Лимфогранулематоз (лимфома Ходжкина, ЛХ) — лимфопролиферативное заболевание, этиологию которого обсуждают до сих пор. Прежде всего, решается вопрос происхождения клеток, поражаемых при данной болезни. Фактически лимфатический узел преобразуется в гранулему, в которой неравномерно располагаются скопления лимфоидных, ретикулярных, плазматических клеток, а также нейтрофильных и эозинофильных гранулоцитов. Главным диагностическим признаком являются одноядерные клетки Ходжкина — клетки с резко базофильной цитоплазмой, с крупными ядрышками, активно делящиеся. Путем эндогенного митоза клетка Ходжкина трансформируется в многоядерную клетку Штернберга–Рид, которая имеет цитоплазму с меньшим числом базофилов и не отличается высокой скоростью деления [1]. Данные клетки активно взаимодействуют со своим микроокружением, создают оптимальные условия для роста за счет аутомедиаторов и паракринных медиаторов клеточной пролиферации, ингибирования апоптоза и подавления цитотоксических клеток [2]. Клетки Штернберга–Рид  теряют большую часть своей В-клеточной идентичности, включая В-клеточные рецепторы, и не подвергаются запрограммированной клеточной гибели Известно, что иммуносупрессия (ВИЧ, инфекции, вызываемые вирусом Эпштейна–Барр, аутоиммунные заболевания и т. д.) значительно увеличивает риск формирования лимфомы [3]. Инфекции, вызванные такими вирусами, как респираторно-синцитиальные, аденовирусы, вирусы парагриппа, коксаки ЕСНО, вирусы герпеса и многие другие, обладают цитопатическим эффектом, т. е. приводят к дегенеративным изменениям в клеточных структурах, влияющим в дальнейшем на пролиферативную активность клеток, и реализуют антиапоптотический эффект. Они в одинаковой степени поражают клетки различного происхождения, в том числе культуры, не имеющие лимфоидных элементов. Изучение особенностей функционирования иммунной системы при пролиферативных заболеваниях необходимо для понимания возможностей иммунной защиты организма при данном заболевании. 

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Обследовано 134 пациента с уточненным диагнозом ЛХ, обратившихся в МК «Биокор» (г. Архангельск, Россия). Изучение иммунного статуса и гемограмм у больных проведено в периоды ремиссии. Критерии включения: пациенты любого пола; сроки заболеваемости — 2–18 лет; продолжительность ремиссии — от 5 месяцев до 2,5 лет. Диагноз подтвержден гистологически: наличие клеток Ходжкина установлено во всех случаях, клетки Штернберга–Рид выявлены у 78 больных (58,21%). При постановке диагноза поражение лимфатических узлов смешанно-клеточного варианта установлено у 98 больных (73,13%), в остальных случаях преобладал нодулярный склероз. Локализация поражения лимфатических узлов была следующей: преимущественно подмышечная (125 случев; 93,28%), средостенная (65 случев; 48,51%) или паховая области (52 случая; 38,81%); поднижнечелюстные лимфатические узлы были поражены редко — у 21 пациента (15,67%). Цитограмму и фагоцитоз изучали в мазках, окрашенных по Романовскому–Гимзе, подсчет производили из расчета на 100 клеток. На лимфоцитах методом непрямой иммунопероксидазной реакции и проточной цитометрии (Epics XL; США) определяли экспрессию маркеров лимфоцитов. В сыворотке крови определяли содержание цитокинов IL1β, IL2, IL4, IL10, IFNγ, TNFα (Bender MedSystems; Австрия), анти-dsDNA, IgG, IgA, IgM (ORGenTec Diagnostika; Германия), IgE (Monobind; США), циркулирующие иммунные комплексы — методом иммуноферментного анализа на анализаторе «Multiscan MC» (ThermoFisher Scientific Inc., Финляндия) и автоматическом анализаторе «Evolis» (Bio-Rad; США). Результаты исследования обработаны с применением пакета прикладных программ Statistica 6 (StatSoft; США). Для проверки статистической гипотезы разности значений использовали критерий Шапиро–Уилка. Описание полученных данных проводили при помощи среднего значения и стандартного отклонения, частоты повышенных концентраций. Статистически значимые отличия между группами выявляли, используя параметрический t-критерий Стьюдента для независимых выборок, а также непараметрический критерий Манна–Уитни. Различия считали достоверными при р не более 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведен сравнительный анализ средних значений показателей иммунного статуса в зависимости от содержания лимфоцитов в венозной периферической крови (табл. 1).

Увеличение содержания лимфоцитов сопровождает активизация нейтрофильных гранулоцитов и моноцитов. Активизация нейтрофилов наблюдается в 62% случаев ЛХ с нормальным и повышенным содержанием лимфоцитов в периферической венозной крови. Повышение содержания нейтрофилов сопровождается сдвигом влево; содержание палочкоядерных нейтрофилов заметно выше в случаях отсутствия лимфопении. Известно, что активизация пролиферации нейтрофильных лейкоцитов сопровождается повышением экспрессии CD10, что ассоциировано с увеличением возможности клетки отвечать на множество воспалительных пептидов [4–8]. В случаях лимфопении реакция со стороны нейтрофильных гранулоцитов отсутствует. Повышение содержания нейтрофилов у больных с ЛХ при нормальном или повышенном уровне содержания лимфоцитов сопровождается также увеличением содержания моноцитов, признаками активизации их пролиферации и повышением содержания промоноцитов. Итак, ЛХ при нормальном содержании в крови лимфоцитов сопровождают нейтроцитоз и моноцитоз, в то время как при выраженной лимфопении частота выявления повышенных концентраций моноцитов и нейтрофилов была в 4 раза ниже. Данная реакция очень похожа на реакцию организма на глюкокортикоиды. Глюкокортикоиды давно используют для лечения нейтропении [9–12], они оказывают влияние на миграцию родоначальных клеток, грануломоноцитарных клеток-предшественников в кровь из костного мозга, с повышением числа колониеобразующих клеток в 2–4 раза, они стимулируют продукцию колониестимулирующих факторов моноцитами, выход зрелых гранулоцитов из костного мозга в кровь, их перераспределение в сосудистом русле и миграцию [13–16]. Остается открытым вопрос: что происходит при лимфопении у больных ЛХ — отсутствие реакции глюкокортикоидов, или гормоны не оказывают существенного влияния на все указанные выше процессы? Установлено, что статистически значимым фактором, оказывающим влияние на формирование лимфопении при ЛХ, оказалась длительность заболевания: при периоде болезни до двух лет (68 человек) практически у всех больных (61 человек; 89,71%) не наблюдали лимфопении; и, напротив, при продолжительном течении болезни — четыре и более лет (52 больных) — снижение абсолютного содержания лимфоцитов установлено в 46 случаях (88,46%). Лимфопения, формирующаяся при длительном течении заболевания, обусловливает нарастание уровня дефицита циркулирующих зрелых Т-лимфоцитов (CD3⁺) и взаимосвязана со снижением уровней циркулирующих нейтрофилов и моноцитов (p < 0,001).

Нейтропения (< 2 × 10⁹ кл/л) выявлена в 19 случаях (31,14%), моноцитопения (< 0,2 × 10⁹ кл/л) — у 6 больных (9,84%). Учитывая, что нейтрофильные гранулоциты и моноциты секретируют значительное разнообразие интерлейкинов, способных изменять рецепторную активность клеток, их адгезивные, миграционные способности и хемотаксис, а также активирующие, колониестимулирующие и митогенные продукты, можно полагать, что изменение их содержания является неблагоприятным критерием прогноза течения болезни. Нейтрофилы не только являются важными эффекторными клетками, но и регулируют, формируют реакции лимфоцитов. Они активно участвуют в формировании паракринного цитокинового профиля, секретируя все известные цитокины, участвуют в апоптозе, обусловливают антителозависимую цитотоксичность и формируют внеклеточные ловушки [17–22]. В активированном состоянии под влиянием IFNγ нейтрофилы экспрессируют высокоаффинный CD64 (FcγRI), обеспечивающий антителозависимую цитотоксичность [23–29]. Можно полагать, что снижение активности реакции со стороны нейтрофилов является отражением истощения резервных возможностей регуляции лимфопролиферативных процессов, миграции и рециркуляции лимфоцитов. Подобная закономерность проявляется и относительно реакции моноцитов. Моноциты, так же как и нейтрофильные лейкоциты, формируют цитокиновый профиль, секретируют колониестимулирующие факторы, обеспечивают фагоцитоз и антителозависимую цитотоксичность [30–37]. Вероятно, что влияние моноцитов более пролонгировано, поскольку содержание тканевых моноцитов в несколько раз превышает уровень содержания тканевых нейтрофилов, а продолжительность жизни тканевых моноцитов может составлять несколько лет. Таким образом, реакции активизации нейтрофилов и моноцитов при ЛХ могут компенсировать функциональную недостаточность лимфоцитов, а также выполнять регуляторные функции поддержания той части лимфоцитов, которые еще сохранили возможность выполнения своих функциональных обязанностей.

При наличии достаточно высоких концентраций нейтрофилов и моноцитов выявляются некоторые благоприятные особенности клеточного состава лейкоцитов: в среднем нормальное содержание зрелых Т-клеток, в то время как на фоне лимфопении регистрируется дефицит CD3⁺, а частота его выявления в 2,5 раза чаще; преобладание клеточноопосредованной цитотоксичности над хелперным влиянием Т-лимфоцитов; и наконец, достаточно высокий уровень резерва лимфоцитов, способных для дальнейшей дифференциации. В составе циркулирующих лимфоцитов у больных наибольший удельный вес составляют малые лимфоциты, относящиеся к неактивным клеткам – носителям генетической информации. Считается, что у практически здоровых людей малые (обычно темные, голые) лимфоциты размерами 6–8 мкм занимают 10–15% от всей циркулирующей в венозной крови популяции лимфоцитов [38–41]. Значительное увеличение содержания в крови малых лимфоцитов (до 53,17 и 74,19% от общего содержания лимфоцитов) у больных с диагнозом «болезнь Ходжкина» свидетельствует о наличии при этой болезни активизации процесса рециркуляции лимфоцитов. Известно, что рециркуляция лимфоцитов открывает доступ лимфоцитам к любой части тела и обеспечивает межклеточные взаимодействия и взаимодействие лимфоидных образований и лимфатических узлов, а также сохранение адаптивного содержания циркулирующих в крови лимфоцитов.

Наиболее резкие различия выявлены относительно содержания зрелых Т-клеток CD3⁺ с выраженным дефицитом их содержания на фоне лимфопении. Недостаток содержания зрелых циркулирующих Т-клеток на фоне лимфопении выявлен у всех больных, в то время как при отсутствии лимфопении дефицит зрелых Т-лимфоцитов выявлен только в 30% случаев. Однако эта существенная разница фактически не оказала влияние на уровень активированных Т-клеток, а также содержание Т-хелперов. А вот концентрация Т-цитотоксических клеток на фоне лимфопении была в 3 раза ниже. Следует иметь в виду, что резкое снижение общего содержания лимфоцитов происходит не только за счет Т-цитотоксических клеток, но и в равной степени за счет лимфоцитов, не имеющих на мембране CD3, и удельный вес этих клеток достаточно велик (38,57%). Итак, прогрессирование болезни и длительное ее течение сопряжены со снижением общего содержания лимфоцитов преимущественно за счет CD3⁺CD8⁺-Тцитотоксических клеток и неидентифицированных лимфоцитов. Снижение практически в 2 раза содержания лимфоцитов, меченных к апоптозу, косвенно указывает, что уровень активности лимфопролиферации у больных на фоне лимфопении значительно ниже. Действительно, функциональная активность лимфоцитов при ЛХ снижена: ниже уровень бласттрансформации, индуцированной фитогемагглютинином (соответственно 22,56 ± 1,13 и 43,24 ± 1,89%); на фоне лимфопении ниже содержание активированных Т-клеток, особенно клеток с рецептором к IL2. Пролиферирующая часть лимфоцитов (CD10⁺), вероятно, относится преимущественно к В-клеткам: и тех, и других больше на фоне лимфопении; при лимфопении выше концентрации аутоантител к dsDNA и реагинов (IgE), а также Т-клеток с рецептором к FcIg CD23⁺. Содержание В-лимфоцитов было заметно выше нормы в 85–87% соответственно на фоне умеренного увеличения общего содержания лимфоцитов и при лимфопении; абсолютные уровни содержания В-лимфоцитов в среднем у больных обеих групп было практически одинаковым (табл. 2).

Снижение активности эффекторных клеток касается и фагоцитов. Среди обследуемых лиц с нормальным уровнем лимфоцитов и лимфопенией дефицит фагоцитарной защиты регистрировали соответственно у 65 (89,04%) и 60 (98,36%) пациентов. Но, наиболее выраженные различия выявлены относительно фагоцитарной активности моноцитов: процент активно фагоцитирующих моноцитов был очень низкий — при нормальном содержании лимфоцитов он был равен 21,35 ± 1,33%, а на фоне лимфопении уровень фагоцитирующих клеток составил 9,57 ± 0,27%. Снижение функциональной активности эффекторных клеток, особенно моноцитов, возможно, является одним из главных факторов, имеющих патогенетическое значение в возникновении ЛХ. Наличие высоких концентраций циркулирующих иммунных комплексов у 69 и 78% обследуемых подтверждает несостоятельность фагоцитарной способности макрофагов в этой ситуации. Может быть, некоторое значение имеют аутоантитела, секреция которых явно активирована при заболевании, либо активизация синтеза IgE. Известно, что синтез антител данного класса (реагинов) связан с низкими дозами антигена и длительностью антигенного влияния. Реагины обладают наиболее выраженной чувствительностью, они выявляют даже конформационные изменения антигена и осуществляют одну из самых сильных эффективных реакций антителозависимой цитотоксичности.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Для ЛХ характерны изменение структуры лимфатического узла и формирование воспалительного микроокружения опухоли за счет перекрестного взаимодействия клеток Ходжкина и Штернберга–Рид с иммунным инфильтратом [42, 43]. Результаты исследований позволили разработать различные варианты лечения ЛХ, включая терапию с использованием направленных малых молекул, конъюгатов антитело–лекарство и блокады контрольных точек [44, 45]. Однако сведений о функциональной активности иммунокомпетентных клеток при влиянии воспалительного микроокружения в зависимости от длительности заболевания недостаточно. Нами установлено, что при ЛХ развивается иммунный ответ с активизацией клеточно-опосредованных и антителозависимых реакций по изоляции и клиренсу патогена в лимфоцитах или самого трансформированного лимфоцита. При этом использованы, вероятно, все возможности вплоть до резервных и довольно рискованных защитных механизмов, таких как активизация синтеза аутоантител и иммуноглобулинов особого класса — IgE, обусловливающих реакции повышенного типа. Скорее всего, и нодулярный склероз лимфатических узлов также является вынужденной в данной ситуации формой изоляции патогена. После интенсивной или длительной борьбы может развиться этап снижения резервов иммунной защиты и наступить период лимфоцитарного истощения. Он характеризуется дефицитом зрелых Т-клеток со всеми его последствиями. Вопрос о происхождении клеток Ходжкина и последующих за ними клеток Штернберга– Рид. Наличие на мембране этих клеток иммуноглобулинов, рецепторов к Fc-фрагменту иммуноглобулинов (FcIgR), а также иммунных комплексов и, главное, способность этих клеток к фагоцитозу, свидетельствуют в пользу макрофагального происхождения этих клеток. Эта позиция все еще обсуждается. Но если считать, что инициация иммунной реакции фагоцитирующими и презентирующими клетками предопределяет дальнейшую ее активность, то можно согласиться со всеми трудностями изоляции патогена, если тот самый патоген сохраняется или даже размножается в фагоците. Во всяком случае, по нашим данным, моноциты обследованных больных крайне малоактивны, регистрируется накопление очень высоких концентраций ЦИК, которые утилизируют фактически только моноциты. В пользу этого мнения говорит и факт снижения содержания в крови мононуклеаров CD16⁺ при прогрессировании болезни на фоне лимфопении. Известно, что экспрессия гена, кодирующего белок CD16, не ассоциирована с активностью фагоцитоза и присуща клеткам, активно секретирующим цитокины. Таким образом, лимфопения при болезни фактически является этапом истощения резервов поддержания иммунного гомеостаза в результате функциональной недостаточности фагоцитов и клеток, обладающих антителозависимой цитотоксичностью. Дисбаланс ответных реакций катехоламинов и кортизола обусловливает эту стадию истощения. При этом содержание катехоламинов в отличие от кортизола не снижается даже тогда, когда стресс становится привычным [46–48]. С этих позиций лимфопения при ЛХ с достаточно большой долей вероятности является критерием неблагоприятного прогноза. Такая лимфопения ассоциирована со снижением числа не только активированных Т-лимфоцитов, но и с дефицитом дифференцированных иммунокомпетентных клеток.

ВЫВОДЫ

Основные события при ЛХ, развивающиеся в лимфоидных органах, заключаются в гибели лимфоцитов. Лимфоциты, вероятно, погибают в результате резко выраженной антителозависимой цитотоксичности, в которой участвуют нейтрофильные гранулоциты, моноциты, а впоследствии эозинофилы и макрофаги. Антитела, обеспечивающие данные реакции, относятся преимущественно к IgA и IgE. Поддерживают эту реакцию IL1β и TNFα; известно, что TNFα индуцирует синтез IL1β и IL5, предотвращая апоптоз клеток [49]. Погибают преимущественно малые лимфоциты, их концентрации снижаются при лимфопении в 3 раза; лимфопения ассоциирована с дефицитом циркулирующих Т-лимфоцитов и касается как зрелых, так и незрелых Т-клеток, концентрация которых в крови падает при лимфопении в 2,5–3 раза, при этом содержание В-лимфоцитов не претерпевает резких изменений. Нарастание лимфопении, т. е. прогрессирование болезни, сопровождается сокращением резервов регуляции лимфоцитарного гомеостаза со стороны гранулоцитов и моноцитов с нарастанием нейтропении и моноцитопении.