Разработка подходов к оценке индивидуальной радиочувствительности остается актуальным направлением радиационной биологии человека в связи с интенсивным развитием атомных технологий, технологий ядерной медицины, перспективами длительных межпланетных космических полетов [1, 2]. Оценка персонифицированной реакции на облучение необходима для выявления групп повышенного риска в отношении эффектов облучения, что целесообразно как при отборе персонала для работ с источниками ионизирующего излучения, космонавтов, так и для персонификации радиационного риска медицинских эффектов облучения человека.

Явление радиочувствительности исследователи рассматривают на разных уровнях, от радиочувствительности целого организма, проявляющейся в выживаемости или гибели после облучения, до радиочувствительности тканей и клеток и их склонности к развитию неблагоприятных отдаленных последствий облучения [1–3]. При этом нет единой системы определения индивидуальной радиочувствительности человека. Идут интенсивные исследования по изучению молекулярногенетических, иммунологических, гематологических и других маркеров — персонализированных предикторов тканевых реакций и отдаленных последствий как острого, так и хронического радиационного воздействия [1, 2, 4, 5].

Красный костный мозг является одной из наиболее радиочувствительных тканей организма человека. Устойчивость костного мозга к облучению определяется репарацией повреждений ДНК, репопуляцией клеток ткани за счет выживших пролиферирующих клеток, способностью ткани формировать функциональный резерв клеток и др. [1]. Для костномозговой формы острого лучевого синдрома последствия для организма (вероятность гибели) существенным образом обусловлены выживаемостью гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) и кинетикой выживших клеточных популяций [6, 7]. Ионизирующее излучение оказывает подавляющее воздействие на пролиферативный и восстановительный потенциал ГСК. При этом не решен вопрос о связи реакции ГСК на облучение с индивидуальной радиочувствительностью.

Для оценки персонифицированной реакции ГСК человека на ионизирующее излучение перспективно применение гуманизированных мышей [8, 9]. На модели гуманизированных путем пересадки ГСК человека мышей описаны такие реакции ГСК на облучение, как увеличение фокусов γH2AX, увеличение экспрессии гена p16INK4a, потеря способности ГСК к репопуляции после пересадки вторичным реципиентам и сокращение репертуара дифференцировки [10]. Схожие процессы характерны для естественного старения ГСК [11–13], а также отмечаются при внешнем облучении человека и животных [14], в частности отмечается явление клональной экспансии гемопоэтических клеток у облученных животных [15], у астронавтов, получивших повышенное облучение в ходе космических полетов [16].

Вышесказанное определяет актуальность и обоснованность постановки такой задачи, как разработка способов оценки персонифицированной реакции ГСК на облучение и ее связи с радиочувствительностью.

Цель исследования — разработать технологию оценки персонифицированной реакции ГСК человека на облучение на основе их ксенотрансплантации иммунодефицитным мышам для определения радиочувствительности с точки зрения тканевых реакций системы кроветворения на острое облучение.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для получения гуманизированных мышей использовали иммунодефицитных мышей линии NOD SCID (питомник SPF-вивария ИЦиГ СО РАН; Новосибирск, Россия). Животных содержали в SPF-условиях при температуре воздуха 22 ± 2 °С и влажности 50–60% на гранулированном автоклавируемом корме SPF-категории для мышей категории «разведение», без ограничения подачи корма и питьевой воды, при 12-часовом световом дне. Для выведения из эксперимента применяли метод дислокации шейных позвонков.

Животным вводили ГСК из периферической и пуповинной крови [17]. ГСК получали из проб пуповинной крови, отобранных в ГБУЗ Областной перинатальный центр, а также из продукта периферической донорской крови — лейкотромбослоя (ГБУЗ Станция переливания крови ФМБА России; Челябинск, Россия). ГСК выделяли из крови методом иннумомагнитной сепарации с помощью набора EasySep Human Cord Blood CD34 Positive Selection Kit II (Stem Cell Technologies; Канада). ГСК идентифицировали как CD45_lowCD34⁺-клетки.

Мышам осуществляли инъекцию ГСК пуповинной крови внутривенно в боковую хвостовую вену после предварительного острого внешнего гамма-облучения в дозе 2,5 Гр. В течение девяти недель происходило приживление ГСК в костном мозге мыши и формирование человеческого лимфогранулопоэза. ГСК, полученные от каждого донора пуповинной крови, вводили в равном количестве не менее чем трем мышам (число вводимых ГСК составляло 30–200 тыс. клеток на каждое животное). Одна мышь оставалась контрольной, а двух других вновь облучали через девять недель после трансплантации ГСК в дозах 0,5, 1,0 и 1,5 Гр (по три донора ГСК на каждую дозу). Измеряли число клеток человека и мыши в костном мозге бедренной кости контрольной мыши и у мышей через трое суток и 14 суток после облучения.

ГСК, полученные из периферической крови, вводили внутрикостно в большую берцовую кость мышам после изофлуранового наркоза. ГСК, полученные от каждого донора периферической крови, вводили в равном количестве не менее чем четырем мышам (число вводимых ГСК составляло 30–115 тыс. клеток на каждое животное). При этом двух особей, получивших клетки от одного донора, облучали до введения ГСК (клетки человека необлученные), а двух мышей, получивших клетки от того же донора, облучали после введения ГСК (человеческие клетки облучены). Облучение проводили в тех же дозах — 0,5, 1,0 и 1,5 Гр (по три донора на каждую дозу). Измеряли содержание клеток человека и мыши через трое суток и 14 суток после облучения (для каждого срока — одна мышь с необлученными ГСК человека и одна — с получившими облучение клетками).

Облучение проводили на исследовательской радиобиологической гамма-установке ИГУР-1М («Квант»; Россия). Установка оснащена ¹³⁷Cs-источниками, мощность дозы составляет 0,91 Гр/мин, неравномерность гамма-поля не более 10%.

Методом проточной цитометрии в костном мозге мышей измеряли число мышиных CD45⁺-клеток (окраска моноклональными крысиными антителами антиCD45-PE, клон 30-F11; BD Pharmingen, США), человеческих лейкоцитарных CD45⁺-клеток (окраска моноклональными мышиными антителами антиCD45-FITC, клон HI30; Stem Cell Technologies, Канада) и человеческих стволовых CD45^lowCD34⁺-клеток (окраска моноклональными мышиными антителами антиCD34-APC, клон 581; Stem Cell

Technologies, Канада). Измерения проводили на цитометре Accuri C6 (BD Biosciences; США), рассчитывали число клеток в миллилитрах суспензии, содержащей клетки из одной кости.

Рассчитывали выживаемость облученных клеток как отношение числа облученных клеток через трое и 14 суток к числу клеток того же донора у контрольной необлученной мыши для ГСК пуповинной крови, как отношение числа облученных клеток к числу необлученных клеток того же донора в тот же срок после облучения для ГСК периферической крови. Рассчитывали процентное содержание ГСК от общего количества всех CD45^low/ CD45⁺-клеток человека для каждого гуманизированного животного. Также определяли коэффициент, равный отношению доли ГСК на 14-е сутки после облучения к доле ГСК на третьи сутки после облучения (К14/3), так как ранее этот показатель продемонстрировал связь с выживаемостью животных и репопуляцией клеток в костном мозге у негуманизированных мышей in vivo [18].

Для оценки прогностических свойств коэффициента К_14/3 с целью определения персонифицированной реакции ГСК человека на радиационное воздействие и связь этого показателя с радиочувствительностью проводили два эксперимента. В первом эксперименте измеряли коэффициент К14/3 для доли стволовых кроветворных CD117⁺-клеток мышей после облучения в дозе 1 Гр у животных двух линий, отличающихся радиочувствительностью: радиочувствительной линии NOD SCID (ЛД_50/30 = 3,5 Гр) и относительно радиорезистентной линии C57Bl/6 (ЛД_50/30 = 6,0 Гр) [18].

Во втором эксперименте ГСК, полученные от трех доноров пуповинной крови, использовали для гуманизации не трех, а пяти гуманизированных мышей. Этим трем дополнительным гуманизированным особям за 30 мин до облучения водили внутрибрюшинно препарат с известным радиозащитным действием — 2-меркаптоэтиламин (цистеамин) в дозе 200 мг/кг массы тела (Serva; США). Животных от двух доноров облучали в дозе 0,5 Гр, а от третьего донора — в дозе 1 Гр. Сравнивали коэффициент К14/3 у гуманизированных мышей без цистеамина и у мышей с повышенной за счет цистеамина радиорезистентностью.

Для исследуемых показателей рассчитывали среднее значение и стандартную ошибку. Проводили регрессионный анализ для выявления зависимости исследуемых показателей от дозы с помощью программного пакета Microsoft Office Exсel (Microsoft; США). Коэффициенты уравнений в моделях регрессии сравнивали с помощью t-критерия Стьюдента. Результаты принимали статистически значимыми при вероятности нулевой гипотезы (p < 0,05).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

При введении ГСК пуповинной крови мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD SCID) клетки человека заселяют костный мозг мышей и формируют у них пул самоподдерживающихся стволовых гемопоэтических клеток, а также пул созревающих клеток преимущественно лимфогранулоцитарного ряда [17, 19]. Такая модель позволяет изучать радиационно-индуцированную гибель и репопуляцию стволовых клеток человека и их потенциал к поддержанию пула созревающих клеток человека in vivo в модели гуманизированных животных.

В наших экспериментах было выявлено, что облучение гуманизированных мышей приводит к дозозависимому снижению выживаемости CD45^lowCD34⁺-клеток человека через трое суток после облучения (рис. 1А), зависимость от дозы имеет экспоненциальный характер (R² = 0,67; F = 38,65; p < 0,001).

На 14-е сутки после облучения число ГСК у облученных мышей увеличивалось и могло у разных доноров превышать исходный контрольный уровень без облучения или не достигать его (рис. 1Б). Статистически значимой зависимости от дозы для снижения числа ГСК на 14-е сутки после облучения в зависимости от дозы облучения получено не было (R² = 0,34; F = 4,01; p = 0,079 для линейной зависимости).

После облучения снизилась доля стволовых клеток среди всех клеток человека в костном мозге гуманизированных мышей по сравнению с исходным уровнем 25 ± 8%. Линейную зависимость от дозы в диапазоне 0,5–1,5 Гр имел коэффициент К14/3, равный отношению доли стволовых клеток на 14-е сутки после облучения к доле стволовых клеток на третьи сутки после облучения (рис. 2). С увеличением дозы этот показатель снижался (R² = 0,57; F = 13,26; p = 0,004). Данный показатель отражает выживаемость стволовых клеток, их восстановление через 14 суток после облучения и их возможность продуцировать дифференцирующиеся клетки.

В эксперименте с применением радиозащитного препарата цистеамина было показано, что у защищенных с помощью радиопротектора гуманизированных мышей коэффициент К14/3 был выше, чем у незащищенных, облученных в той же дозе (рис. 3). Таким образом, повышение коэффициента свидетельствует о более высокой радиорезистентности.

Аналогичная закономерность выявлена при сравнении коэффициента К14/3 у мышей разных линий, различающихся по радиочувствительности (рис. 4). Так, у радиочувствительных мышей NOD SCID (ЛД_50/30 = 3,5 Гр, 95%-й ДИ — 3,4–3,8 Гр) К14/3 при облучении в дозе 1 Гр составил 0,23 ± 0,06, что статистически значимо (t = 3,9; p = 0,003) отличалось от значения показателя К14/3 (0,98 ± 0,18) у мышей C57Bl/6 с нормальной радиочувствительностью (ЛД_50/30 = 6,0 Гр, 95%-й ДИ — 5,8–6,2 Гр), что подтверждает способность коэффициента отражать различия реакции гемопоэза у мышей с разной радиочувствительностью in vivo.

При введении ГСК периферической крови взрослых людей ГСК не способны длительно функционировать в костном мозге мышей, но способны сохранять свой пул и продуцировать созревающие клетки не менее 14 суток [17]. При этом так же, как и в модели гуманизированных ГСК пуповинной крови мышей, выявляется экспоненциальная зависимость выживаемости ГСК человека от дозы внешнего гамма-облучения на третьи сутки после облучения (R² = 0,93; F = 211; p < 0,001; рис. 5А).

На 14-е сутки после облучения число ГСК увеличивалось и превышало контрольный уровень без облучения при облучении в дозе 0,5 Гр; при облучении в дозах 1,0 и 1,5 Гр число клеток оставалось сниженным по сравнению с числом ГСК на 14-е сутки без облучения (рис. 5Б). Описана модель линейной зависимости от дозы количества ГСК по отношению к необлученному контролю через 14 суток после облучения (R² = 0,65; F = 12,90; p = 0,009).

Важно отметить, что модели, описывающие зависимость выживаемости клеток от дозы, полученные для ГСК пуповинной и периферической крови, не различались: нет статистически значимых различий при сравнении коэффициентов (t = 1,18; p = 0,24) и свободного члена (t = 0,15; p = 0,88) в уравнениях зависимости выживаемости ГСК от дозы на третьи сутки после облучения; при сравнении угла наклона (t = 0,19; p = 0,85) и свободного члена (t = 0,34; p = 0,74) в уравнениях зависимости относительного числа клеток от дозы на 14-е сутки после облучения.

Коэффициент К14/3 в краткосрочной модели гуманизации мышей ГСК периферической крови также, как и в модели гуманизированных ГСК пуповинной крови мышей, зависел от дозы (R² = 0,45; F = 5,67; p = 0,048) и отражал индивидуальные особенности ГСК доноров (рис. 6).

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Оценка индивидуальной радиочувствительности как с точки зрения тяжести ранних тканевых реакций, так и с точки зрения риска развития отдаленных последствий облучения необходима для выявления групп повышенного риска в отношении неблагоприятных эффектов облучения (в случае повышенной радиочувствительности) и подбора персонала (лица с повышенной радиорезистентностью).

Индивидуальные реакции на облучение могут быть измерены на разных уровнях организации организма на основе оценки различных конечных эффектов облучения, включая гибель организма, рак, нераковые заболевания, тканевые реакции после облучения, хромосомные повреждения и молекулярные изменения [2, 3]. Не во всех работах удается выявить связь между молекулярными и клеточными реакциями in vitro и тяжестью тканевых реакций на острое облучение [4, 20, 21].

Хорошим предиктором радиочувствительности, повидимому, можно считать клоногенное выживание клеток [4]. Для оценки радиочувствительности кроветворной

системы в качестве репрезентативной модели можно рассматривать ГСК. Перспективным методом оценки персонифицированной реакции ГСК может оказаться получение гуманизированных мышей [8, 9], которые могут быть рассмотрены как «аватары», отражающие весь комплекс особенностей реакции клеток, свойственных донору клеток. Такой подход разрабатывается в рамках внедрения персонализированной медицины для лечения онкологических пациентов, изучения индивидуальных иммунологических особенностей [22–25].

При трансплантации ГСК человека предварительно облученным в сублетальной дозе мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом человеческие клетки способны занимать опустевшие после облучения ниши в костном мозге животных и длительное время (2–12 месяцев после введения) существовать в организме мыши. При этом ГСК как поддерживают свой пул мультипотентных стволовых клеток, так и дают начало зрелым функционально активным клеткам крови, главным образом миелоидного ростка кроветворения.

Мыши, гуманизированные введением ГСК пуповинной крови, пригодны для моделирования острого радиационного синдрома, так как дают возможность оценить влияние облучения на гибель и последующую репопуляцию и функциональную активность ГСК. В настоящей работе показана зависимость от дозы при облучении в дозах от 0,5 до 1,5 Гр выживаемости ГСК в короткие сроки после облучения (через трое суток) и количества ГСК через 14 суток после облучения, в период восстановления их численности.

Предложенный авторами коэффициент К14/3, характеризующий изменение доли ГСК относительно других CD45^low/⁺-клеток человека за 14 суток после облучения, рассматривается как интегральный показатель, отражающий гибель и последующее восстановление, функциональную активность ГСК. В предыдущих работах была показана связь этого показателя с выживаемостью мышей разных линий, т. е. с радиочувствительностью на организменном уровне [18]. В модели гуманизированных ГСК пуповинной крови мышей показана обратная зависимость коэффициента К_14/3 от дозы облучения, что говорит о возможности использования этого показателя для оценки выраженности тканевой реакции на ионизирующее излучение. В экспериментах по сравнению данного показателя у организмов с заведомо разной радиочувствительностью (мыши NOD SCID и C57Bl/6, гуманизированные мыши с радиопротектором и без него) обнаружены однонаправленные различия: значения коэффициента были выше у более радиорезистентных объектов. Ассоциация более высокого значения К_14/3 с меньшими уровнями дозы и с более высокой радиорезистентностью может быть связана с более эффективной репопуляцией ГСК после облучения, более высоким пролиферативным потенциалом и более эффективным восстановлением пула стволовых клеток до того, как будут запущены процессы дифференцировки, созревания CD45⁺-клеток.

При введении иммунодефицитным мышам ГСК периферической крови не удается получить длительно сохраняющийся пул стволовых клеток в костном мозге животных [17], однако возможно применение схемы облучения одновременно с трансплантацией клеток человека и измерения числа ГСК и созревающих кроветворных клеток в течение 14 суток после трансплантации. В работе показано, что дозовая зависимость выживаемости ГСК через трое суток после облучения и их количества через 14 суток после облучения не отличается в моделях гуманизированных мышей с длительно сохраняющимися ГСК пуповинной крови и ГСК периферической крови. Следовательно, не предполагающая длительной репопуляции стволовых клеток модель с использованием ГСК периферической крови также приемлема для моделирования острого лучевого синдрома и оценки радиационно-индуцированной гибели и восстановления клеток. В модели с использованием ГСК периферической крови рассчитанный коэффициент К14/3 тоже показал обратную зависимость от дозы.

Важно обратить внимание на тот факт, что выживаемость ГСК на третьи сутки после облучения у разных доноров как пуповинной, так и периферической крови, имела гораздо меньшие индивидуальные отличия, чем возросшее через 14 суток число ГСК, а также число созревающих CD45⁺клеток и, соответственно, относительная доля ГСК среди всех человеческих клеток и коэффициент К14/3.

Очевидно, что индивидуальные особенности в меньшей степени влияют на различия радиационно-индуцированной гибели клеток, а в большей — на возможности репарации и последующего восстановления пула стволовых клеток, клоногенную активность ГСК.

Наиболее выраженные индивидуальные отличия были зарегистрированы при облучении гуманизированных мышей в дозе 0,5 Гр. Этот уровень воздействия может быть рекомендован для оценки персонифицированных реакций ГСК, отражающих индивидуальную радиочувствительность, в модели гуманизированных мышей с использованием ГСК периферической крови.

ВЫВОДЫ

Модель гуманизированных ГСК человека, выделенных из пуповинной и периферической крови, может быть использована для изучения реакции ГСК на облучение in vivo. Наиболее эффективным, интегральным показателем, отражающим радиационно-индуцированную гибель ГСК, восстановление их числа и функциональную активность, является коэффициент К14/3, равный отношению доли ГСК среди всех CD45^low/+-клеток человека на 14-е сутки после облучения к этому параметру на третьи сутки после облучения. Этот коэффициент может быть использован для оценки персонифицированной реакции ГСК человека на облучение.