Онкологические заболевания остаются одной из основных неинфекционных причин смертности взрослого населения и, по оценкам Всемирной организации здравоохранения, лидируют по показателям летальности в возрасте до 70 лет в 112 странах мира [1]. Среди наиболее распространенных типов злокачественных новообразований (ЗНО) по частоте выявления можно выделить рак молочной железы (РМЖ), немелкоклеточный и мелкоклеточный рак легкого (нмРЛ и мРЛ, соответственно), колоректальный рак (КРР), рак желудка (РЖ), рак печени (РП), рак простаты (РПЖ), рак шейки матки (РШМ), рак щитовидной железы (РЩЖ) и рак мочевого пузыря (РМП). К наиболее агрессивным по течению ЗНО можно отнести меланому, различные типы первичных опухолей ЦНС (нейробластомы, глиобластомы) и онкогематологические заболевания. К ЗНО с наибольшим числом летальных исходов относят РЛ, КРР, РП, РЖ, РМЖ, РПЖ, РШМ, рак пищевода, рак поджелудочной железы, и лейкемии [1]. ЗНО встречаются у людей разного возраста и пола, разных национальностей и профессий, однако значительные роли в онкогенезе играют факторы наследственной предрасположенности, вредные привычки (например, табакокурение), а также факторы окружающей среды, такие как неблагоприятные производственные условия, существенно увеличивающие риск возникновения ЗНО [2]. Поэтому важное значение имеют мероприятия по раннему выявлению ЗНО в группах профессионального риска, адекватному выбору и реализации своевременного противоопухолевого лечения.

Для солидных типов ЗНО стадий I–III основной схемой лечения является хирургическая резекция опухоли с проведением адъювантной и/или неоадъювантной терапии [3]. Часто применяют комбинированную терапию: сочетание хирургического лечения с лучевой или химиолучевой терапией [3], равно как и сочетание с иммунотерапией, например, с терапией ингибиторами иммунных контрольных точек (ИКТ) [3, 4]. В частности, Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) по состоянию на 2022 г. одобрило применение семи ингибиторов ИКТ для каскада рецептора программируемой клеточной гибели PD-1/PD-L1: пембролизумаб, ниволумаб, дурвалумаб, атезолизумаб, авелумаб, цемиплимаб, достарлимаб [4].

Другим вариантом иммунотерапии ЗНО является применение так называемых дендритноклеточных вакцин (ДК-вакцин) [5, 6]. Считается, что клиническая эффективность ДК-вакцин связана с нацеливанием на иммуносупрессорные популяции клеток в опухолевом микроокружении с последующей индукцией иммуногенной гибели опухолевых клеток [7].

ДК участвуют в презентации антигенов, регуляции иммунного ответа, подавлении иммуносупрессорных Т-лимфоцитов и могут сенсибилизировать другие клеткиэффекторы врожденного противоопухолевого иммунитета [5, 6]. Среди ДК выделяют несколько субпопуляций, в зависимости от происхождения и рецепторов антигенов: миелоидные ДК, лимфоидные ДК, плазмоцитоидные ДК, клетки Лангерганса и ДК, полученные из моноцитов [5, 6]. ДК как звено противоопухолевого иммунного ответа участвуют в распознавании и презентации иммунокомпетентным клеткам НА — появившихся de novo в клетках ЗНО антигенов [5, 6]. Эту способность ДК, нагруженных ex vivo опухолевыми антигенами, рационально использовать далее для активации в организме человека CD4⁺-Тхелперных и CD8⁺-цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) и определять таким образом направленность иммунных реакций [8]. На сегодняшний день только препарат PROvenge, аутологичный клеточный продукт, состоящий из антигенпрезентирующих клеток, активированных рекомбинантным химерным белком PA2024, был одобрен FDA в 2010 г. для лечения РПЖ по результатам клинических исследований (КИ) фазы III (NCT00779402).

Поскольку опухолевые НА стимулируют специфический противоопухолевый иммунный ответ в организме пациента, в последние годы ведут разработку новых персонализированных терапевтических подходов в области создания неоантигенных вакцин (НА-вакцины) [9]. НА (наиболее специфичные для опухолевых клеток антигены) можно разделить на общие (образованные широко распространенными мутациями в онкогенах) и персонализированные (уникальные для опухоли конкретного пациента) [10]. Активно развиваются два подхода в иммунотерапии опухолей с помощью НА: пептидные вакцины и РНК-вакцины. Так, пептидные вакцины могут содержать смеси синтетических пептидов с адъювантами или дендритные клетки, нагруженные пептидами [11, 12].

Ограничения применения ДК-вакцин связаны с длительностью и ресурсоемкостью процесса их препаративного получения. Иногда по этой причине происходит прогрессирование заболевания, что снижает клиническую пользу от терапии, а кроме того, часть пациентов может не дожить до завершения курса [5, 13]. Высокая стоимость биологических стимуляторов, которые критически важны для корректной дифференцировки ДК и нагрузки их антигенами, тоже препятствует своевременному получению вакцин и их внедрению в клиническую практику [5, 9, 13]. Еще уместно отметить, что несмотря на достижение патоморфологических ответов и стабилизации заболевания в ответ на введение ДК-вакцин и фармакологическую безопасность для организма человека, существует объективная задача повышения их эффективности, которая может быть решена путем различных модификаций существующих вариантов вакцин и комбинированного применения с другими препаратами [5, 6].

Цель обзора — систематизация литературных данных о подходах в разработке кандидатных противоопухолевых препаратов на основе ДК- и НА-вакцин с точки зрения оптимизации методических и отдельных технологических аспектов их получения для преодоления вышеупомянутых ограничений. В настоящем обзоре рассмотрены также особенности взаимодействия ДК-вакцин с иммунными клетками человека и наиболее перспективные разработки на основе данных доклинических и клинических исследований (ДКИ и КИ соответственно).

Клинические испытания ДК- и НА-вакцин для терапии ЗНО

По состоянию на декабрь 2022 г. в системе Clinical Trials [14] было найдено 410 и 96 записей о клинических исследованиях ДК- и НА-вакцин соответственно. Из всех КИ по изучению ДК-вакцин 191 КИ (46,58%) имело статус «завершено» (англ. completed), 45 КИ (10,97%) — «остановлено» (англ. terminated), 24 КИ (5,85%) — «временно приостановлено» (англ. withdrawn или suspended). Среди ста продолжающихся (англ. active) КИ, 32 КИ (7,80%) имели статус «набор пациентов завершен», 57 КИ (13,90%) — «идет набор участников», 11 КИ (2,68%) — «без набора участников». Для остальных 50 КИ (12,20%) статус неизвестен.

Среди успешно завершенных КИ противоопухолевых ДК-вакцин было проанализировано 29 исследований (86% КИ фазы II и 14% КИ фазы III). В табл. 1 представлены основные сведения о проведенных КИ (номер, название, фаза, статус, нозология, группы пациентов, схема применения ДК-вакцины, препараты в комбинации с ДК-вакцинами и т. д.). Распределение КИ, посвященных изучению безопасности, переносимости и клинической эффективности ДК-вакцин для терапии различных онкологических заболеваний, было следующим. К группе ЗНО стадии III можно отнести два КИ по изучению ДК-вакцин в монорежиме для лечения РПЖ. Еще в двух КИ изучали ДК-вакцины в комбинации с дазатинибом для лечения метастатической меланомы стадии III или глиомы на фоне темозоломида. К группе ЗНО стадии II можно отнести десять КИ ДК-вакцин, изученных в монорежиме, и 15 КИ, в которых ДК-вакцины применяли в комбинации с другими препаратами (чаще всего это было сочетание с IL2, темолозомидом или INFα). Распределение по частоте встречаемости ЗНО было следующим: глиома (пять КИ), меланома (три КИ), саркома (три КИ), рак простаты (три КИ), рак яичников и РМЖ — два КИ. Следует констатировать, что наибольшая доля исследований приходилась на комбинированное применение ДК-вакцин и ингибиторов ИКТ. Сведения о продолжающихся КИ фазы II и III представлены в табл. 2 и табл. 3 соответственно.

Число КИ, зарегистрированных в системе ClinicalTrials и посвященных изучению НА-вакцин, было примерно в четыре раза меньше, чем ДК-вакцин. Из 96 КИ 11 были завершены, восемь остановлены, три временно приостановлены, 60 продолжаются и 14 имеют неизвестный статус. По аналогии с ДК-вакцинами, клиническую оценку НА-вакцин проводили, в основном, на фоне приема ингибиторов ИКТ, а охват ЗНО в КИ был практически идентичным. В единственном КИ фазы II (NCT03633110) была подтверждена безопасность и противоопухолевая эффективность НА-вакцины на фоне приема пембролизумаба и ниволумаба. Из восьми прекращенных КИ три были прекращены из-за продолжительного времени разработки, а остальные пять — по причинам недостаточного финансирования.

Анализ сведений о КИ ДК-вакцин фазы I и II позволил выявить ряд проблемных моментов. Во-первых, основным фактором прекращения КИ является небольшое число включенных в него участников (обычно не более 20). Вовторых, сложность интерпретации полученных результатов обусловлена наличием разных схем противоопухолевой терапии в одном и том же КИ. В-третьих, специфический дизайн КИ, заключающийся в наличии одной когорты пациентов либо отсутствии рандомизации. Несмотря на достижение конечных точек безопасности и переносимости противоопухолевых вакцинных препаратов, следует отметить общую тенденцию умеренной эффективности ДК- и НА-вакцин в монорежиме, что определяет актуальность комбинированного применения с другими препаратами. Хотя есть исключения. Например, препарат для внутриопухолевого введения на основе ДК, полученный в присутствии интерферона — (IFNα) и гранулоцитарномакрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ), даже в отсутствие опухоль-ассоциированного антигена обеспечил высокие иммунологические ответы, а у некоторых субъектов на фоне низких доз ритуксимаба обеспечил полную регрессию фолликулярной лимфомы [15]. Важно, что комбинации ДК-вакцин с таргетными или иммунотерапевтическими препаратами продемонстрировали более высокие уровни эффективности, чем ДК-вакцины в монорежиме. Частота объективных ответов (ЧОО) достигала 50%, а разница выживаемости без прогрессирования (ВБП) и/или общей выживаемости пациентов (ОВ) составляла до 100% в зависимости от схемы лечения.

Таким образом, ДК-вакцины обладают выраженным противоопухолевым эффектом, позволяющим достичь более высоких показателей общей выживаемости. Другая тенденция, которую можно выявить из анализа результатов КИ, заключается в позиционировании ДК- и НА-вакцин в качестве терапии «последнего выбора», что может быть причиной их низкой эффективности в КИ при лечении ЗНО поздних стадий. Альтернативно, стимуляция инфильтрирующих опухоль иммунных клеток и локального иммунного ответа имеет все причины оказаться не менее эффективной опцией и на ранних стадиях заболевания, когда необходимо предотвратить метастазирование.

Оптимизация процессов получения и применения биотерапевтических противоопухолевых вакцин

Возможности ускорения, снижения стоимости и упрощения процедуры получения ДК-вакцин

1. Варианты ускорения процедуры получения ДК-вакцин

Первым подходом к ускорению получения ДК-вакцин является использование нуклеиновых кислот (НК) для нагрузки дендритных клеток [9]. Наработка НК — менее длительный процесс по сравнению с синтезом целевых пептидов, а процедура очистки НК менее трудоемкий процесс по сравнению с очисткой пептидов или полипептидов. НК отличаются большей стабильностью по сравнению с пептидами и сами являются адъювантами, способными активировать провоспалительные молекулярные пути с участием toll-подобных рецепторов (TLR), ассоциированных с активацией врожденного иммунитета [16].

Второй подход — модификация условий культивирования клеток. Например, перенос клетокпредшественников костного мозга мышей в монослои мышиных стромальных клеток OP9, экспрессирующих дельта-подобный лиганд Notch-1 (OP9-DL1), после трех дней культивирования с лигандом FMS-подобной тирозинкиназы 3 (FLT3L) привел к тому, что клетки экспрессировали мышиные маркеры (CD103, CD24, DEC205 и CD8α) миелоидных ДК — популяцию, которая не возникала только при культивировании с FLT3L. Транскрипционный профиль экспрессии генов в таких ДК был наиболее близок к аутологичным ДК селезенки, при этом увеличивалась выживаемость животных, что могло быть связано с усилением миграции лимфоцитов к ЗНО [6]. Совместное культивирование человеческих гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPC) и OP9-DL1 позволило увеличить в 20 раз выход ДК всех типов по сравнению с классическими методами культивирования [17].

Третий подход заключается в стимуляции клеточной культуры различными цитокинами, например, ГМ-КСФ [17, 18]. Транскрипционные профили полученных ДК были практически идентичны первичным ДК, а сами клетки демонстрировали нормальные цитокиновые реакции на агонисты TLR, в том числе секрецию IL12, TNF и IFNγ, и эффективно индуцировали пролиферацию CD4⁺- и CD8⁺Т-лимфоцитов [17, 18].

Четвертый подход реализован путем применения технологий генетического редактирования. Так, для создания ДК-вакцин использовали методы вирусной трансдукции [19], РНК-интерференции [20] и систему редактирования генома CRISPR/CRISPR-Cas9 [21]. Все методы показали свою высокую эффективность в ДКИ и, теоретически, могут быть масштабированы для препаративного получения ДК-вакцин.

Также описан подход для ускорения производства ДК-вакцин с использованием безвекторного метода по технологии Cell Squeeze®, которая основана на продавливании целевых молекул через поры в мембране, вызванные временным нарушением ее целостности [22]. Показано, что данная технология нагрузки ДК применима ex vivo и подходит для транспортировки различных антигенов в цитозоль [23].

2. Варианты снижения стоимости процедуры получения ДК-вакцин

Среди возможных подходов в снижении расходов на получение ДК-вакцин можно выделить вариант на основе экзосом, полученных из ДК (DEX). Получение DEX оценивают как более технологически доступную и менее затратную процедуру по сравнению с получением классических ДК-вакцин. Исследования in vitro и in vivo показали способность DEX активировать CD4⁺- и CD8⁺-Т-клетки и стимулировать эффективные антигенспецифичные ответы цитотоксических лимфоцитов. Однако в нескольких КИ не был достигнут требуемый уровень противоопухолевой эффективности, что ставит под вопрос перспективы применения DEX [24]. Возможным вариантом повышения эффективности DEX является предварительная обработка ДК клеток интерфероном — (IFNγ), что приводит к повышению уровня экспрессии CD40, CD80, CD86 и CD54. Однако данный подход, зарекомендовавший себя в ДКИ [25], не был столь же эффективным в КИ фазы II [26].

3. Варианты упрощения процедуры получения ДК-вакцин

Создание ДК-вакцин на основе выделенных первичных ДК из периферической крови пациента существенно проще генерации ДК ex vivo, однако применимость такого подхода ограничена низким содержанием ДК во фракции моноцитов периферической крови (менее 1%) [27]. Невысокое содержание циркулирующих в крови ДК было обнаружено у пациентов с меланомой [28] и РМЖ [29], в то время как нарушения в дифференцировке ДК отмечены в моделях РМЖ и рака поджелудочной железы [30] — соответственно, у пациентов с данными типами ЗНО низкая эффективность выделения ДК из периферической крови. Поскольку успешное применение данного подхода пока продемонстрировано только in vivo на моделях мышей с ксенотрансплантацией клеток B16/F10 (меланома), B16-OVA (меланома), MC38 (рак толстой кишки) и B16-Flt3L

(меланома) [31], то перспективы разработки вакцины из ДК типа I для большинства опухолей пока представляются мало реализуемыми.

Возможности комбинированного применения противоопухолевых вакцин

1. Факторы роста

Комбинация ДК-вакцин и факторов роста призвана усилить антиген-специфичный ответ. ГМ-КСФ наиболее часто используют в комбинации с ДК-вакцинами ввиду его функций ростового фактора кроветворения и иммуномодулятора. ГМ-КСФ применяли в качестве низкотоксичного адъюванта при терапии ДК- или НА-вакцинами, содержащими пептиды [32]. Описан еще один подход, основанный на применении ДК-вакцин и фактора роста FLT3L. Так, в присутствии FLT3L на моделях мышей было выявлено существенное увеличение генерации аутологичных ДК, в том числе плазмоцитоидных ДК. Предполагают, что повышение функциональной активности зрелых ДК в присутствии FLT3L опосредовано сигнальными путями с участием фосфоинозитид-3-киназы PI3K и киназы mTOR [33].

2. ИКТ

Комбинированное применение ингибиторов ИКТ и ДК-вакцин приводит к активации Т-лимфоцитов и NK-клеток и снижению иммуносупрессивной активности регуляторных Т-клеток [5, 34], и, таким образом, к повышению эффективности ДК-вакцин. ДК-опосредованная активация NK-клеток и γδ-Т-лимфоцитов [35, 36] может, в свою очередь, повышать эффективность ингибиторов ИКТ. Синергетический противоопухолевый эффект комбинированного применения ниволумаба и ДК-вакцины был установлен в отношении РМЖ, миеломы, меланомы, рака легких, лимфомы и глиобластомы [37], при этом доказана безопасность ДК-вакцины для пациентов и отмечено небольшое число побочных эффектов, связанных с приемом ниволумаба [37].

3. NK-клетки

Еще одним многообещающим подходом является комбинированное применение противоопухолевых ДК-вакцин и препаратов на основе NK-клеток. В микроокружении опухоли NK-клетки могут продуцировать ряд хемокинов, которые положительно влияют на активность ДК, а также фактор роста FLT3L, увеличивающий генерацию аутологичных ДК [38]. Помимо этого, активированные NK-клетки могут уничтожать незрелые ДК и индуцировать адаптивный иммунный ответ во вторичных лимфоидных органах. Зрелые ДК выделяют цитокины (прежде всего IL2, IL12, IL18), которые стимулируют NK-клетки продуцировать IFNγ, TNFα либо ГМ-КСФ, что ускоряет созревание ДК [39].

Модификации ДК- и НА-вакцин

ДК-вакцины

Современное направление разработки противоопухолевых вакцин — использование таргетированного подхода на основе опухоль-ассоциированных антигенов (ОАА). Среди них можно выделить гиперэкспрессированные антигены, антигены нормальной дифференцировки и антигены опухолевых стволовых клеток, а также НА. В качестве действующего компонента в подобной вакцине может выступать пептид, химерный белок, ДНК или РНК [16].

Один из подходов в модификации ДК-вакцин заключается в использовании наночастиц, которые легко поглощаются ДК путем эндоцитоза и могут выступать как носитель для НК либо пептидов [32]. В этом контексте, наночастицы обладают определенными преимуществами: иммуногенностью и способностью перемещаться по лимфатическим сосудам, если их размер составляет менее 200 нм. Опухолевые антигены могут быть конъюгированы с наночастицами путем адсорбции, инкапсуляции, химической конъюгации и самосборки [32].

Другой перспективный подход в модификации ДК-вакцин — применение технологии генетического перепрограммирования соматических клеток путем индукции экспрессии ключевых факторов клеточной дифференцировки. Более других для данной методики подходят моноцитарные ДК (мДК). Например, технология «SmartDC» позволяет перепрограммировать аутологичные CD14⁺-моноциты с помощью лентивирусного вектора, несущего гены, которые кодируют ГМ-КСФ, IL4 и TRP2 допахромтаутомеразу). Трансдукция вирусным вектором запускает процесс дифференцировки моноцитов в TRP2+ мДК, при этом технология «SmartDC» является более простой и менее времязатратной по сравнению с классическим получением ДК-вакцин [19].

НА-вакцины

Существует ряд разработок в области алгоритмов машинного обучения и нейронных сетей, которые помогают достаточно точно идентифицировать НА пациента и предсказать белковую (пептидную) структуру [9]. Информацию об идентифицированных или предсказанных опухолевых НА систематизируют в специализированных базах данных, например, dbPepNeo [40]. Однако далеко не все опухолевые НА можно использовать для разработки НА-вакцин. Необходимо принимать во внимание такие показатели НА, как чужеродность, клональное распределение, представленность на молекулах главных комплексов гистосовместимости I и II (MHC-I, MHC-II), сродство рецепторов Т-лимфоцитов к НА и наличие драйверных мутаций в гене, кодирующем НА [41]. Известно, что эффективность НА-вакцин в значительной мере обусловлена ОМН (англ. tumor mutational burden — опухолевая мутационная нагрузка, которая соответствует количеству мутаций на участок молекулы ДНК длиной 1 млн пар нуклеотидов), но может быть ограниченной в связи с низким значением ОМН в ряде ЗНО. Следует напомнить, что ОМН считается предиктивным биомаркером только для меланомы и НМРЛ [41, 42]. Отмечено, что выделенные либо культивированные ДК из крови пациента относительно легко можно нагрузить НА посредством рутинных процедур: электропорации или лентивирусной трансдукции [43], что способствует разработке смешанных ДК-НАвакцин, которые уже показали свою противоопухолевую эффективность в ДКИ на моделях РПЖ, РМЖ, НМРЛ, рака толстой кишки и карциномы Меркеля, а некоторые подобные вакцины исследуют в КИ (табл. 2).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ДК- и НА-вакцины представляют собой интенсивно разрабатываемую ветвь высокотехнологичных биотерапевтических противоопухолевых препаратов для персонифицированного применения. Поскольку отдельные технологические аспекты получения ДК- и НА-вакцин характеризуются значительной длительностью, высокими показателями трудо- и ресурсоемкости, актуальной остается оптимизация доклинических разработок, направленных на ускорение, снижение стоимости и упрощение процедур получения ДК- и НА-вакцин, что значительно увеличит масштаб будущего клинического применения последних.

Перспективным и многообещающим представляется подход с нацеливанием вакцин на опухолевые стволовые клетки (ОСК), в том числе на их НА. Согласно ряду исследований, опухоли с агрессивным фенотипом могут содержать значительную популяцию ОСК, которые обусловливают высокий пролиферативный потенциал и прогрессирование заболевания [44]. Однако для усовершенствования данного подхода требуется более детальное изучение молекулярно-генетического профиля ОСК и спектра специфичных биомаркеров ОСК.

Поскольку противоопухолевая эффективность ДК- и НА-вакцин показана в отношении нескольких одинаковых ЗНО, то перспективным направлением следует считать клиническую оценку смешанных (комбинированных) неоантигенно-дендритноклеточных вакцин, но пилотные результаты подобных КИ пока не опубликованы.

Как следует из анализа ландшафта завершенных и активных КИ, сочетание ДК-вакцин и ингибиторов ИКТ на сегодняшний день демонстрирует наибольшую противоопухолевую эффективность и приемлемый уровень безопасности и переносимости для пациентов с солидными ЗНО.