В настоящее время не теряет актуальности проблема распространения коронавирусной инфекции COVID-19, вызываемой SARS-CoV-2. Несмотря на то что своевременная вакцинация способна снизить риски тяжелого протекания инфекции, разработка дополнительных средств, способных облегчить тяжелое течение или предотвратить заражение COVID-19, по-прежнему имеет высокий приоритет, в том числе потому, что антитела на вакцинные антигены могут не распознавать новые варианты вируса.

На сегодняшний день профилактика и лечение COVID-19 преимущественно заключались в применении и разработке вакцинных препаратов для формирования нейтрализующих антител к спайковому белку, препаратов иммунных сывороток и моноклональных антител, противовирусных препаратов [1] и препаратов, направленных против гиперактивации иммунного ответа [2] при симптоматической поддерживающей терапии и респираторной поддержке инфицированных. Во время борьбы с пандемией COVID-19 особое внимание было уделено перепрофилированию лекарственных препаратов, поскольку их известные профили безопасности и фармакокинетики позволили своевременно внедрить их в применение в отличие от новых лекарственных средств, требующих полного спектра испытаний и регистрации. В настоящее время в последнюю 16-ю версию Временных методических рекомендаций «Профилактика, диагностика и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)» в качестве химиопрепаратов прямого противовирусного действия включены фавипиравир, молнупиравир, нирматрелвир + ритонавир, ремдесивир, умифеновир. Рекомендованы также биотехнологические препараты: интерферон-альфа, синтетическая малая интерферирующая рибонуклеиновая кислота (двуцепочечная) [3]. Однако для каждого из этих препаратов в отношении COVID-19 клинические исследования ограничены, часто противоречивы, нет бесспорной доказательной базы и опыта применения. Наличие многочисленных мутаций в S-белке указывает на его возможность приобретать новые свойства лигандной специфичности [4].

Механизм проникновения SARS-CoV-2 в клетки, связанный с ангиотензинпревращающим ферментом 2 (АПФ2), представляет собой сложный многофакторный процесс, требующий вовлечения многих вспомогательных молекул — протеиназ, корецепторов и активаторов их экспрессии. Наличие корецепторов позволяет SARS-CoV-2 инфицировать клетки с низкой экспрессией АПФ2 на мембранах.

Так, S-белок как гликопротеин может взаимодействовать с рецепторами не только белковой частью, но и путем связывания с лектиновыми рецепторами своей углеводной составляющей (N-гликаны S1-субъединицы, содержащие олигоманнозу и сложные сахара, защищающие вирус от антител) [5, 6]. Связывание лектиноподобных S1-сайтов с гликокаликсом клетки-мишени через О-ацетилированные сиаловые кислоты [7] и гепарансульфат [8] может способствовать инфицированию клетки. Было показано, что гепарансульфат усиливает проникновение многих типов вирусов в клетки [9], в том числе и SARS-CoV-2 [10]. Полисахаридные цепи гепарансульфатпротеогликанов в большинстве случаев имеют большой отрицательный заряд, что позволяет рекрутировать вирусные частицы SARSCoV-2 на поверхность клетки вследствие взаимодействия с S-белком,  что увеличивает его локальную концентрацию для последующего связывания с АПФ2. Есть основания полагать, что положительно заряженная связывающая бороздка, расположенная на RBD-домене S-белка, может служить сайтом связывания для отрицательно заряженных полисахаридных цепей гепарансульфатпротеогликанов [8, 11], при этом специфичность связывания в значительной степени зависит от комплементарного пространственного расположения основных групп белка и сульфатных и карбоксильных групп полисахарида [12–14].

В качестве мощных ингибиторов проникновения SARS-CoV-2 в клетки скрининг перепрофилирования имеющихся лекарств позволил выявить несколько соединений, нацеленных на гепарансульфатпротеогликаны и зависимые от них пути эндоцитоза. Одним из таких соединений является лактоферрин (ЛФ) — встречающийся в природе нетоксичный гликопротеин, который доступен в качестве пищевой добавки [15].

Оценка противовирусной активности ЛФ на модели инфицирования коронавирусом иммортализованной линии клеток колоректальной аденокарциномы человека Caco-2 и клеток почечного эпителия африканской зеленой мартышки Vero 6 показала, что ЛФ частично ингибирует заражение и репликацию SARS-CoV-2 [16]. В ряде исследований эффектов связывания ЛФ с рецептором показано его влияние на различные сигнальные системы и пути, включающие NF-κB и различные регуляторные факторы интерферона, что приводит к модуляции противовирусного иммунного ответа [17]. Показано влияние ЛФ и на регуляцию TLR, особенно TLR3 и TLR7, участвующих в распознавании РНК-вирусов [18, 19], и ингибирование катепсина L [20], что приводит к блокировке проникновения SARS-CoV-2 в клетки эмбриональной почки человека 293/hАПФ2 [21]. В экспериментальных условиях [16] показано, что ЛФ может ингибировать экспрессию иммуносупрессивного цитокина TGFB1, подавлять экспрессию тимического стромального лимфопоэтина, высокие уровни которого были обнаружены на слизистой оболочке бронхов у пациентов с астмой и хронической обструктивной болезнью легких, и снижать экспрессию провоспалительных цитокинов IL1B и IL6. Эти иммуномодулирующие эффекты ЛФ могут противодействовать активации цитокинового шторма.

Еще одним перспективным перепрофилированным соединением является азитромицин, оказывающий влияние на множество процессов. Прежде всего, азитромицин, влияющий на снижение экспрессии матриксных металлопротеиназ, связанных с CD147, привлек внимание исследователей, сформировавших гипотезу о том, что азитромицин может ингибировать CD147 и, в итоге, блокировать проникновение вируса в клетки-хозяева [22]. Было продемонстрировано, что CD147 индуцирует активацию сигнального пути PI3K/AKT, способствуя индукции NF-ҡB и продукции провоспалительных цитокинов [23, 24]. Сигнальный путь PI3K/AKT увеличивает экспрессию сериновой протеазы TMPRSS2, что способствует большему проникновению вируса в клетки.

Иммуномодулирующие свойства азитромицина [25] могут играть важную роль при лечении гипервоспалительного состояния, вызванного цитокиновым штормом, при тяжелых стадиях протекания COVID-19. In vitro азитромицин показал снижение секреции провоспалительных цитокинов и хемокинов [26, 27]. Кроме того, азитромицин уменьшает накопление инфильтрующих воспалительных клеток в бронхоальвеолярном лаваже [28]. В фибробластах азитромицин ингибирует пролиферацию и выработку коллагена за счет снижения концентрации трансформирующего фактора роста (TGFβ) и демонстрации легочной антифибротической активности [29, 30]. Азитромицин оказывает мукорегуляторное действие, снижая гиперсекрецию слизи и улучшая мукоцилиарный клиренс [31].

Исследования показали, что азитромицин может изменять гликозилирование АПФ2 и тем самым предотвращать проникновение вируса SARS-CoV-2 внутрь клетки. Другой предполагаемый механизм противовирусного действия — молекулярная мимикрия азитромицина и клеточного гангликозида GM1 (липидный ганглиозид, действующий как кофактор прикрепления вируса к клетке-хозяину для респираторных вирусов). Азитромицин способен связываться с гангликозидсвязывающим доменом S-белка, таким образом блокируя взаимодействие S-белок-GM1 на плазматической мембране хозяина [32].

Еще один механизм действия азитромицина — непрямое блокирование фуриновой системы, способствующей проникновению вируса в клетку после связывания S1-ACE2. Фуриновая система активируется в кислой среде трансотдела аппарата Гольджи и отделяет S1-субъединицу S-белка. Предполагается, что азитромицин снижает активность фуринов путем повышения внутриорганельного рН [33]. Кроме того, азитромицин может подщелачивать везикулы, содержащие вирионы SARS-CoV-2, что предотвращает рН-зависимое слияние мембран.

Третье кандидатное средство против SARS-CoV-2 — противомалярийный иммуномодулирующий препарат артемизинин, который на ряду с хлорохином и хинином имеет долгую историю клинического применения и обладает противовирусным потенциалом широкого спектра действия. Показано, что противомалярийный препарат с иммуномодулирующей активностью хлорохин, которому уже несколько десятилетий, и его производное гидроксихлорохин могут эффективно ингибировать SARS-CoV-2 in vitro [34, 35].

Помимо роли в борьбе с малярией, артемизинин изучали на предмет его потенциального влияния на иммунные реакции при физиологических и патологических состояниях [36–38]. Многие бактерии и вирусы, в том числе SARS-CoV-2, активируют сигнальный путь NF-κB в клетках человека. Активация передачи сигналов NF-κB приводит к последующей активации факторов транскрипции p50/p65. Артемизинин и артесунат могут действовать как ингибиторы сигнального пути NF-κB, блокируя функцию p50/p65. Исследования показывают, что артемизинин может воздействовать на клеточную поверхность путем ингибирования связывания S-белка SARS-CoV-2 с рецепторами клеточной поверхности, что потенциально предотвращает как эндоцитоз вируса, так и активацию передачи сигналов NF-κB. Таким образом, артемизинин может предотвращать цитокиновый шторм путем ингибирования IκB-киназы [39–41]. Однако исследования молекулярной стыковки показывают, что артемизинины могут также связываться с белками коронавируса, такими как Е-белок, белок геликазы, N-белок, белок 3CL PRO, S-белок, неструктурный белок 3 (nsp3), nsp10, nsp14, nsp15, катепсин-L, и GRP78 [42, 43]. Соответственно, часть биологической активности артемизинина может быть частично основана на ингибировании функции этих вирусных белков.

Частичное ингибирование инфекции, вызванной SARS-CoV-2 in vitro, лактоферрином, артемизинином и азитромицином, позволяет предположить, что потенциальной блокировки проникновения вирионов в клетки, опосредованной каждым из этих веществ в отдельности, недостаточно для полного ингибирования инфекции SARSCoV-2. Комбинированный же прием данных препаратов может оказаться более перспективным в клинической практике. Поэтому поиск и создание новых препаратов, эффективных в отношении новой коронавирусной инфекции продолжается, и актуальность этих исследований не вызывает сомнений. Первым этапом такого поиска является изучение их противовирусной активности в культуре клеток.

Целью настоящей работы было исследование цитотоксичности и противовирусной активности смеси активных действующих веществ — лактоферрина, артемизинина и азитромицина — в отношении коронавируса SARS-CoV-2 в сравнении с гидроксихлорохином, поскольку ограничением многих проведенных исследований in vitro было отсутствие использования препаратов сравнения для оценки противовирусной эффективности.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы и клетки

В опытах использовали перевиваемую культуру клеток эпителия почки африканской зеленой мартышки Vero CCL81 (ATСС) из коллекции ФГБНУ НИИВС им. И. И. Мечникова и лабораторный штамм коронавируса SARS-CoV-2 «Дубровка» (идентификационный № GenBank: MW161041.1), выделенный на культуре клеток Vero CCL81 из назофарингеального мазка больного СOVID-19. Культивирование вируса проводили при 37 °С в питательной среде ДМЕМ с глутамином и глюкозой 4,5 г/л и 5% фетальной бычьей сыворотки (ФСБ), L-глутамином (300 мкг/мл), гентамицином (40 мкг/мл) в атмосфере 5% СО₂ (культуральная среда, КС). Штамм прошел 20 последовательных пассажей и вызывал выраженное цитопатическое действие вируса (ЦПД). Образцы вирусного материала для проведения работы хранили при температуре –80 °С в виде аликвот. Во всех экспериментах были использованы аликвоты из одного стока.

Приготовление смеси препаратов

К 45 мг азитромицина добавили 10 мл ДМСО для получения раствора с концентрацией 6 мкмоль/мл. К 10 мг лактоферрина добавили 0,5 мл фосфатного буфера для получения раствора с концентрацией 20 мг/мл. К 21 мг артемизинина добавили 5 мл ДМСО для получения раствора с концентрацией 15 мкмоль/мл. Для приготовления рабочего раствора смешали 5 мкл раствора азитромицина, 125 мкл раствора лактоферрина и 50 мкл раствора артемизинина, объем довели культуральной средой до 5 мл.

Концентрированный раствор контрольного препарата гидроксихлорохина готовили из лекарственной формы (таблетка), растворяя ее в стерильной дистиллированной воде отдельно для каждого опыта непосредственно в день использования в эквимолярных количествах, соответствующих количеству чистого вещества в препарате. Все соединения, а также гидроксихлорохин взвешивали с точностью до 0,1 мг на аналитических весах.

Определение цитотоксического действия препаратов в культуре клеток

Клетки рассаживали в 96-луночных планшетах фирмы «Corning» со средней плотностью 20 000 клеток на лунку и выращивали в питательной среде ДМЕМ с глутамином и глюкозой 4,5 г/л и 5% фетальной бычьей сыворотки (ФСБ), L-глутамином (300 мкг/мл), гентамицином (40 мкг/мл) в атмосфере 5% СО₂ (КС) в течение трех суток до полного монослоя. Затем среду удаляли и в планшеты вносили по 100 мкл испытуемых препаратов в соответствующей среде без сыворотки (рабочая среда, РС) в указанных концентрациях (по восемь концентраций). Затем в каждую лунку планшета добавляли по 100 мкл РС. Каждая точка эксперимента была поставлена в четырех повторностях (n = 4). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, содержащие 200 мкл питательной среды РС. Для определения цитотоксической дозы 50 (ЦТД₅₀) планшеты инкубировали 72 ч при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. Поскольку при определении противовирусной активности инкубация клеток с препаратами проводится в течение пяти дней, для исключения эффекта токсического влияния изучаемых образцов в течение этого времени в другой серии экспериментов определение цитотоксичности проводили при таком же времени инкубации, как и при определении противовирусной активности (пять суток). Оценку цитотоксического действия препаратов учитывали визуально по состоянию клеточного монослоя и в количественном тесте МТТ. Для этого в каждую лунку добавляли по 160 мкл среды DMEM без фенолового красного, а также 40 мкл раствора тетразолиевого красителя МТТ с концентрацией 5 мг/мл и инкубировали 2 ч при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. Далее культуральную жидкость удаляли и в лунки вносили по 100 мкл ДМСО с последующей инкубацией в течение 20 мин при комнатной температуре и постоянном покачивании на шейкере. С помощью планшетного спектрофотометра определяли оптическую плотность каждой лунки при 530 нм с учетом фоновых значений при 620 нм. Максимальную концентрацию препарата, не изменяющую значение ОП более чем на 10–15% по сравнению с контролем клеток, принимали за максимально переносимую концентрацию (МПК). Концентрацию субстанций, уменьшающую значение ОП на 50% по сравнению с контролем клеток, принимали за ЦТД₅₀.

Изучение противовирусной активности препаратов в отношении вируса SARS-CoV-2 по эффекту ЦПД с использованием МТТ

Для изучения противовирусной активности образцов культуру клеток Vero CCL81 рассаживали в 96-луночные планшеты для культивирования клеток с плоским дном (20 000 клеток/лунка) и выращивали в соответствующей КС. На третьи сутки после достижения полного монослоя из лунок планшета удаляли РС с последующим внесением 100 мкл исследуемых препаратов неразведенных или в указанных разведениях на РС (семь концентраций). Часть лунок использовали для контроля вируса и клеток. Каждая точка эксперимента была поставлена в четырех повторностях (n = 4). Параллельно для исключения цитотоксического эффекта препаратов в опытах по противовирусной активности к незараженным лункам были добавлены препараты в таких же условиях и при тех же концентрациях. После инкубации в течение 2 ч во все лунки, за исключением лунок клеточного контроля, вносили вирус в дозе 20 или 100 MOI (в 100 мкл) и клетки инкубировали в течение 5 суток при 37 °C в атмосфере 5% CO₂ до появления четкого ЦПД в клетках вирусного контроля. Учет результата проявления ЦПД в клетках проводили с использованием количественного теста МТТ, как описано ранее. Вычисление ИК₅₀ учитывали в программе Excel по формуле:

формула

Значимым для проявления противовирусной активности считали ингибирование вирусной репродукции 30% и более. Концентрацию препарата, уменьшающую значение величины ОП на 50% принимали за ИК₅₀.

В качестве препарата сравнения использовали лекарственную форму гидроксихлорохина, для исследования была выбрана концентрация 10 мкг/мл, соответствующая его ИК₅₀ [34, 44].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение цитотоксического действия образцов в культуре клеток Vero ССL81

В первой серии опытов была изучена цитотоксичность различных разведений тестируемых препаратов. Использовали линию клеток Vero ССL81, в которой в дальнейшем определяли противовирусную активность. После инкубации в течение 72 ч визуальная оценка при помощи инвертированного микроскопа показала, что в клеточных контролях не было отмечено цитотоксических и морфологических изменений, а также нарушений клеточного монослоя. В экспериментальных лунках при части концентраций соединений было отмечено частичное разрушение монослоя, клетки были более округлые и морфологически отличались от клеточного контроля, в части лунок наблюдалось полное разрушение клеточного монослоя. Проведенные исследования с использованием более точного количественного метода с окрашиванием клеток МТТ подтвердили данные, полученные при визуальном изучении состояния клеток. На основании полученных данных определения цитотоксического действия смеси в культуре клеток с использованием метода окрашивания красителем МТТ построены кривые доза-ответ (рис. 1), из которых выведены значения МПК и ЦТД₅₀, составляющие 1 : 500 и менее 1 : 2 для трехдневной инкубации и 1 : 50 и менее 1 : 2 для пятидневной инкубации соответственно. Поскольку метод с использованием МТТ применяют и для определения противовирусной активности, при инкубации в течение пяти суток для исключения эффекта цитотоксичности смеси для контроля к клеткам были добавлены такие же разведения образцов в таком же объеме и при таком же времени инкубации, как и в методе определения противовирусной активности при отсутствии инфицирования клеток. 

Противовирусная активность смеси активных действующих веществ в отношении коронавируса SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero ССL81

Изучение противовирусного действия препаратов в культуре клеток Vero CCL81 в отношении коронавируса SARS-CoV-2 было проведено с использованием метода ингибирования ЦПД вируса, выявляемого окрашиванием МТТ. Для заражения клеток использовали две множественности заражения — 100 MOI и 20 MOI. Ингибирование наблюдали при разведении не более чем в 15 раз для обоих вариантов заражения. Полученные данные представлены на рис. 2. Добавление смеси к клеткам значительно (более 30% ингибирования вирусной репродукции) подавляло размножение коронавируса SARS-CoV-2. При этом взятый в качестве препарата сравнения гидроксихлорохин в концентрации 10 мкг/мл ингибировал размножение коронавируса SARS-CoV-2 на 65% (данные не показаны).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Ряд исследований показал, что в дополнение к АПФ2 для инфекции SARS-CoV-2 необходимы другие корецепторы или клеточные молекулы [45]. На данный момент полный их перечень неизвестен. Первичный этап проникновения вируса в клетку часто инициирован низкоаффинным связыванием с сайтами прикрепления, что способствует концентрации вирионов на поверхности клетки. Последующее связывание с высокоаффинным рецептором запускает проникновение в клетку [46, 47]. Исследование задействованных SARS-CoV-2 молекулярных механизмов при инфицировании клеток выявило ряд препаратов, с помощью которых можно ингибировать инфекцию.

Исследуемая смесь на основе артемизинина, азитромицина и лактоферрина малотоксична и значимо ингибирует заражение и репликацию SARS-CoV-2 in vitro. Предполагается, что механизмы его действия опосредованы входящими в состав активными действующими веществами. Связывание с рецепторами проникновения SARS-CoV-2 и ингибирование функций вирусных белков могут лежать в основе профилактики инфицирования клеток SARS-CoV-2, так как влияют на ассоциированные с ними сигнальные системы и пути, включающие NF-κB, PI3K/AKT, различные регуляторные факторы интерферона и продукцию провоспалительных цитокинов [23, 24]. Кроме того, снижение активности фурина азитромицином значительно снижает клеточное инфицирование, при этом азитромицин может подщелачивать везикулы, содержащие вирионы SARS-CoV-2, и предотвращать рН-зависимое слияние мембран.

ВЫВОДЫ

Нами было показано, что смесь активных действующих веществ на основе азитромицина, лактоферрина и артемизинина при инкубации в культуре клеток Vero CCL 81 в течение трех и пяти суток малотоксична. Жизнеспособность клеток при всех разведениях была не нарушена более чем на 10–30%, значения ЦТД₅₀ оценивались ниже, чем минимально возможное для изучения разведение 1 : 2. При высокой (100 MOI) и низкой (20 MOI) множественностях заражения в культуре клеток Vero CCL 81 исследованная смесь оказывала значимый эффект на вирусную репродукцию SARS-CoV-2, ИК50 оценивалась в обоих случаях как разведение 1 : 2.

Таким образом, ИК₅₀ смеси достигается при следующей концентрации действующих веществ: азитромицин — 3 ммоль/л, лактоферрин — 5 мг/л и артемизинин — 7,5 ммоль/л.

Подробные молекулярные механизмы инфицирования клеток вирионами SARS-CoV-2 остаются до конца нераскрытыми, однако комбинированные смеси имеют преимущества за счет синергических эффектов входящих в состав компонентов. Полученные результаты для смеси на основе артемизинина, азитромицина и лактоферрина in vitro демонстрируют, что она представляет собой перспективный действенный адъювантный терапевтический инструмент для лечения и профилактики COVID-19. Теоретические предпосылки и продемонстрированная в настоящем исследовании противовирусная активность смеси артемизинина, азитромицина и лактоферрина побуждают к планированию дальнейших доклинических и клинических исследований, направленных на изучение безопасности, реальной противовирусной активности in vivo против SARS-CoV-2, а также на определение режимов дозирования препарата и его комбинирование с другими противовирусными лекарственными средствами.