Бетагерпесвирус человека 6А/В (ВГЧ-6А/В) широко распространен в человеческой популяции. В 1986 г. группа ученых из лаборатории Национального института онкологии (США) выделила вирус у больных с лимфопролиферативными заболеваниями, определив его как В-лимфотропный человеческий вирус, однако позже были установлены его сродство к Т-лимфоцитам и принадлежность к семейству Herpesviridae, подсемейство Betaherpesvirinae, род Roseolovirus [1]. Передача вируса осуществляется преимущественно контактно-бытовым путем со слюной, реже воздушно-капельным, половым путем и при трансплантации органов. Основной клеткоймишенью вируса является CD4⁺ Т-лимфоцит. ВГЧ-6 проникает в клетки посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза, после чего происходит репликация вируса. После первичной инфекции вирусная ДНК сохраняется в мононуклеарных клетках периферической крови [2, 3]. ВГЧ-6А/В может быть триггером иммуносупрессивных и хронических аутоиммунных процессов [4].

В 2012 г. Международный комитет по таксономии вирусов (ICTV) ратифицировал разделение ВГЧ-6 на два самостоятельных таксономических варианта — ВГЧ-6А и ВГЧ-6В [5, 6]. Несмотря на то что геномы этих вирусов гомологичны на 90%, они различаются фенотипически, тропны к разным клеточным рецепторам и в большинстве случаев имеют разные клинические проявления [7]. ВГЧ-6А является менее изученным вирусом, его приобретают в более позднем возрасте и чаще выявляют у иммунокомпрометированных лиц. Предполагают, что этот вирус ассоциирован с таким нейрогенеративным заболеванием, как болезнь Альцгеймера [3, 8]. ВГЧ-6В распространен повсеместно, более 90% населения инфицируются им в течение первых трех лет жизни, а реактивация может произойти в любом возрасте [3]. Вирусы имеют различную тропность к иммунокомпетентным клеткам. Так, для проникновения в клетку ВГЧ-6А использует рецепторы CD46 и способен поражать Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты и натуральные киллеры, ВГЧ-6В, напротив, использует CD134-рецепторы и не способен персистировать в цитотоксических Т-лимфоцитах [9, 10].

Геном ВГЧ-6А и В состоит из двухцепочечной ДНК средней длиной около 160 кб. Примечательно, что геном ВГЧ-6А короче генома ВГЧ-6В, он составляет приблизительно 159 кб против 162 кб соответственно [11]. Большинство генов расположены в уникальном сегменте, который фланкирован последовательностями прямых повторов (ПП). В свою очередь, ПП окружены рас1 и рас2, которые являются цис-действующими сигналами для упаковки вируса [11, 12]. Число открытых рамок считывания (ОРС) зависит от типа вируса (А/В) и метода детекции. На основе последовательности ранее были предсказаны около 115–119 ОРС [11, 13], но, используя современные методы Ribo-seq и RNA-seq, ученые [8] смогли обнаружить 268 новых ОРС в ВГЧ-6А и 216 — ВГЧ6В. Сходство нуклеотидных последовательностей между ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в среднем составляет 90%. Наиболее консервативными генами являются U39 и U48, которые кодируют гликопротеины оболочки gB и gH соответственно. Их нуклеотидные последовательности совпадают на 94%, а аминокислотные последовательности — на 96% [11, 14]. При этом наиболее изменчивые гены расположены ближе к концам генома, они в основном кодируют белки, которые предположительно участвуют в иммуномодуляции, сигнализации (хемотаксис) и проникновении вирусов [12].

Преимущественным методом диагностики ВГЧ-6А/В считается полимеразная цепная реакция (ПЦР), однако на сегодняшний день нет четко установленной границы между определением латентной и активной вирусной инфекции по ее результатам. Отсутствие ДНК ВГЧ-6А/В в плазме или сыворотке крови не означает, что в тканях (например, в сердце, щитовидной железе, головном мозге) нет персистирующих вирусов в низкой концентрации. Диагностическое значение также имеет выявление специфических антител класса IgM и IgG в сыворотке крови [16]. Исследователями [17] предложены тест-системы, учитывающие разные рамки считывания для ВГЧ-6А (U11, p100) и ВГЧ-6В (101K).

Способность ВГЧ-6 интегрироваться в субтеломерную область клеточной хромосомы была обнаружена в 1993 г. [18]. К настоящему времени известно, что интеграция вируса чаще происходит в теломерных участках хромосом 1q, 6q, 9q, 10q, 11p, 17p, 18p, 19q, 22q, Xp, однако механизмы до конца не изучены [19–23]. При встраивании ВГЧ-6 в геном половых клеток возможна передача вируса следующим поколениям с образованием унаследованной хромосомноинтегрированной формы ВГЧ-6А/В (унаследованный хиВГЧ-6А/В) в соответствии с законами Менделя [24]. ХиВГЧ-6А/В также может передаваться при трансплантации клеток, органов и тканей. Распространенность хиВГЧ6А/В варьирует от 0,2% в Японии и 0,6% в Канаде до 1–3% в Европе и зависит от географических факторов и анализируемой популяции пациентов [25, 26].

Описаны случаи реактивации ВГЧ-6А/В из интегрированного состояния на фоне иммунодефицитных состояний, беременности с развитием клинически манифестных форм [2, 27, 28]. Во время беременности реактивация вируса из хромосомно-интегрированного состояния может приводить к возрастанию риска самопроизвольных абортов [29]. Британское исследование, проведенное в 2020 г., показало, что у женщин с инфицированными хиВГЧ-6А/В плодами в 2,5–3 раза повышен риск преэклампсии [30]. Биологические и медицинские последствия хромосомной интеграции ВГЧ6А и ВГЧ-6В в настоящее время изучаются. Так, например, теломеры, связанные с эндогенным ВГЧ-6А/В, зачастую склонны к внезапным делециям, которые приводят к их укорочению. В результате наблюдается преждевременное старение клеток и нарушение тканевого гомеостаза [31–33]. Нестабильность генома может быть причиной развития онкологических заболеваний.

Целью работы было проверить гипотезу о хромосомной интеграции ВГЧ-6А и его вертикальной передаче у пациента с длительным обнаружением вируса во время рекуррентных респираторных заболеваний, а также в бессимптомный период, при отсутствии жалоб на здоровье.

ПАЦИЕНТЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследования стали пять членов семьи — мать (36 лет), отец (39 лет), трое сыновей (4 года, 6 лет, 14 лет). Семья проживает в г. Кириши Ленинградской области.

Выделение нуклеиновых кислот и выявление ВГЧ-6А/В

При проведении исследования отбирали назофарингеальные мазки и венозную кровь для молекулярно-генетических исследований и иммуноферментного анализа. Для выявления в назофарингеальных мазках специфических фрагментов нуклеиновых кислот (НК) гриппа А, В, респираторносинцитиального вируса, вирусов парагриппа 1–4 типов, сезонных коронавирусов, метапневмовируса, риновирусов, а также ДНК аденовирусов групп B, C, E и бокавирусов использовали реагенты «АмплиСенс Influenzavirus A/B-FL» и «АмплиСенс ОРВИ-скрин-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора; Россия) для мультиплексной ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации. Выявление ДНК вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ), ВГЧ-6А/В и цитомегаловируса (ЦМВ) в крови и мазках слизистой ротоглотки проводили с помощью ПЦР в режиме реального времени (РВ-ПЦР) с использованием набора «АмплиСенс EBV/CMV/HHV6-скрин-FL» (ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора; Россия). Определение вирусной нагрузки ВГЧ-6А/В в исследуемых биоматериалах регистрировалось в диапазоне 22–38 циклов амплификации (Ct) и выражалось в геном-эквиваленте в 1 мл нативного образца после преаналитической обработки (ГЭ/мл). Диагностически значимыми были результаты в диапазоне 35 циклов (10³–10⁴ ГЭ/мл). Для выделения ДНК использовали венозную кровь, помещенную в пробирки К2-ЭДТА для взятия образцов крови. Соскоб со слизистой ротоглотки помещали в «Транспортную среду с муколитиком (ТСМ)» («ИЛС»; Россия). ДНК из венозной крови выделяли на автоматической станции для очистки нуклеиновых кислот MagNa Pure (Roche; Швейцария) с использованием стандартного метода пробоподготовки. Очистку материала из мазка слизистой ротоглотки проводили с помощью набора для выделения «РеалБест экстрация 100» («Вектор-Бест»; Россия). Подготовка образцов, их выделение были выполнены согласно инструкциям производителей. Контроль выделения осуществляли на спектрофотометре NanoStar (BMG; Германия); количественную оценку выделенного материала проводили на флюориметре Quantus (Promega; США).

Для проверки наличия и качества ДНК в выделенном образце использовали стандартный клеточный ген GAPDH [34]. Амплификацию проводили на амплификаторе CFX-96 (BioRad; США) с помощью набора «Готовая смесь для ПЦР qPCRmix-HS» («Евроген»; Россия).

Выявление антител классов IgM и IgG к перечисленным герпесвирусам выполняли в рамках стандартного лабораторного обследования методом качественного иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием коммерческих наборов «ВектоВЭБ-VCA-IgМ/G» и «ВектоЦМВIgМ/G» («Вектор-Бест»; Россия) и полуколичественного ИФА с использованием коммерческих наборов «HHV-6-IgM/G-ИФАБЕСТ» («Вектор-Бест»; Россия) на аппарате открытого типа «Lasurit» (Dynex Technologies Inc.; США). Результат представлен коэффициентом позитивности (КП), выраженным в условных единицах (у.е.) согласно инструкции изготовителя тест-системы.

В качестве дополнительного материала использовали образец спермы, полученной от отца семейства. С помощью среды для выделения жизнеспособных сперматозоидов SupraSperm System (ORIGIO; США) методом центрифугирования в градиенте плотности были получены сперматозоиды. Выделение ДНК из сперматозоидов выполняли путем экстракции ДНК фенол-хлороформом. Оценку качества полученной ДНК выполняли с помощью прибора 4200 TapeStation System и набора Genomic DNA ScreenTape (Agilent Technologies; США), концентрацию измеряли на флуориметре QuantiFluor dsDNA System (Promega; США).

Прочие лабораторные исследования

В дополнение к стандартным диагностическим исследованиям проводили дифференциацию вариантов ВГЧ-6А/В с использованием праймеров, описанных [34]. Праймеры проверили на выравнивание с эталонными последовательностями ВГЧ-6 с помощью программы BLAST (NCBI; США):

ВГЧ6 A/B FP: 5’- GACAATCACATGCCTGGATAATG-3’;

ВГЧ-6A RP, 5’- ТGGTAATGTAATTGTGTGTTGTTTTA-3’;

ВГЧ-6B RP, 5’- TGGTAATGTAAGTGTGCGTTATTTTC-3’;

ВГЧ6 probe, 5’-FAM- AGCAGCTGGCGAAAGCTGTGC-TAMRA-3’.

Подготовка NGS библиотек

Библиотеки для секвенирования были подготовлены для двух приборов с целью получения длинных и коротких прочтений. Длинные прочтения получали с помощью прибора MinION (Oxford Nanopore Technologies; Великобритания). Библиотеки готовили согласно протоколу для полногеномного секвенирования с использованием набора реагентов для подготовки образцов SQK-LSK109 (Oxford Nanopore Technologies; Великобритания) и модуля NEBNext (New England Biolabs Inc.; США) для подготовки библиотек Oxford Nanopore Technologies (NEBNext). Короткие прочтения получали в ходе секвенирования на приборе MGISEQ 2000 (MGI Tech Co.; Китай). Подготовку библиотек выполняли согласно руководству [35].

Оценку качества полученных библиотек выполняли при помощи наборов D1000 ScreenTape и High Sensitivity D1000 ScreenTape (Agilent Technologies; США), концентрацию измеряли на флуориметре Quantus с использованием набора QuantiFluor dsDNA System (Promega; США).

Секвенирование ДНК

Для полногеномного секвенирования на приборе MinION использовали проточную ячейку для нанопорового секвенирования R10 (FLO-MIN111) (Agilent Technologies; США).

Полногеномное секвенирование на приборе MGISEQ 2000 было выполнено с помощью комплекта расходных материалов и реагентов DNBSEQ-G400 CoolMPS High- throughput Sequencing Set (PE100, 320 G) (MGI Tech Co.; Китай). Для полногеномного секвенирования была выделена одна дорожка.

Сборка генома

Данные, полученные с платформы Nanopore, использовали для сборки вирусного генома. Сборка генома была выполнена с использованием пользовательского конвейера: связанные с герпесвирусом прочтения извлекли с помощью программы Cookiecutter [36], используя в качестве референса московский штамм (GenBank ID: MK630134, MK630133) [37], так как он характеризуется большой глубиной покрытия (500x). Далее в исследовании использовали только участок гена gB (U39), который в этих последовательностях собран полностью. Прочтения были собраны с помощью программы SPAdes [38], собранные контиги скомпонованы вручную посредством поиска полной референсной последовательности в BLAST [39].

Филогенетический анализ

Нуклеотидная последовательность гена ВГЧ-6A glycoprotein B (gB, U39) (Gene ID: 1487917) была использована для филогенетического анализа. В анализ были включены все доступные последовательности из 270 сборок вирусов герпеса (как 6А, так и 6В), имеющихся в базе данных GenBank. Для выравнивания последовательностей использовали алгоритм MAFFT v7.505 с моделью замещения параметров Кимуры – 1 [40]. Затем полученные выравнивания были упорядочены для построения дерева с помощью метода Neighbor-Joining (Jukes-Cantor, Bootstrap resampling = 100) [41].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В декабре 2018 г. ребенок С. А., 6 лет, вместе с братом С. Т., 4 года, поступили в Детский научно-клинический центр инфекционных болезней с первичным диагнозом «острый ринофарингит, тонзиллит, средней степени тяжести». В мазках со слизистой ротоглотки методом ПЦР не были обнаружены маркеры респираторных вирусов, а также бактериологическим методом не были выявлены бактериальные возбудители. Учитывая положительные результаты ПЦР-анализа на герпесвирусы, диагноз был уточнен как «герпесвирусная инфекция сочетанной этиологии (ВГЧ-6 + ВЭБ), острый ринофаринготонзиллит, средней степени тяжести». В периферической крови обоих пациентов была обнаружена ДНК ВГЧ-6А/В и ВЭБ. Положительные тесты на ДНК ВЭБ в клетках крови, наряду с поздними IgG к капсидному антигену (VCA) ВЭБ в сыворотке крови, доказали реактивацию вируса. Данные лабораторных анализов, представленные в табл. 1, были получены при обследовании в первые дни после поступления детей в стационар.

Маркеры ЦМВ (ДНК, IgM, IgG) у пациентов обнаружены не были. Между тем, генотипирование ВГЧ-6 в крови и мазках из ротоглотки подтвердило наличие варианта ВГЧ-6А у С. А. и ВГЧ-6В в диагностически значимых концентрациях у его брата С. Т. При этом у С. Т. антитела к ВГЧ-6А/В в сыворотке крови отсутствовали, что могло быть связано с ранним периодом острой вирусной инфекции, до начала синтеза антител, или с их низкой концентрацией, находившейся за пределами аналитической чувствительности используемой диагностической тестсистемы, тогда как у 6-летнего пациента выявлены высокие концентрации IgG к ВГЧ-6А/В (6,9 у.е.), что может указывать на большую длительность течения инфекции.

Повторное обследование этих пациентов было проведено во время контрольного визита 14 августа 2019 г. (табл. 2).

При обследовании обоих пациентов через восемь месяцев ДНК ВЭБ в крови не обнаружили. Антитела класса IgG к ВГЧ-6А/В в крови определяли в диагностических концентрациях, однако у ребенка С.А. в крови и соскобе из ротоглотки регистрировали в динамике сохранение вирусной нагрузки ВГЧ-6А, в то время как у ребенка С. Т. ДНК ВГЧ-6В ни в крови, ни в соскобе обнаружен не был. Оба ребенка на момент повторного обследования были клинически здоровы. Факт постоянного выделения ВГЧ-6А из крови и соскоба ротоглотки у наблюдаемого 6-летнего пациента мог быть связан с интеграцией генома вируса в ДНК человеческих клеток, что требовало дальнейшего подтверждения.

Чтобы доказать хромосомную интеграцию ВГЧ-6А, на обследование пригласили родителей (мать, 36 лет, отца, 39 лет) и старшего брата наблюдаемых пациентов (С. А., 14 лет), не предъявлявших жалоб на состояние здоровья на момент проведения скрининговых тестов (табл. 3).

Таким образом, мы обнаружили, что клинически бессимптомные отец и старший брат пациента также характеризовались высокой вирусной нагрузкой ВГЧ6А в крови и мазках из ротоглотки в диагностически значимых концентрациях. При этом ДНК ВГЧ-6А и ВГЧ6В не были обнаружены в биоматериале матери. В связи с обнаружением одинаково высокого содержания ДНК ВГЧ-6А в биопробах двух старших братьев и отца мы заподозрили наследственную передачу хиВГЧ-6А от отца к детям. Из-за технической невозможности выполнения исследований волосяных фолликулов, ногтевых пластин для получения ответа на вопрос о возможной вертикальной передаче хиВГЧ-6А было решено получить биоматериал от родителя, отличный от крови, в котором отсутствовали бы лейкоциты и цитоплазматическая ДНК, то есть сперму, как в исследовании [42]. ДНК сперматозоидов подвергали РВ-ПЦР, отделяли от остального эякулята, после чего выделяли ДНК. После этого была выявлена нагрузка ВГЧ6А в 106 ГЭ/мл, что эквивалентно концентрации вируса в других биоматериалах. Это также подтверждает факт хромосомной интеграции.

Впоследствии мы попытались собрать геном этого изолята ВГЧ-6А. Для подтверждения хромосомной интеграции ВГЧ-6А и проведения филогенетического анализа был секвенирован геном ВГЧ-6А с получением коротких и длинных прочтений областей вирусных генов.

Структура генома и положение на филогенетическом дереве

Мы получили сборку генома ВГЧ-6А, однако покрытие прочтений не превышало 3–4 прочтения на каждый нуклеотид, поэтому сборку генома для отдельных генов проводили вручную.

Для определения филогенетического положения нового изолята вируса мы выбрали ген gB, который традиционно используют для сравнения филогенетических деревьев вируса герпеса [43]. Для этого сходные последовательности этого гена искали среди родственных геномных сборок с помощью программы локального выравнивания BLAST, а затем на основе полученных результатов проводили ручную сборку. Для анализа филогенетической идентичности были использованы последовательности из 270 геномных сборок вируса герпеса. Согласно филогении, построенной для гена gB, полученный штамм вируса оказался очень похожим на два штамма, представленные московской группой (GenBank ID: MK630134, MK630133) (рисунок). Важной особенностью этих штаммов является то, что они интегрированы в геном человека. Этот вывод может подтвердить наши результаты, которые свидетельствуют об интеграции нового описанного штамма в геном хозяина.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Первый случай интеграции ВГЧ-6А/В в хромосому был описан еще в первой половине 90-х годов. После этого вирус неоднократно обнаруживали в ряде человеческих хромосом: 1q, 6q, 9q, 10q, 11p, 17p, 18p, 19q, 22q и Xp [19–23]. Отмечают, что интеграция свойственна как ВГЧ6А, так и ВГЧ-6В, она наблюдается в теломерных участках хромосомы. В работе [43] показано, что интегрированный ВГЧ-6А существует в неактивном состоянии до конца жизни человека. Интегрированный вирус может реактивироваться под воздействием различных факторов, что более характерно для ВГЧ-6В, и запустить инфекционный процесс. Показано, что хиВГЧ-6А/В разбивается на клады, характеризующиеся определенными хромосомой и локусом, в которые встраивается вирус.

В ходе выполнения исследования мы столкнулись со случаем длительного выявления ДНК ВГЧ-6А в биоматериале (венозная кровь и назофарингеальный мазок) пациента, проводя исследования как при первичном поступлении в стационар, так и повторно, через восемь месяцев, в период отсутствия жалоб на состояние здоровья. При этом вирусная нагрузка в венозной крови и назофарингеальном мазке оставалась высокой (10⁵–10⁶ ГЭ/мл и 10⁴ ГЭ/мл соответственно). На основе полученных данных была заподозрена хромосомная интеграция ВГЧ-6А. Последующее клиническое и лабораторное обследование остальных членов семьи позволило выявить сопоставимые высокие значения вирусной нагрузки в аналогичных биоматериалах как старшего брата, так и отца пациента. Кроме того, у отца ВГЧ-6А был обнаружен в половых клетках. Таким образом, была выдвинута гипотеза, что вирус мог не только интегрирован в хромосому, но и передан наблюдаемому ребенку по наследству по отцовской линии.

Для уточнения происхождения ВГЧ-6А, обнаруженного в половых клетках отца, был проведен филогенетический анализ на основе последовательности гена gB, кодирующего один из гликопротеинов оболочки вируса. Установлено, что исследуемый ВГЧ-6А находится в близком родстве с двумя собранными последовательностями хиВГЧ-6А, выделенного группой исследователей [37] в Москве в 2017 г. (GenBank ID: MK630134, MK630133). Полученные данные подтвердили родство исследованного нами вируса с другими хиВГЧ-6А, включенными в базу данных GenBank.

ВЫВОДЫ

Актуальным направлением дальнейших исследований может стать определение точного расположения хиВГЧ6А в локусе хромосомы методом FISH для исключения возможного развития соматических патологий, вызванных нарушением структуры хромосомы при встраивании в нее ВГЧ-6А, с течением времени, а также для установления закономерности встраивания в зависимости от географического местоположения выявляемых случаев. Дальнейшие исследования также позволят принять или опровергнуть выдвинутую ранее гипотезу соответствия последовательности вирусного генома месту встраивания в хромосому человека, что поможет избежать использования дорогостоящего и трудозатратного метода FISH и адаптировать исследования для клинической практики.