Klebsiella pneumoniae — грамотрицательная палочковидная бактерия, принадлежащая к семейству Enterobacteriaceae. Клебсиеллы становятся причиной многих инфекционных заболеваний человека. Наиболее известна пневмония (воспаление легких), однако K. pneumoniae также может вызывать инфекции мочевыводящей системы, крови, ран, а также сепсис [1]. Терапия антибиотиками остается основным методом профилактики и лечения инфекций, вызванных K. pneumoniae, хотя доля штаммов с множественной лекарственной устойчивостью может достигать 20–30% [2, 3]. Смертность от инфекции K. pneumoniae достигает 38%, а количество смертей, ассоциированных с устойчивостью к антибиотикам, составляет 650 тысяч человек ежегодно [4, 5].

Терапия бактериофагами считается простой, безопасной и высокоэффективной альтернативой антибиотикам [6]. Бактериофаги — самая многочисленная и распространенная группа вирусов; они использовались в качестве противомикробных препаратов с момента их открытия в начале XX в. Сегодня в персонализированной терапии успешно используют монофаги или коктейли из нескольких литических фагов [7–9]. Однако эффективность коммерческих фаговых коктейлей широкого спектра действия остается ограниченной [10].

Эффективность бактериофагов K. pneumoniae во многом определяется типом капсульного полисахарида бактерии хозяина [11]. Полисахаридная капсула K. pneumoniae — ключевой фактор вирулентности, обеспечивающий защиту бактерии от факторов внешней среды, в том числе иммунитета хозяина [12]. В настоящее время классическим серологическим методом и методом секвенирования отдельных генов генного кластера cps выделяют более 100 различных типов полисахаридных капсул, часть из которых (КL1, КL2, КL8, КL20, КL39, КL41, КL47, КL53, КL57, КL64, КL102 и КL107) ассоциирована с повышенной вирулентностью или устойчивостью к антибиотикам [13–17].

Бактериофаги K. pneumoniae адсорбируются на поверхность бактерии, растворяя полисахаридную капсулу специализированными ферментами — полисахариддеполимеразами, локализованными, как правило, на фаговых фибриллах и шипах. Полисахарид-деполимеразы обладают ферментативной активностью в отношении конкретной связи между моносахарами в мономере полисахарида [11].

Цель исследования заключалась в выделении и описании вирулентных бактериофагов, способных лизировать штаммы K. pneumoniae клинически значимых капсульных типов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Штаммы бактерий и их характеристика

Коллекция (N = 279) клинических изолятов K. pneumoniae была собрана в течение 2018–2022 гг.: 79 штаммов были получены из НИИ ДОГиТ имени Р. М. Горбачевой (СанктПетербург, Россия), 66 — из ГБУЗ «НИИ СП имени Н. В. Склифосовского ДЗМ» (Москва, Россия), 64 — из коллекции ФГБУ ДНКЦИБ ФМБА России (СанктПетербург, Россия), 58 — из Клинической больницы № 123 ФГБУ ФНКЦ ФХМ имени Ю. М. Лопухина ФМБА России (Одинцово, Россия), 12 изолятов были любезно предоставлены ФГБОУ ВО «ГКПМ-Оболенск» (Оболенск, Россия).

Для выращивания штаммов бактерий использовали лизогенный бульон (LB) (Himedia; Индия) при 37 °C. Видовую идентификацию бактерий проводили с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF [18]. Принадлежность штаммов K. pneumoniae к конкретному капсульному типу определяли путем секвенирования гена wzi [19].

Выделение и очистка бактериофагов

В качестве источников бактериофагов использовали сточные воды стационаров, откуда были высеяны штаммы K. pneumoniae, а также воды рек Лихоборка (г. Москва) и Клязьма (г. Королев).

Для устранения бактериальной составляющей пробу сточной или речной воды центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин, супернатант фильтровали с помощью фильтров 0,22 мкм (Merk Millipore; США). Равные количества (15 мл) фильтрованной воды и бульона LB двойной концентрации объединяли и инокулировали 20 мкл ночной культуры потенциального бактериального штаммахозяина. Эту смесь затем оставляли инкубироваться на шейкере при 37 °C в течение ночи. Полученную суспензию стерилизовали через фильтр с размером пор 0,22 мкм, а наличие бактериофагов в отфильтрованной жидкости подтверждали с помощью спот-тестирования [20]. Выделение и накопление чистой культуры бактериофага осуществляли путем трехкратного проведения через единичную негативную колонию.

В работе также использовали бактериофаг NER40, выделенный из воды реки Чермянка (г. Москва) и описанный в предыдущей работе [21].

Определение спектра литической активности

Спектр литической активности бактериофагов оценивали методом спот-тестирования [20]. Для этого 100 мкл культуры каждого штамма K. pneumoniae на логарифмической фазе роста (OD₆₀₀ = 0,3) смешивали с 5 мл незастывшего полужидкого агара LB (0,7% агара) и распределяли по чашкам Петри с тонким слоем агара LB (1,5% агара). Тестирование включало нанесение 5 мкл лизатов монофагов с титром 10⁶ БОЕ/мл на поверхность свежезасеянных газонов тестируемых штаммов K. pneumoniae. Затем чашки Петри инкубировали при 37°C в течение ночи. Литическую активность бактериофагов определяли по наличию зоны непрерывного лизиса бактериальных клеток, соответствующей форме исходной капли. Наличие полупрозрачной области вокруг зоны лизиса трактовали как полисахарид-деполимеразную активность.

Полногеномное секвенирование бактериофагов и биоинформатический анализ данных

Геномную ДНК фагов экстрагировали согласно протоколу фенол-хлороформной экстракции [22]. Секвенирование осуществляли с использованием инструмента MiSeq (Illumina; США) и реагентов для секвенирования MiSeq Reagent Nano Kit v2 (500 cycle) (Illumina; США) в соответствии с рекомендациями производителя. Сборку генома проводили с помощью программы SPAdes (версия 3.14.0). Для идентификации открытых рамок считывания (ОРС) внутри генома использовали веб-сервис GeneMarkS (версия 4.32). Исследование генов тРНК проводили с использованием ARAGORN (версия 1.2.41).

Гены были предсказаны и аннотированы вручную с использованием BLASTp, HHPred и InterPro. Для подтверждения отсутствия генов токсинов и детерминант устойчивости к антибиотикам проводили сравнение с базами данных, содержащими факторы вирулентности патогенных бактерий [23] и гены устойчивости к антибиотикам [24]. Аннотированные последовательности геномов бактериофагов были депонированы в базу GenBank.

Для филогенетического анализа использовали 40 эталонных геномов бактериофагов, предложенных Международным комитетом по таксономии вирусов (ICTV, от англ. International Committee on Taxonomy of Viruses). Филогенетические деревья были построены на основании полных геномов бактериофагов с использованием инструментов VICTOR [25]. Определение ближайших гомологов среди бактериофагов проводили с помощью алгоритма BLASTn. Сравнительный анализ отдельных белковых последовательностей осуществляли с помощью сервиса BLASTp. Сравнительный анализ полных геномов проводили с помощью инструментов Circoletto [26].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика штаммов K. pneumoniae

Для всех 279 штаммов коллекции была определена нуклеотидная последовательность гена wzi. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных института Пастера позволил определить аллели, соответствующие отдельным капсульным типам. Всего было найдено 40 уникальных аллельных вариантов гена wzi, 37 из которых были ассоциированы с конкретными капсульными типами, для трех вариантов (wzi 475, wzi 493 и wzi 163) ассоциации с известными капсульными типами найдено не было. Коллекция включала 29 различных капсульных типов, семь из которых составляли 70% всех изолятов: KL2 (19%), KL23 (12%), KL20 (9%), KL39 (9%), KL64 (8%), KL102 (8%) и KL107 (6%) (рис. 1). Другим капсульным типам, часто ассоциированным с высокой вирулентностью, соответствовали доли менее 5%: KL1 — 3%, KL41 — 1%, KL47 — 3%, KL57 — 3%.

Выделение, фенотипическая характеристика и спектр литической активности бактериофагов

Из трех образцов сточных вод и двух образцов речной воды было выделено восемь бактериофагов (VKV295, SAA231, NKA196, NNA-G4, VSG32, Rappa3, PEA128 и ChM-G5), лизирующих штаммы K. pneumoniae восьми клинически значимых капсульных типов (KL1, KL2, KL39, KL41, KL47, KL57, KL64 и KL102). Штаммы данных капсульных типов занимали в общей коллекции 53,05%.

Большинство бактериофагов формировали небольшие круглые прозрачные (1–2 мм) бляшки, окруженные ореолом в 1–2 мм. Отдельные бактериофаги (VKV295 и Rappa3) формировали круглые прозрачные бляшки большего размера (2–4 мм), также окруженные ореолом (рис. 2, табл. 1).

Бактериофаги показали высокую специфичность спектра литической активности — каждый из выделенных фагов был способен лизировать только штаммы с тем же капсульным типом, что и штамм, на котором бактериофаг был выделен. Все исследуемые бактериофаги лизировали от 52,8 до 100% штаммов конкретных капсульных типов (табл. 1). Для сравнения в исследование также был включен ранее описанный бактериофаг NER40, специфично лизирующий штаммы с капсульным типом KL2 [21].

Полногеномное секвенирование бактериофагов и филогенетический анализ

Полные геномы фагов были собраны и депонированы в базу данных NCBI GenBank (табл. 2). Длина геномов варьировала от 39 058 до 44 575 п. н. с долей Г + Ц 50,4–54,3%.

Все фаговые геномы имели терминальные повторы с обоих концов длиной 167–282 п.н. В составе фаговых геномов не было обнаружено генов тРНК, а количество предсказанных открытых рамок считывания (ОРС) для различных бактериофагов находилось в диапазоне от 42 до 53 (табл. 2).

В результате филогенетического анализа было установлено, что все исследуемые бактериофаги относятся к трем родам семейства Autographiviridae (рис. 3). Фаги VKV295, SAA231, NKA196 и NNA-G4 относились к роду Drulisvirus, Rappa3 и PEA128 — к роду Przondovirus, а VSG32 и ChM-G5 — к роду Teetrevirus. По результатам анализа BLASTn, ближайшими гомологами фагов Drulisvirus были KpV2883 (GenBank MT682065.1; 90,53% идентичности) для фага VKV295, vB_KpnP_KpV74 (GenBank NC_047811.1; 88,12% идентичности) — для фага SAA231 и KPPK108.1 (GenBank OK583892.1; 90,56% и 85,03% идентичности) — для NNA-G4 и NKA196. Ближайшими гомологами фагов Rappa3 и PEA128 были фаги рода Przondovirus K5-2 (GenBank NC_047798.1; 81,32% идентичности) и 066037 (GenBank MW042800.1; 86,27% идентичности) соответственно. Гомологами фагов Teetrevirus VSG32 и ChM-G5 были Salmonella phage phiSG-JL2 (GenBank NC_010807.1; 84,00% идентичности) и Klebsiella phage 6998 (GenBank OL362282.1; 90,13% идентичности) соответственно (табл. 2).  

Функциональная аннотация и сравнительный анализ геномов

Все исследуемые бактериофаги относились к семейству Autographiviridae и, как следствие, имели схожее строение генома: все гены располагались на лидирующей цепи ДНК, фаги кодировали как ДНК- так и РНК-полимеразу, а гены метаболизма нуклеиновых кислот и гены структурных белков располагались кластерами в левой и правой части генома соответственно. Представители данного семейства относятся к вирулентным фагам и не несут гены интеграз. Среди аннотированных генов исследуемых бактериофагов не содержалось генов интеграз, детерминант устойчивости к антибиотикам, токсинов или других известных потенциально неблагоприятных для целей терапии генов.

Геномы фагов рода Drulisvirus несли 51–53 ОРС, 22–24 из которых были аннотированы как гены гипотетических белков, 12–14 — гены метаболизма нуклеиновых кислот, 12–13 — гены, кодирующие белки капсида, а также 3 гена лизиса клетки-хозяина, представленных идущими друг за другом генами спанина, холина и эндолизина.

Каждый из четырех фагов рода Drulisvirus нес по два гена, кодирующих белки фаговых фибрилл, однако только у VKV295 оба гена кодировали домены полисахариддеполимераз, у трех других фагов деполимеразный домен присутствовал только на одной из двух фибрилл. Гены фибрилл фага VKV295 (orf0043 и orf0051) несли домены гликозил-гидролазы 28 семейства и К1 лиазы и были на 82,53 и 99,75% идентичны фибриллам ближайшего по BLASTn фага KpV2883. В свою очередь, гены фибрилл бактериофага SAA231 на 96,18 и 97,57% были идентичны ближайшему фагу-гомологу vB_KpnP_KpV74; ген первой фибриллы (orf0044) не нес деполимеразного домена, а второй (orf0052) кодировал домен гликозилгидролазы 28 семейства. Данная деполимераза (SAA231_ orf0052) была на 98,1% гомологична ранее описанной фибрилле orf0053 фага NER40. Бактериофаг NNA-G4 нес два гена фибрилл, только один из которых (orf0052) кодировал деполимеразу с доменом пектатлиазы 3 и был на 95,65% идентичен гену фибриллы фага VLC5 (GenBank MT197175.1; 74,97% идентичности). Аналогично NNA-G4, у фага NKA196 деполимеразный домен гликозилгидролазы 28 семейства несла только вторая фибрилла (orf0052), на 99,13% идентичная фибрилле фага KPPK108.2 (GenBank OK583892.1; 85,03 % идентичности).

Род Przondovirus был представлен двумя фагами, геномы которых несли 42–47 ОРС. В результате аннотации удалось предсказать функции 71,2–73,8% предполагаемых белков. Было аннотировано 15–16 генов метаболизма нуклеиновых кислот, 14–15 структурных генов, а также два гена лизиса бактерии хозяина, представленных холином II класса и Rz-подобным спанином.

Бактериофаг Rappa3 нес две фибриллы (orf0037 и orf0038), содержащие деполимеразные домены, представленные пектатлиазами 3. Первая фибрилла была на 29,28% идентична фибрилле фага К11 (GenBank NC_011043.1; 81,01% идентичности), а вторая — на 71,38% идентична фибрилле фага vB_KpnP_KpV767 (GenBank NC_047772.1; 78,09% идентичности). Единственная фибрилла фага PEA128 была на 99,72% идентична фибрилле фага TUN1 (GenBank HG994092.1; 84,11% идентичности) и несла домен гликозил-гидролазы 28 семейства.

Бактериофаги VSG32 и ChM-G5 рода Teetrevirus имели 48 и 46 ОРС соответственно, из которых функции удалось предсказать для 83,33 и 78,26% ОРС: 21 и 19 ОРС кодировали гены метаболизма нуклеиновых кислот, 17 и 15 — структурные гены. Гены лизиса хозяина были организованы аналогично фагам рода Przondovirus и представлены двумя ОРС, кодирующими холин и Rzподобный спанин.

Каждый из выделенных фагов нес по одному гену фибрилл, кодирующему рецептор-связывающий белок. Деполимераза фага ChM-G5 была представлена фибриллой orf0040, на 90,41% идентичной фибрилле фага 6998 (GenBank OL362282.1; 90,13% идентичности) и несущей домен пектатлиазы 3. Бактериофаг VSG32 кодировал фибриллу orf0042, идентичную фибрилле фага KPP-5 на 94,97% (GenBank MW600722.1; 87,70% идентичности) и несущую домен адгезии неопределенной природы.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Штаммы K. pneumoniae, взятые в качестве штаммов хозяев, имели капсульные типы, ассоциированные с нозокомиальными инфекциями, вызывающими трудности в терапевтической практике из-за наличия детерминант устойчивости к антибиотикам [3, 16, 27]. Данные штаммы имеют широкое распространение на территории России и граничащих с ней стран и зачастую несут гены устойчивости к карбапенемам и бета-лактамным антибиотикам расширенного спектра, а также гены гипервирулентности [16, 27]. В собранной коллекции штаммы с капсульными типами KL1, KL2, KL39, KL41, KL47, KL57, KL64 и KL102 занимают 53,05%, что говорит о высокой актуальности выделения терапевтических бактериофагов против них.

Новые бактериофаги были выделены из образцов сточных вод тех же стационаров, где были изолированы штаммы коллекции, а также из вод рек, протекающих в черте города Москва. Все выделенные бактериофаги образовывали характерный полупрозрачный ореол вокруг единичных негативных колоний, что представляет собой характерный признак наличия рецептор-связывающих белков, представленных полисахарид-деполимеразами. Это также подтверждается узким спектром хозяев фагов, ограниченным штаммами K. pneumoniae конкретных капсульных типов. Бактериофаги, специфичные штаммам K. pneumoniae с капсульными типами KL1, KL2, KL47, KL57, KL64 и KL102, уже были ранее описаны в литературе среди представителей различных таксонов. Однако на сегодняшний день описан только один фаг, специфичный штаммам K. pneumoniae с капсульным типом KL39, и ни одного, специфично лизирующего штаммы K. pneumoniae с капсульным типом KL41 [28].

Анализ геномов выделенных бактериофагов показал, что все фаги относятся к семейству Autographiviridae и более чем на 5% отличаются от ближайших фагов, представленных в базе данных NCBI, что позволяет нам назвать выделенные бактериофаги новыми видами внутри своих родов [29]. Несмотря на достаточные для выделения нового вида различия полных геномов, гены фибрилл, отвечающие за адсорбцию фага на поверхность бактерии и во многом определяющие спектр хозяев, имели более высокую гомологию с уже известными фибриллами бактериофагов. Так, например, фибриллы фагов VKV295, SAA231, NKA196 и PEA128 оказались на 82,53–99,75% гомологичны фибриллам уже охарактеризованных бактериофагов KpV2883, vB_KpnP_KpV74, KPPK108.2 и TUN1. Напротив, фибриллы фагов NNA-G4, ChM-G5, VSG32 и Rappa3 либо были гомологичны бактериофагам с неописанной хозяйской специфичностью, либо имели слабую (< 75%) гомологию с ближайшими по BLASTp фибриллами известных фагов.

Интересным является тот факт, что в нашей коллекции находится ранее описанный бактериофаг NER40 (GenBank MZ602146.1) рода Drulisvirus, специфичный штаммам K. pneumoniae с капсульным типом KL2 [21]. Существенным отличием двух бактериофагов было то, что, специфично лизируя штаммы K. pneumoniae с капсульным типом KL2, бактериофаг NER40 показывал более высокую эффективность 49/53 (90,57%) против 28/53 (52,8%) для SAA231. Основные различия между геномами фагов NER40 и SAA231 находятся в координатах 6,5–17,5 т.п.н., где локализованы гены, отвечающие за жизненный цикл, тогда как гены адсорбционного аппарата показали свою высокую (98,1%) гомологию (рис. 4). Учитывая вышесказанное, такие значительные различия в спектре хозяев могут быть связаны с разницей в успешности обхода бактериальных антифаговых защитных систем, таких как система рестрикции-модификации или CRISPR. Можно предположить, что гены, обеспечивающие успешное их преодоление, находятся именно в данной области фагового генома (6,5–17,5 т.п.н.) и определяют различие в потенциале терапевтической эффективности.

Важно отметить, что в геномах выделенных бактериофагов не было найдено потенциально нежелательных детерминант, что, наравне с их филогенетическим положением, характеризует их как строго вирулентные бактериофаги, пригодные для применения в антибактериальной терапии. В свою очередь, высокая литическая активность фагов и наличие в качестве рецептор-связывающих белков полисахарид-деполимераз открывают возможность использования не только непосредственно бактериофагов, но и их производных для нужд терапии.

ВЫВОДЫ

Были выделены и охарактеризованы бактериофаги, обладающие специфической литической активностью в отношении клинически значимых штаммов K. pneumoniae отдельных капсульных типов: VKV295 против KL1, SAA231 — KL2, NNK-G4 — KL39, VSG32 — KL41, NKA196 — KL47, Rappa3 — KL57, PEA128 — KL64, ChM-G5 — KL102. Геномы фагов были проверены на отсутствие потенциально опасных для терапии генов (интеграз, токсинов, факторов устойчивости к антибиотикам), что говорит о потенциале данных фагов для терапевтического применения.