТ на лабораторных животных

Исследования патогенности микроорганизмов-деструкторов гептила Ps. putida 5Г и авиакеросина Rh. erythropolis 62М/3 включали в себя изучение вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах беспородных белых мышей и крыс. Устанавливали также степень проявления раздражающего действия этих бактерий на слизистую оболочку глаз кроликов.

Вирулентность изучали при однократном введении бактерий внутрижелудочно и внутрибрюшинно белым мышам и крысам. К концу срока наблюдения все опытные животные были живы. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы. Установлено, что при внутрижелудочном введении Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 показатель ЛД₅₀ для крыс и мышей превышал 10⁹ микробных клеток, а при внутрибрюшинном ЛД₅₀ превышала 10⁸ микробных клеток.

Токсичность изучали при внутрибрюшинном введении белым мышам взвесей суточных культур исследуемых штаммов. К концу срока наблюдения все животные опытной группы были живы. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы. Показано, что испытанные штаммы Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 не были токсичны для теплокровных животных.

Токсигенность определяли путем внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения белым мышам фильтратов 3- и 7-суточных бульонных культур исследуемых штаммов. К концу срока наблюдения все животные были живы. Клиническое состояние, потребление корма и воды у животных соответствовали показателям физиологической нормы, признаков проявления токсических эффектов у животных отмечено не было. Таким образом, испытанные штаммы микроорганизмов-деструкторов Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 не токсигенны для теплокровных животных.

Чтобы исследовать диссеминацию во внутренних органах животных, заражение белых мышей и крыс выделенными штаммами проводили внутрижелудочно и внутрибрюшинно. К концу срока наблюдения гибели животных отмечено не было. При патологоанатомическом вскрытии различия между органами животных опытных и контрольных групп не установлены. Органы грудной и брюшной полостей имели анатомически правильное расположение и нормальную макроструктуру, патологических изменений на макроуровне не обнаружено. Роста культур микроорганизмов в высевах из органов животных не наблюдали. Следовательно, по данным высевов отпечатков органов, изученные штаммы микроорганизмов-деструкторов КРТ не способны к диссеминации и не вызывают бактериального поражения органов теплокровных животных.

При изучении раздражающего действия на слизистую оболочку глаза через 4 ч после внесения микробной суспензии Ps. putida 5Г или Rh. erythropolis 62М/3 в конъюнктивальный мешок глаза кроликов и на протяжении всего периода наблюдения признаков раздражающего действия выявлено не было. У всех животных состояние глаза, в который вносили бактерии, не отличалось от контрольного. Проведенные исследования показали, что бактерии Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 не обладают раздражающим действием на слизистую оболочку глаз теплокровных животных.

Таким образом, в результате токсикологических исследований по показателям вирулентности, диссеминации, токсичности и токсигенности установлено, что микроорганизмы-деструкторы формальдегида (гептила) Ps. putida, штамм 5Г, и авиакеросина Rh. erythropolis, штамм 62М/3, являются непатогенными (безопасными) для теплокровных животных. Микроорганизмы безопасны и могут применяться для биоремедиации загрязненных почв без ограничений.

Определение основных параметров и режимов культивирования микроорганизмов-деструкторов в ферментационной установке

Отобранные нами штаммы Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 имеют различную родовую принадлежность. В связи с этим была изучена возможность их совместного роста на агаризованной среде (перекрестный посев) на чашках Петри. Угнетения роста при совместном выращивании штаммов не наблюдалось.

Определены основные параметры и режимы культивирования штаммов-деструкторов КРТ Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 на различных питательных средах. Оптимальный режим культивирования штаммов составил 28 °С в течение 24 ч.

Эффективность деструкции 0,05% формалина и 0,1% авиакеросина в почве ассоциацией микроорганизмов-деструкторов КРТ в лабораторных условиях

Исследования микробной биоремедиации почвы от загрязнения КРТ проводили в лабораторных условиях в пластиковых стаканах емкостью 0,5 л. Рабочие концентрации загрязнителя в почве создавали путем внесения растворов 0,05% (или 500 мг/кг) формалина (имитатор гептила, продукт его первичного разложения) и 0,1% (или 1000 мг/кг) авиационного керосина.

Пробы почвы для проведения химических анализов и определения токсичности отбирали до внесения микроорганизмов-деструкторов, через 7, 14, 21 и 30 суток (по окончании эксперимента).

В процессе эксперимента проводили целый комплекс исследований, в том числе определение концентрации авиакеросина, интегральной токсичности почвы на дафниях, концентраций микроорганизмов-деструкторов и почвенной микрофлоры, дегидрогеназной, гидролазной и целлюлозоразлагающей активности, фитотоксичности для семян овса.

Изучение микробной обсемененности почвы показало, что численность микроорганизмов-деструкторов гептила и авиационного керосина сохранялась в почве в течение всего срока биоремедиации, их подавляла сапрофитная микрофлора (табл. 1). Численность сапрофитной микробиоты почвы во время всего эксперимента оставалась практически на одном уровне (табл. 1).     

В ходе микробной ремедиации концентрация загрязнителя в почве постепенно снижалась (рис. 1).

Биотестированием на дафниях определена интегральная токсичность загрязненной почвы до и после обработки микроорганизмами-деструкторами. До обработки загрязненная авиакеросином и формалином почва вызывала  гибель 100% дафний. После 14 суток микробной ремедиации токсичность почвы снижалась до безопасного уровня (табл. 2).       

Определена ферментативная активность загрязненной почвы (дегидрогеназная, гидролазная и целлюлазная) до и после обработки микроорганизмами-деструкторами. Загрязнение почвы авиакеросином и формалином вызывало снижение ферментативной активности. После 30 суток микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышалась (рис. 2–рис. 4).      

В ходе микробной ремедиации фитотоксичность почвы значительно снизилась, а по показателям «Длина проростков» и «Число непроросших семян» приблизилась к уровню условно-чистой почвы (табл. 3).     

Полевые испытания микробной деструкции формалина и авиакеросина в почве ассоциацией микроорганизмов-деструкторов КРТ

Изучение микробной деструкции гептила и авиакеросина в почве проводили в полевых условиях на экспериментальных делянках. Рабочие концентрации загрязнителя в почве создавали путем внесения 0,1% формалина и 0,1% авиакеросина. Микробную ассоциацию штаммов-деструкторов Ps. putida 5Г и Rh. erythropolis 62М/3 вносили в концентрации 1 × 10⁷ КОЕ/мл из расчета 1 л/м² почвы. Отбор проб почвы для исследований проводили в течение 60 суток. Экстракт из почвенных образцов высевали  на чашки Петри с гидролизатом рыбной муки и формалином (100 мг/л) для штамма 5Г, на чашки Петри с минимальной солевой средой и 1% дизельного топлива для штамма 62М/3. Концентрацию сапрофитных (аборигенных) бактерий определяли на среде ГРМ.

В ходе полевого эксперимента проводили комплекс исследований, а именно определение в почве концентрации авиакеросина, интегральной токсичности почвы на дафниях, численности микроорганизмов-деструкторов и почвенной микробиоты (табл. 4), дегидрогеназной, гидролазной и целлюлозоразлагающей активности, фитотоксичности.

Исходная численность обоих штаммов  (после внесения в почву) находилась на уровне 10⁵ КОЕ/г почвы, почвенных сапрофитов — на уровне 10⁴ КОЕ/г почвы. Максимальная численность бактерий наблюдалась на 7-е сутки: она составила (5,9 ± 0,48) × 10⁶ КОЕ/г почвы для штамма 5Г, (6,5 ± 0,55) × 10⁶ КОЕ/г почвы для штамма 62М/3. Начиная с 45-х суток происходило небольшое снижение численности биодеструкторов в связи с разложением ими загрязняющих веществ в почве и соответствующим уменьшением необходимых для их существования питательных субстратов. Численность сапрофитных бактерий в загрязненной почве достигла максимальных значений на 60-е сутки опыта. В чистой почве численность сапрофитных микроорганизмов оставалась практически на одном уровне в течение всего эксперимента.

Обработанная формалином и авиакеросином почва в начале эксперимента обладала высокой токсичностью для дафний (табл. 5). В ходе эксперимента обработанная микроорганизмами загрязненная почва стала нетоксичной к 7-м суткам.      

Концентрация авиационного керосина в почве во время биоремедиации постепенно снижалась (рис. 5).     

Ферментативная активность почвы во время биоремедиации претерпела значительные изменения (рис. 6–рис. 8).      

Как показали результаты исследований, при внесении формалина и авиакеросина биологическая активность почвы значительно снизилась. Так, дегидрогеназная и гидролазная активности почвы на 7-е сутки полевого эксперимента составили 19 и 24% соответственно в исследуемых вариантах по сравнению с чистой почвой (контроль). Начиная с 30-х суток эксперимента наблюдалось увеличение биологической активности в загрязненной почве, обработанной микроорганизмами-деструкторами. Через 60 суток показатели ферментативной активности почвы существенно превышали аналогичные показатели в загрязненной почве без микробной ремедиации: дегидрогеназная активность почвы — в 2,4, гидролазная — в 2,1, целлюлазная — в 5,1 раза.

В ходе полевого эксперимента определена фитотоксичность загрязненной формалином и авиационным керосином почвы. К 60-м суткам выявлено снижение фитотоксичности рекультивированной почвы для семян овса по показателям «Длина проростков и корней», «Число непроросших семян» до уровня чистой почвы (табл. 6).   

В ходе полевого эксперимента выявлено снижение острой токсичности и фитотоксичности очищаемой почвы, повышение ее биологической активности (уровни дегидрогеназ, гидролаз, целлюлаз).

Микроорганизмы-деструкторы КРТ Ps. putida штамм 5Г и Rh. erythropolis штамм 62М/3 депонированы во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номерами ВКМ Ас-2933D и ВКМ В-3636 D.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Проведено выделение из почв, длительное время загрязненных диметилгидразином и авиационным керосином, микроорганизмов, способных разлагать эти вещества. В ходе лабораторных исследований отобраны два наиболее активных штамма микроорганизмов — биодеструктора формальдегида (гептила) Ps. putida, штамм 5Г, и биодеструктора авиакеросина Rh. erythropolis, штамм 62М/3. Отработаны режимы их раздельного и совместного культивирования.

По результатам токсикологических исследований на белых мышах и крысах, по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации установлено, что Ps. putida, штамм 5Г, и Rh. erythropolis, штамм 62М/3, являются непатогенными (безопасными) для теплокровных животных. Микроорганизмы можно применять для биоремедиации загрязненных почв без ограничений.

Результаты лабораторных экспериментов показали, что обработка загрязненной формалином и авиационным керосином почвы ассоциацией микроорганизмов-деструкторов КРТ в течение 30 суток приводит к снижению загрязнения почвы, уменьшению ее интегральной токсичности и фитотоксичности. В ходе микробной ремедиации ферментативная активность почвы постепенно повышалась до уровня незагрязненной почвы.

Результаты полевого эксперимента показали, что ассоциация микроорганизмов, состоящая из биодеструктора формалина (гептила) Ps. putida, штамм 5Г, и биодеструктора авиакеросина Rh. erythropolis, штамм 62М/3, пригодна для очистки почв, загрязненных КРТ. Внесенные в загрязненную почву микроорганизмы-деструкторы КРТ не подавляются аборигенной микрофлорой и активно размножаются.

Выделенные штаммы микроорганизмов-деструкторов КРТ можно без ограничений применять на российских космодромах и «Байконуре» (Казахстан) для очистки загрязненных территорий.

Осуществление комплекса мероприятий по детоксикации загрязненной КРТ почвы позволит снизить риск возникновения профпатологий у работников, занятых на работах по биоремедиации почвы и при утилизации ракетной техники.

ВЫВОДЫ

Результаты лабораторных и полевых испытаний ассоциации микроорганизмов-деструкторов компонентов ракетных топлив (КРТ) Pseudomonas putida, штамм 5Г, и Rhodococcus erythropolis, штамм 62М/3, показали ее высокую эффективность в очистке от КРТ и экологотоксикологическую безопасность. Ассоциацию микроорганизмов Ps. putida, штамм 5Г, и Rh. erythropolis, штамм 62М/3, можно рекомендовать для практического применения — биоремедиации загрязненной КРТ почвы.