В эпоху индустриализации возможны выбросы техногенных производств. Так, при добыче и переработке сероводородсодержащего (H₂S) газа не исключены аварии с воспламенением при разгерметизации оборудования скважин и без горения при распространении газового флюида на объектах. Сегодня необходимо быть готовыми к возникновению газопроявлений, которым способствует, в том числе, и нарушение техники производства, например, превышения скорости разбуривания газонасыщенных пород и так далее [1–6].

В подобных случаях сероводород выступает в роли патогенного фактора: способствует нарушению энергетического обмена и усиливает свободнорадикальные процессы в клетке [7, 8]. Это приводит к повреждению мембран и усугубляет дефицит энергии. Впоследствии, с одной стороны, происходит уменьшение уровня макроэргов и накопление в клетках ионов Са²⁺, а с другой — понижение уровня аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) способствует выключению ионных насосов и препятствует поступлению ионов Са²⁺ из межклеточной среды, активации мембраносвязывающих фосфолипаз, гидролизу части фосфолипидов и усилению проницаемости мембран [9, 10].

Можно полагать, что формирование различных патологических состояний и заболеваний сопряжено с молекулярными изменениями плазматических мембран клеток. Являясь мишенью для H₂S, мембраны вовлекаются в патологический процесс, который активизирует универсальные механизмы повреждения клетки, связанные с усилением процессов свободнорадикального окисления и нарушением ионного гомеостаза [11–13].

В последние годы в связи с активным изучением молекулярных основ развития повреждения мембран клеток возрос интерес к особенностям биологического функционирования фосфолипидов [14, 15]. В биомембранах липидный компонент — это функционально активная матрица, интегрирующая внешние влияния и запускающая программы клеточного управления. Выделяют три класса липидов мембран: нейтральные липиды (30%), гликолипиды (10%) и фосфолипиды — наиболее широко представленный класс (60%). Химическая энергия окисляемых субстратов или АТФ превращается в электрическую энергию, а именно в трансмембранную разность электрических потенциалов или в энергию разности концентраций веществ, содержащихся в разделенных мембраной растворах, и наоборот. Мембраны способны превращать одну форму энергии в другую. Фиксация энзимов в митохондриях и окислительное фосфорилирование, активность ферментов и чувствительность клетки к гормональной, нервной регуляции, а также пространственная идентичность зависят от состояния липидной составляющей мембраны [16–19].

Сложность выявления роли отдельных молекулярных механизмов в реализации мембранодеструктивных процессов обоснована их тесной взаимосвязью. В связи с этим, получение обобщающих положений о совокупных закономерностях реакций клеточных систем на патологические импульсы различного генеза не только обещает увеличение глубины представлений о функционировании общебиологических законов, но и разрешает по-новому оценивать методологию их корректировки.  

Не зная структуры молекулы, нельзя понять ее реальное поведение. Любое бесконечно малое изменение совокупности координат ядер приводит к новой геометрии. Пространственная структура молекулы не является неотъемлемым характерным свойством системы. Тем не менее молекулярная структура позволяет зафиксировать некоторое временное положение молекулы и понять концепцию его изменения. Математическое моделирование дает возможность рассматривать поочередно различные внешние факторы воздействия. Для определения равновесной пространственной структуры молекул необходимо оптимизировать взаимное расположение их атомов. Под оптимизацией геометрии понимают поиск координат атомов, при которых система имеет наименьшее значение энергии [20–22]. В результате оптимизации отдельные группы атомов молекулярной системы меняют свое пространственное положение на более выгодное по отношению к соседним атомам. PM 3 (от англ. parametric method 3) — один из наиболее последовательных методов, тщательно калиброванный по широкому спектру соединений, включая органические и неорганические молекулы атомов главных подгрупп и водородно-связанные системы. Он хорошо передает структуру, термодинамику, дипольные моменты, потенциалы ионизации, колебательные частоты. Для простых органических соединений по точности он приближается к DFT (от англ. density functional theory — теория функционала плотности), превосходя DFT по производительности в десятки раз. Средняя погрешность определения энтальпии образования — около 5 ккал/моль. Преимущество других полуэмпирических методов перед PM3 в основном проявляется при оценке электронных, магнитно-резонансных параметров и спектров электронного возбуждения [21, 22].

С точки зрения химии, межмолекулярный перенос электрона представляет собой окислительновосстановительную реакцию reduction/oxidation, или RedOx. Процессы переноса электронов в мембранах митохондрий составляют физико-химическую основу механизмов запасания энергии в клетке. В настоящее время предполагается, что перенос электронов между компонентами жидкой фазы в клетке и внутриклеточными белками регулирует активность белков клетки. С увеличением уровня окислителей в организме связывают развитие многих заболеваний человека, включая атеросклероз, цирроз печени, катаракту, артриты, ишемическую болезнь сердца, бронхиальную астму, гепатит, диабет. Лауреат Нобелевской премии Альберт Сент-Дьёрдьи писал: «Равновесие между донорами и акцепторами электронов, обладающими различными биопотенциалами, — один из основных параметров жизни...». В ходе редоксреакции восстановленная форма одной редокс-пары (восстановитель) отдает электроны на окисленную форму (окислитель) другой пары [23–25]. Известно, что H₂S — активный участник ионного обмена, способный связывать атомы меди в цитохромоксидазе и тем самым блокировать перенос электронов с этого фермента дыхательной цепи митохондрий на кислород. Так как физиологические жидкости организма — это открытые системы, постоянно обменивающиеся электронами с окружающей средой, мы дискретизировали возможные перекрестные реакции и использовали липосомную модель мембраны в водной среде.

Цель работы — сравнить степень межмолекулярного взаимодействия двухкомпонентных систем с участием липосомной модели биомембраны в реакции с сероводородом и ацетилцистеином для коррекции мембранного Red-Ox-потенциала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Математические расчеты производили в программе GAMESS с использованием метода PM3 (GBASIS=PM3) с точностью нормы градиента до четвертого знака после запятой включительно (OPTTOL=1.0E-4). Полученные результаты помогли составить z-матрицу. Z-матрица имеет конфигурацию, довольно близкую к точке глобального минимума поверхности потенциальной энергии. Значение градиента, полученное в результате расчета, составляет 0,0000327 ккал/моль/ангстрем, что характеризуется довольно высокими вычислительными возможностями GAMESS по сравнению c ChemOffice. Значение полной энергии (total energy) получаемой конфигурации молекул вычисляют в атомных единицах энергии и выражают в кДж/моль.

Для увеличения точности моделирования адсорбционных взаимодействий мы применяем три критерия: величину переноса заряда (Δq), расстояние между атомами (Å) и тепловые эффекты адсорбционных комплексов (ΔEадс).

В качестве компонентов клеточной мембраны были выбраны белковый и фосфолипидный. Структуру белка определили в форме простого пентапептида, полученного в результате расчета оптимального равновесного расположения системы с точки зрения минимума общей атомарной энергии. Учитывая, что молекулы фосфолипидов способны к перемещению с одной стороны мембраны на другую, модель in vitro исключает варьирование биологического ответа на воздействие патогенных факторов и минимизирует асимметрию фосфолипидов в мембране. В качестве основы липосом мы использовали лецитин, состоящий на две трети из фосфолипидов.

Липосомы формировали по следующей методике.

Готовили сульфидный раствор в пределах первой стадии гидролиза в соответствии с молекулярным уравнением:

Na₂S + HOH <=> NaHS + NaOH,

а полное ионное уравнение данной реакции выглядит следующим образом:

2Na⁺ + S^2– + HOH <=> Na⁺ + HS^‒ + Na⁺ + OH^–.

До образования летучих форм сероводорода согласно второй стадии гидролиза реакции не доводили, ввиду токсичности последнего и специфик-дозирования в данном эксперименте.

В работе использовали весы (Conzept; Италия) с точностью взвешивания 0,1 мг,   измеритель окислительновосстановительного потенциала (Red-Ox-потенциала в милливольтах, или ОВП, мВ) (Россия), магнитную мешалку, химические стаканы и цилиндр (градуированные, объемом 100 мл), пипетки, автоматические дозаторы, ультразвуковой диспергатор (Китай), порошкообразный сульфид натрия, вытяжной шкаф.

Готовили раствор сульфида натрия (10%-й) с концентрацией по сульфидам 88 мг/л. Смешивали 12 г Na₂S (вводили в воду) с 80 мл дистиллированной воды. Экспозицию определили с учетом достижения устойчивого изменения значения параметра на неизменном уровне. Три раза производили замеры и представили средние значения.

Липосомный раствор готовили из соевого лецитина (Protein company; Россия) на основе изопропанола в соотношении 30 : 70. После добавления 0,1%-го раствора метиленового синего (для лучшей визуализации) производили ультразвуковую (УЗ) обработку 10 мин и добавляли к сульфидному раствору липосомный раствор (1 : 1). К насыщенному раствору лецитина (1 г + 25 мл изопропанола) добавляли 10 мл раствора АЦЦ (10 мг/мл), после чего производили УЗ-воздействие. ОВП замеряли в растворах липосом с лецитином и АЦЦ до и после погружения в сульфидную среду на 15-й минуте с момента приготовления сред.

Тип распределения, отличный от нормального, определяли с помощью критериев Колмогорова– Смирнова и Шапиро–Уилка. Цифровые значения представлены в виде медианы и P5-, P95-процентилей. Уровень значимости различий признаков был принят за р ≤ 0,05. Анализ производили с помощью дискриптивных статистических методик программы Statistica 11,0 (StatSoft; США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Моделирование процесса влияния сероводорода на биологическую мембрану включает в себя создание математической модели и наглядной структуры элементов мембраны и токсиканта. Планируется поиск участков молекулы сорбата, взаимодействие с которыми приводит к выделению наибольшего количества энергии. Активированный комплекс должен обладать минимальной энергией. Согласно приведенным структурам, взаимодействие происходит преимущественно по аминогруппе (NH₂), сульфидной (SH), карбонильной (CO), гидроксильной (OH) и метильной (СН₃) группам, а также с участием атомов водорода бензольного кольца. При этом сероводород может связываться как посредством водорода по амино- и сульфидным группам, так и при участии серы — по амино-, сульфидным и гидроксильным группам. Наиболее прочные связи образуются при участии атома водорода SH-группы белка.

В таблицах представлены результаты расчета энергетических и геометрических свойств наиболее значимых молекулярных адсорбционных комплексов (АК) с пентапептидом (табл. 1) и лецитином (табл. 2). Была рассмотрена следующая последовательность аминокислот в пептиде белка: цистеин–фенилаланин–аланин–цистеин– тирозин.

В таблицах представлены активные позиции образования водородной связи при  воздействии АЦЦ и сероводорода на компоненты мембраны клетки. Перераспределение заряда указывает на протекание взаимодействия, а величина переноса заряда — на направление перемещения электронной плотности между атомами взаимодействующих веществ. Знак величины заряда указан по отношению к воздействующей молекуле на мембрану (Н₂S или АЦЦ). В случае положительного значения заряд перераспределяется от водорода вещества к более электроотрицательным атомам мембраны (рис. 1). Отрицательное значение указывает на направление движения электронов от водорода мембраны к «насаживаемым» веществам. Наиболее прочные взаимодействия наблюдаются у H₃₅...S₇ группы лецитина и АЦЦ, в отличие от водородных связей молекул белка и АЦЦ (рис. 2). Участие протона SH-группы АЦЦ в образовании водородной связи приводит к увеличению электронной плотности у атома серы и, следовательно, к возрастанию ее нуклеофильных свойств. Свойства АЦЦ обусловлены наличием активной SH-группы в его молекуле. Длина образующейся связи наиболее характерна для данного типа взаимодействия. А величина энергии адсорбции указывает на прочность адсорбционных комплексов. Лецитин в данном случае — предпочтительная мишень (рис. 3).

Любое изменение координат межатомного расположения влияет на геометрию молекулы в целом, а значит и на свойства системы, но структурированный расчет позволяет зафиксировать временную позицию молекулы и понять принцип изменений в зависимости от воздействия внешних факторов. Это облегчает установление отдельных геометрических положений молекул относительно друг друга, выявить специфику воздействия атакующего вещества, построить карту активных атомов мембранных компонентов, проанализировать и показать конкурентную заменяемость противоядия.

Как видно, взаимодействия сероводорода и АЦЦ имеют более низкую глубину значения минимума энергии адсорбции в случае реакции с лецитином, чем с пептидом. Значит, характеризуем подобные взаимодействия как структуры, имеющие энергетически более устойчивые положения. Поэтому в качестве модели in vitro выбран липидный компонент мембраны и сформированы липосомы, диаметром 36,92 [27,98; 54,39] мкм (рис. 4).

ОВП сульфидного раствора составил –718 [699; 723] мВ. Данное значение крайне низкое, что говорит о сильной восстановительной природе сероводородных ионов. Redox-потенциал насыщенного лецитинового раствора составил –77 [–72; –81] мВ. После УЗ-обработки и получения липосомного раствора с АЦЦ ОВП составил –54 [–41; –59] мВ. ОВП конечного раствора сульфидов + +лецитин + АЦЦ увеличился до –122 [–120; –131] мВ. 

Таким образом, Redox-потенциал восстановился после добавления липосом с АЦЦ, выступающим в роли окислителя. Следовательно, при взаимодействии с сероводородными ионами активные SH-группы АЦЦ придают раствору буферные свойства.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В настоящее время ведутся исследования моделей систем молекулярных комплексов с использованием квантовохимических вычислений. Работы ученых представляют собой моделирование комплексов, предварительно описанных вручную, состоящих из двух и более молекул. Так, была предложена модель взаимодействия в трехкомпонентной системе «нефть – вода – деэмульгатор» [26]. Включение воды как одного из компонентов молекулярной системы может быть оправдано только для подробного изучения процесса деэмульсации на конкретном случае рандомно заданной пользователем возможности. Альтернативой данному подходу является учет сольватации [27], заложенной в любую квантовохимическую программу, например Gamess. Работы в данной области точечно специфичные и в основном специализируются на определении трехмерной структуры молекул, распределении заряда и электронной плотности каждого атома в молекуле, полной энергии молекул, энергий и теплоты образования молекул, энергий электронов, энергий ядер и дипольных моментов атомов, из которых состоит молекула [28, 29].

Проведенное исследование ориентировано на систематический перебор возможных адсорбционных комплексов при образовании водородной связи между молекулами. Это позволило последовательно рассмотреть процесс погружения компонентов мембраны в сероводородную среду, а затем оценить результат введения препарата АЦЦ в качестве конкурентного

для сероводорода. С помощью квантово-химического моделирования определены основные значения энергии образования реагирующих молекул и их систем. Для установления устойчивого положения адсорбционных комплексов для каждого из них были дополнительно определены и рассчитаны три критерия: энергия адсорбции, величина переноса заряда с одной молекулы на другую и размер образовавшейся водородной связи. После устранения структур, не удовлетворяющих критериям, получены сигнатуры активных атомов молекулярной поверхности для данного рода взаимодействий [21].

Липосомы готовили, используя общепризнанные методики [16–18]. В качестве растворителя применяли изопропиловый спирт, как менее токсичный (3600–5740 мг/кг) по сравнению с другими органическими растворителями (ксилолом, хлороформом) [30] и более экономически выгодный, по сравнению, например, с этиловым спиртом. Вместо роторного испарителя спиртового компонента использовали поток газообразного азота, что значительно упростило эксперимент.

ВЫВОДЫ

В целом, предложенный in silico метод математического моделирования действия блокаторов токсического влияния на модель мембраны клетки может быть использован для дополнения in vitro экспериментов. Наши результаты позволяют подробно описать механизм, протекающий на поверхности мембраны клетки. Дальнейшие исследования помогут улучшить понимание структуры и  свойств потенциальных антидотов для ряда веществ, обладающих цитотоксическими свойствами. Наши данные свидетельствуют о том, что реакционные центры для данного вида взаимодействий возможны и образуются преимущественно на атомах, представленных на сигнатурах взаимодействий (рис. 1–рис. 3). Изученное взаимодействие между молекулярными компонентами биомембран — белка и фосфолипида с одной стороны и с «насаживаемыми» на них молекулами сероводорода и АЦЦ — с другой является хорошей отправной точкой для дальнейших исследований процессов, протекающих на поверхности клеточной мембраны. Таким образом, можно утверждать, что наиболее предпочтительной мишенью для экспериментального исследования компонента мембраны является лецитин. Согласно расчетам энергий взаимодействия сорбционных комплексов и окислительно-восстановительного потенциала систем, наиболее оптимально соединение у лецитина с АЦЦ, чем с сероводородом. Окислительная обстановка, формируемая при добавлении липосом с АЦЦ в сульфидный раствор, говорит о энергетически выгодном взаимодействии лецитина с АЦЦ, нежели с сульфидными ионами. Конкурентоспособные водородные связи между фосфолипидом и АЦЦ на фоне сероводорода дают основания для дальнейших экспериментов. Так, моделирование липосом в растворе плазмы позволит приблизиться к изучению взаимодействия молекул АЦЦ и сероводорода на более сложном органном уровне организации биосистем.