Заживление кожных ран представляет собой сложный процесс, в котором задействованы различные типы клеток и множество регуляторных факторов, а сбой в нормальном процессе заживления может приводить к образованию рубцов и перехода воспаления в хронический процесс. Рубцы могут ограничивать движение, вызывать боль, зуд, а также быть причиной физиологического стресса в том случае, когда рубцы на коже остаются видимыми и не могут быть скрыты одеждой или косметикой, что серьезно влияет на самооценку и качество жизни человека. Удаление и коррекция шрамов и рубцов остаются актуальной проблемой, поскольку, несмотря на разнообразие доступных методов лечения, их эффективность весьма ограничена. Объем мирового рынка в данной сфере в 2019 г. составил 19,6 млрд долларов, и ожидается, что в следующем десятилетии он вырастет на 11,5% [1].

Эффективному лечению осложнений раневого процесса могут препятствовать сопутствующие заболевания, такие как сахарный диабет, гипертоническая болезнь, а также другие сосудистые и аутоиммунные заболевания [2]. Важную роль в хронизации воспаления играют бактериальные суперинфекции.

Все раны в той или иной степени контаминированы микроорганизмами, входящими в состав сапрофитной микрофлоры кожи. Вид и количество этих микроорганизмов варьируют в зависимости от типа раны [3]. Самыми распространенными видами бактерий, вызывающими раневые инфекции, являются Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis и Acinetobacter baumannii [4]. Известно, что раневые инфекции составляют треть случаев нозокомиальных инфекций среди хирургических больных и являются причиной 70–80% смертельных случаев при раневых поражениях [5]. Хронические раны влияют на качество жизни пациентов наряду с повышенной заболеваемостью и смертностью и являются огромным финансовым бременем для систем здравоохранения во всем мире, поскольку связаны с затратами на длительную госпитализацию, диагностические тесты, антибиотики и, иногда, инвазивную хирургию [6, 7]. Поэтому заживление ран представляет собой серьезную медицинскую проблему и требует разработки безопасных и эффективных лечебных средств.

Основу доступных препаратов для заживления ран составляют адсорбенты, противовоспалительные компоненты, антибиотики или дексапантенол, стимулирующие процессы регенерации. В связи с тревожным ростом резистентности к классическим противомикробным препаратам, актуальной задачей становится поиск новых подходов к лечению ран, осложненных бактериальной инфекцией. Среди альтернативных противомикробных агентов особое внимание уделяется катионным антимикробным пептидам (КАМП) [8].

Катионные пептиды (КП) как транспортеры и как биологически активные субстанции привлекают огромное внимание ввиду их высокого сродства к клеточным мембранам, наличия определенной структуры с возможностью анализа масс-спектрометрией и широкими возможностями для разнообразного дизайна таких молекул. КП широко распространены в природе, они присутствуют у всех млекопитающих, особенно в коже, где играют защитную роль против патогенных микроорганизмов. Катионные антимикробные пептиды, или пептиды защиты хозяина (host defense peptides), представляют собой гетерогенную группу коротких положительно заряженных пептидов преимущественно амфифильной природы, секретируемых иммунными (например, нейтрофилами и макрофагами [9]) и эпителиальными клетками позвоночных и беспозвоночных для защиты от микробных инвазий [10]. К недостаткам применения пептидов в качестве потенциальных противомикробных препаратов для терапии относят очень сложную для синтеза структуру, а также протеолитическую неустойчивость КП. Предполагается, что конъюгирование КАМП с иными биологически активными молекулами, такими как другие пептиды, полипептиды, белки и, в целом, антибиотики может способствовать улучшению противомикробных свойств, а также лежать в основе создания препаратов с мультибиологической активностью. В частности, создание малотоксичных эффективных препаратов, сочетающих антибактериальную и противовоспалительную активности, с низкой вероятностью развития резистентности, внесло бы существенный вклад как в фундаментальную науку, так и в практическое здравоохранение.

Поскольку КАМП протеолитически неустойчивы, в качестве несущей платформы для пептидов представляется перспективным, на наш взгляд, использование такой молекулы, как фуллерен С60.

Фуллерен С60 представляет собой молекулярное образование углерода в форме усеченного икосаэдра, обладающее сильной антиоксидантной активностью. Известно, что водорастворимые формы фуллерена С60 проявляют множественные биологические эффекты, включая противовирусные, противовоспалительные, противоаллергические и регенеративные свойства [11, 12]. При моделировании раневого процесса in vivo было показано, что некоторые ковалентные производные фуллерена C60 ускоряют заживление ран и предотвращают инфильтрацию воспалительными клетками [13].

Известно, что фуллерен С60 не растворим в водных средах, что, безусловно, является существенным препятствием его широкого применения в медицине. Ранее нами была разработана уникальная масштабируемая технология получения стабильной водной дисперсии фуллерена С60, что позволило провести исследования его биологической активности [14]. Следует отметить, что данная технология не включает применения органических растворителей, ультразвуковой обработки и нагревания, что обусловливает биосовместимость и безопасность получаемого раствора. Наша методика позволяет получать высококонцентрированную стабильную ВДФ с концентрацией не менее 1 г/л.

Основной целью настоящей работы был анализ ранозаживляющей активности мазевой композиции на основе ВДФ в экспериментальной модели раневого воспалительного процесса, а также оценка влияния ВДФ на экспрессию генов-маркеров, участвующих в регенеративном процессе, анализ антибактериальной активности КП и оценка перспективности создания комплексов на основе КП и фуллерена С60 для терапии раневых поражений.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Композиция на основе ВДФ

Для терапии раневых поражений in vivo была приготовлена мазь, содержащая ВДФ (состав: ВДФ, вазелин, пальмитат сахарозы в соотношении 40 : 36 : 24 (по массе)), с использованием цифрового гомогенизатора IKA 25 в качестве перемешивающего устройства («ВДФ мазь»). Водный раствор фуллерена С60 был получен с использованием диализного метода [14]. Этот метод биосовместим и не включает использование токсичных органических растворителей, ультразвуковой обработки и нагревания. При этом обеспечивается высокий выход фуллерена C60 из кристаллического состояния в раствор (концентрация стерильного раствора фуллерена С60 составляла 1 мг/мл). Гидродинамический размер частиц, определенный методом динамического светорассеяния, составлял 100–200 нм.

Моделирование раневого воспалительного процесса in vivo

Моделирование раневого процесса [15] осуществляли на самках мышей линии BALB/c в возрасте 4–6 недель (питомник «Столбовая»; Москва, Россия). Животных содержали в следующих условиях: температура воздуха 18–26 °С; автоматическая смена 12-часового светового периода при относительной влажности 30–70%. Все животные имели неограниченный доступ к питьевой воде и корму. Перед выполнением раневых разрезов животных анестезировали 4% раствором изофлурана в течение 2 мин через дыхательные пути, после чего местно вводили 0,5%-й раствор лидокаина. С целью воспроизведения хирургической раны у мышей линии BALB/c вырезали фрагмент кожи (1 × 1 см) со спины. Мазь ВДФ наносили на раневую поверхность (40 мкг С60/мышь) через 24 ч после операции (группа «мазь ВДФ»). В качестве положительного контроля использовали широко применяемое терапевтическое средство — крем для лечения хирургических ран (группа «К+»). Мазь, содержащая изотонический раствор — фосфатносолевой буфер (phosphate buffered saline, PBS) вместо ВДФ, использовали в качестве отрицательного контроля (группа «PBS»). Группа «интактные» (без повреждения кожи) также использовалась в качестве отрицательного контроля. Перечисленные составы применяли один раз в сутки в течение 11 дней. На 12-й день мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации и собирали образцы кожи для количественного ПЦР-анализа.

Оценка эффективности заживления ран

Скорость заживления кожи оценивали, измеряя площадь раны в продольном и поперечном направлениях (мм), ежедневно, после чего рассчитывали площадь раны по формуле:

S_el = πab,

где S_el — площадь эллипса, a — большая полуось (половина длинного диаметра или поперечного размера), b — полуось (половина короткого диаметра или продольного размера).

Эффективность заживления раны (Х) рассчитывали в процентах по формуле:

X = (1 – S_k/S_I) × 100%,

где S_k — конечная площадь раны, S_I – начальная площадь раны [16].

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

Суммарную РНК из образцов кожи экстрагировали с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, Courtaboeuf; Франция) в соответствии с инструкциями производителя; кДНК синтезировали с использованием набора «Реверта-Л» («Интерлабсервис»; Россия). Продукт реакции обратной транскрипции амплифицировали методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием системы определения ПЦР-РВ iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories; США) и набора PCR Mix («Синтол»; Россия).

Расчеты для определения относительного уровня экспрессии генов были выполнены с использованием сравнительного Ct метода (ΔCt) относительно mHPRT.

Относительную количественную оценку ПЦР-РВ использовали для выявления изменений в экспрессии генов-мишеней по отношению к эталонному гену, которым является ген hprt мыши. Количественные результаты ПЦР для экспрессии мРНК сравнивали в виде значений ΔCt, рассчитанных по формуле: отношение (эталон/мишень) = 2^{Ct(hprt)–Ct(целевой ген)} [17].

Оценка антибактериальной активности ВДФ и катионных пептидов

Антибактериальную активность ВДФ и синтезированных пептидов оценивали in vitro на примере штамма E. coli Dh5α методом подсчета колоний в сравнении с известным антибиотиком ампициллином, который был выбран в качестве положительного контроля. В рамках метода бактериальную суспензию инкубировали с различными концентрациями КАМП в жидкой питательной среде LB в течение 4 ч при 37 °С, а затем в виде капель наносили на поверхность подсушенной агаровой среды. Посев инкубировали в течение ночи при 37 °С.

Важно отметить, что вышеупомянутый штамм E. сoli не является патогенным и неустойчив к антибиотикам. Активность пептидов в отношении выбранного штамма оценивали, основываясь на определении минимальной бактерицидной концентрации.

Синтез катионных пептидов

Синтез пептидов проводили твердофазным методом, используя автоматический синтезатор пептидов PS3 Peptide Synthesizer (Gyros Protein Technologies Inc.; США) по протоколу Fmoc-химии, используя смесь N-гидроксибензотриазола с диизопропилкарбодиимидом (HOBt/DIC) как конденсирующий агент. В синтезе использовали стартовые Fmoc-аминоацил-полимеры, смолу гелевого типа Rink Amide Сhem Matrix. Боковые карбоксильные и гидроксильные группы аминокислот несли защиту в форме третбутильной группы (t-Bu), Ɛ-аминогруппа лизина — в форме Boc, SH-группа цистеина — Trt, гуанидиновая функция аргинина — Pbf, карбоксильные и гидроксильные группы аминокислот имели защиту в форме трет-бутиловых эфиров. Стандартный цикл включал: промывку (ДМФА), удаление Fmoc-защиты (20% 4-метил-пиперидин в ДМФА), предварительное активирование Fmoc-аминокислоты (DIC/HOBt) и реакцию конденсации в среде ДМФА/N-метилпирролидон при двухкратном избытке карбоксильного компонента (~0,5–1 ч). Контроль за полнотой реакции осуществляли методом Кайзера (нингидриновый тест) и при необходимости реакцию конденсации повторяли (0,5 ч). Конечные пептиды отщепляли от полимера трифторуксусной кислотой в присутствии скавенджеров (триизопропилсилан, этандитиол, вода, диметилсульфид). Сырой продукт осаждали сухим метил-третбутиловым эфиром, затем пептид экстрагировали водной уксусной кислотой и экстракт лиофилизировали (сублимитор VirTis AdVantage 2.0 EL; SP Scientific, США). Пептиды очищали препаративной ВЭЖХ-хроматографией (LC-20 Shimadzu; Япония) на колонке с обращенной фазой (С18), используя ацетонитрил — 0,1% водная трифторуксусная кислота в качестве подвижной фазы (градиентная элюция). Полученные пептиды анализировали на гомогенность методом зонного капиллярного электрофореза на приборе Капель-105М (Люмекс; Россия) с фотометрической детекцией при 226 нм. Молекулярную массу анализировали, используя массспектрометр Microflex™ LT MALDI-TOF (Bruker Daltonic; США).

Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения Statistica 8.0 (StatSoft Inc.; США). Статистическую значимость определяли по критерию Стьюдента. Данные считали значительно различающимися, если р < 0,05. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Оценка регенеративных эффектов ВДФ на модели раневого воспалительного процесса in vivo

На модели раневого поражения проведен анализ регенеративной активности мази на основе ВДФ в сравнении с коммерческим лекарственным средством («К+», положительный контроль). Визуальную оценку процесса заживления ран проводили индивидуально для каждой мыши путем измерения площади поражения. Исходная средняя площадь повреждения составила 143,5 ± 6,1 мм² (группа «до лечения»). В последний день эксперимента площадь поражения по группам составила: «без лечения» — 44,4 ± 6,5 мм², «мазь ВДФ» — 14,8 ± 2,7 мм², «К+» — 26,0 ± 2,6 мм². Эти цифры показывают, что заживление при обработке ран ВДФ было эффективным, и скорость заживления была сравнима с группой положительного контроля и даже несколько превосходила последний. Поскольку визуальная оценка заживления является субъективным параметром, был проведен статистический анализ площади раны между группами, показавший статистическую значимость различий между значениями групп «мазь ВДФ» и «К+», которые, в свою очередь, достоверно отличались от значений группы «PBS». Установлено, что если для обработки хирургической раны использовали мазь ВДФ, то остаточная площадь раны была наименьшей.

Оценка уровня экспрессии патогенетически значимых генов

Для оценки способности ВДФ влиять на патегенетически значимые факторы регенеративного процесса был проведен анализ уровня экспрессии ряда генов. Величину экспрессии генов в коже мышей с раневым поражением с/без обработки ВДФ определяли методом ПЦР-РВ. Было показано, что во всех экспериментальных группах, где животные получали ВДФ, уровень экспрессии такого провоспалительного фактора, как tnfα, который продуцируется в ответ на внедрение патогенов и повреждение тканей, а также стимулирует развитие местной воспалительной реакции, был значительно снижен по сравнению с группой животных, не проходивших терапию («PBS»). Уровень экспрессии генов других провоспалительных цитокинов, таких как il6 и il1a, также был значительно снижен у мышей с раневым поражением, которых лечили ВДФ, по сравнению с животными без терапии. Кроме того, нами было выявлено наличие способности фуллерена С60 усиливать экспрессию фактора HMGB1, который нарушает синтез коллагена и может обусловливать безрубцовое заживление ткани, наблюдаемое при обработке ВДФ.

Таким образом, наши результаты свидетельствуют о способности фуллерена С60 ингибировать экспрессию генов провоспалительных цитокинов, что обусловливает наличие у данного ващества противовоспалительного эффекта, который, вероятно, способствует ускорению процесса заживления.

Дизайн катионных пептидов

КП широко распространены в природе и продуцируются практически всеми организмами как часть неспецифической иммунной системы. Эти соединения первоначально рассматривали как потенциальные заменители антибиотиков, но оказалось, что они имеют более широкий спектр терапевтических эффектов, включая воздействия на вирусы, бактерии, микробные биопленки. Природные КП представляют собой линейные молекулы, содержащие до 50 аминокислот, с высокой долей гидрофобных и катионных остатков, что заставляет молекулы сворачиваться в амфипатические структуры с образованием α-спиралей и β-листов. За счет высокого содержания цистеина и образования дисульфидных связей такие пептиды формируют специфичные петлевые конформации. Подавляющее большинство природных антимикробных КП имеют заряды от +3 до +9. Механизм их действия связан, в первую очередь, с повреждением клеточной мембраны [18]. В настоящее время технологии позволяют создавать структуры, сильно отличающиеся в топологическом отношении от природных конструкций, включая дендримерные структуры, не встречающиеся в природе. Конструирование аминокислотной последовательности включало создание конструкции с низкой токсичностью, стабильной в сывороточной среде, при этом структура должна демонстрировать значительную эффективность в стимуляции трансфекции. План также предполагал создание модульных конструкций. Одним из таких модулей является N-концевой суперкатионный участок, представленный остатками аргинина и/или лизина, он необходим для взаимодействия с НК и с поверхностью клетки. Центральный модуль представлен гидрофобным ядром из остатков лизина и короткими гидрофобными/амфифильными вставками. С-концевой модуль формирует также гидрофобный участок, обеспечивающий дополнительное сродство с мембраной клетки, и содержит остаток цистеина со свободной тиольной группой, предназначенной для присоединения репортерной метки.

В механизме повреждения мембраны важную роль играют гидрофобные взаимодействия между алифатическими цепями липидных мембран и гидрофобными остатками пептида, что способствует его включению в бислой мембраны через различные пути взаимодействий, например, путем образования пор. В модели «ковра» (carpet) катионный пептид, взаимодействуя с внешним фосфолипидным слоем мембраны, располагается параллельно клетке, покрывая ее насыщающим образом. При достигнутом пороговом значении пептиды начинают вращаться, внедряются в мембрану, вызывая ее пермебиализацию. Особый интерес представляют разветвленные структуры — дендримерные КП. Следует отметить, что они обладают значительно большей устойчивостью к протеолитическим ферментам, в то же время меньшей токсичностью по сравнению с линейными пептидами аналогичного аминокислотного состава. При этом связывание с клетками у них сильнее благодаря кооперативным эффектам ввиду наличия у молекулы нескольких цепей. Наши ранние эксперименты демонстрировали их высокую проницаемость через клеточные мембраны, благодаря чему их можно использовать как носители для трансфекции клеток, для переноса генов и других биологически активных соединений [19].

Оценка антибактериальной активности ВДФ и катионных пептидов

В рамках изучения антибактериальной активности ВДФ и КП нами было показано, что ВДФ не имела бактерицидной активности и не обладала способностью ингибировать рост бактерий. Далее нами был проведен анализ ряда КП, которые, исходя из своих структурных характеристик, должны были обладать потенциальной антибактериальной активностью. Так, из 35 синтезированных нами линейных и дендримерных КАМП с молекулярной массой не более 4,5 кДа, четыре катионных пептида, а именно линейные пептиды АB-1, AB-3 и дендримерные пептиды AB-4, ST-10, продемонстрировали разную степень ингибирования роста бактериальной культуры E. coli Dh5a, а также определенную бактерицидную активность в отношении данного штамма (см. таблица).

Методом подсчета колоний нами была определена минимальная бактерицидная концентрация катионных пептидов, т. е. минимальная концентрация, вызывающая полную гибель бактерий в стандартных условиях опыта.

Таким образом, МБК для пептида AB-1 составила 1,15 мM. При этом следует отметить, что в концентрации 0,23 мM (в пять раз ниже бактерицидной) пептид AB-1 не показал какой–либо существенной активности в отношении данной бактериальной культуры, что указывает на крайне узкий рабочий диапазон концентраций пептида (рис. 1).

Пептид AB-3 обладал более выраженной, по сравнению с АВ-1, бактерицидной активностью в отношении штамма E. coli Dh5α (рис. 2).

МБК для данного пептида составляла 0,11 мM. При этом активность ампициллина в соответствующих дозах была примерно в 6 раз ниже. МБК ампициллина составляла 0,74 мM.

Исследуемый пептид AB-4 проявлял существенную бактерицидную активность, сравнимую с контрольным антибиотиком ампициллином. МБК для данного пептида составляло 0,74 мM (рис. 3).

МБК для дендримерного пептида ST-10 составила 0,74 мM (рис. 4).

Указанная концентрация является минимальной, при которой наблюдается близкая к 100% гибель клеток. Следует отметить, что уровень проявленной пептидом ST-10 активности был несколько выше относительно контрольного образца антибиотика ампициллина. Так, при сопоставимых концентрациях 0,15 мM и одинаковом разведении E. coli (1 : 10) видно, что количество обнаруживаемых бактериальных колоний культуры, обработанной пептидом ST-10, существенно меньше, чем при обработке ампициллином, и составляет 16 и 95 соответственно. Таким образом, под действием 0,15 мM пептида и антибиотика эффект ингибирования роста бактериальной культуры был существеннее у ST-10.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

В большинстве случаев ранения сопровождаются кровотечением из поврежденных сосудов и выбросом в окружающие ткани медиаторов воспаления, таких как серотонин, гистамин, вазоактивные вещества и цитокины. Нормальное заживление включает следующие фазы: воспаление, пролиферацию, созревание и ремоделирование. С целью определения регенеративной активности ВДФ мы оценивали экспрессию ряда геновмаркеров, в том числе tnfα, il6 и il1α, участвующих в регенеративном процессе, с помощью ПЦР-РВ. Увеличение экспрессии этих цитокинов наблюдается во время воспалительной фазы заживления. Известно, что TNFα стимулирует выработку не только IL1, IL6, но и других провоспалительных цитокинов [20, 21]. IL6 является одним из важнейших медиаторов острой фазы воспаления. Известно, что у мышей с дефицитом IL6 наблюдается задержка реэпителизации раны. Однако избыточный уровень IL6 служит сигналом для подавления пролиферации фибробластов на поздней стадии раны и приводит к образованию рубца [22]. Что касается IL1α, то ранее было показано, что он стимулирует выработку коллагеназы, и сверхэкспрессия данного цитокина может быть связана с нарушением заживления ран из-за расщепления коллагена. Умеренное увеличение уровня экспрессии гена il1α впоследствии опосредует пролиферацию кератиноцитов в месте раны [23]. Уровни il1α низкие в раневой жидкости из острых ран, но повышены в жидкости из хронических ран.

Так, подавление экспрессии tnfα, il6 и il1α под действием фуллерена С60 указывает на наличие у него не только противовоспалительного эффекта, но и способности препятствовать хронизации раневого процесса [15]. Ранее на модели атопического дерматита нами была показана противоаллергическая активность ВДФ с ингибированием Th1-цитокинов, а также увеличение экспрессии генов Foxp3 и FLG (филаггрин) [24]. Таким образом, ВДФ проявила способность подавлять воспалительный процесс не только при раневом поражении, но и при аллергии, что делает ее перспективным соединением для терапии воспалительных заболеваний кожи.

Раневой процесс часто сопровождается присоединением вторичной бактериальной инфекции. Известно, что КАМП обладают широким спектром антимикробной и иммуномодулирующей активности в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий, биопленок, вирусов, грибов и паразитов и эффективны против штаммов с множественной лекарственной устойчивостью. Важно отметить, что, вследствие высокой скорости бактерицидного действия КАМП, разнообразия механизмов действия и мишеней, вероятность развития резистентности к катионным пептидам крайне мала и требует наличия множественных мутаций, в частности, опосредующих изменение структуры клеточной стенки [25–27]. Вышеперечисленное делает КАМП перспективными соединениями для создания на их основе антибактериальных препаратов, а понимание того, как свойства антимикробных пептидов зависят от аминокислотной последовательности, позволит в будущем своевременно реагировать на появление новых устойчивых к антибиотикам штаммов бактерий за счет целенаправленной реконструкции пептидных последовательностей [28].

В рамках проведения текущих исследований нами была создана библиотека КАМП, которые предположительно должны обладать высокой противомикробной активностью и низкой токсичностью. Для разработки панели КП мы опирались на базы данных уже имеющихся пептидов, а также на данные литературы по биологической (антибактериальной) активности КП. Таким образом, пептидные последовательности мы конструировали с учетом содержания положительно заряженных аминокислот, гидрофобных аминокислот. Кроме того, при конструировании последовательностей были получены как линейные, так и дендримерные молекулы.

Так, определив некие правила создания катионных пептидов с антибактериальной активностью, мы рассчитываем в дальнейшем создать более активные КП. Противовоспалительная активность ВДФ делает привлекательной идею разработки гибридных молекул на основе КП и ВДФ.

ВЫВОДЫ

В результате проведенного исследования были разработаны и синтезированы КП, обладающие антибактериальной активностью. Так, пептиды AB-1, AB-2, AB-3 и ST-10, на наш взгляд, перспективны для создания на их основе противомикробных препаратов. В рамках дальнейших исследований мы планируем разработать на основе КП и фуллерена С60 гибридные соединения для сочетания противовоспалительной и ранозаживляющей активности с антибактериальной активностью. Фуллерен может выполнять роль несущей платформы для КП. Поскольку поверхность сферической молекулы фуллерена довольно большая, к ней можно присоединять до 4–8 молекул пептида. Такая мультивалентная структура менее подвержена биодеградации, и антимикробная активность может повышаться за счет кооперативного эффекта, одновременного присоединения нескольких цепей КП к клеточной мембране бактерии. Необходимо также учесть, что сам фуллерен С60, а также его аминокислотные аддукты, обладают способностью проникать через биологические мембраны.